практикум по биохимии. Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,
 Скачать 1.79 Mb.
|
|
3. Приготовление некоторых реактивов Активирующий раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 155 мг восстановленного глутатиона и 400 мг кристаллического альбумина, растворяют их в 50 мл дистиллированной воды и с помощью 1 М раствора NaOH доводят рН до 8,2. Затем доливают до метки воду. Аммиачный раствор нитрата серебра. К 2-3%-ному раствору серебра добавляют концентрированный раствор аммиака до растворения осадка. Ацетатный буферный раствор рН 3,6. Готовят смешивая 463 мл раствора А и 37 мл раствора Б, доводят до метки водой в мерной колбе до 1 л. Раствор А: 11,55 мл ледяной уксусной кислоты разводят водой в мерной колбе на 1 л. Раствор Б: 27,2 г ацетата натрия растворяют в воде в колбе на 1 л. Биуретовый реактив (реактив Бенедикта). 173 г цитрата натрия и 100 г карбоната натрия растворяют в 300 мл дистиллированной воды на водяной бане. Отдельно в 300 мл воды растворяют 17,3 г сульфата меди. Оба раствора сливают и доводят общий объем до 1 л. Буферный раствор. 2,76 г веронала и 2,06 г мединала растворяют в 1 л дистиллированной воды. Хранят в холодильнике, при появлении осадка раствор не пригоден к употреблению. Взвесь угля. 0,25 г активированного угля помещают в мерную колбу на 100 мл и разбавляют ацетатным буфером рН 3,6. Перед употреблением тщательно встряхивать. Восстанавливающий реактив. 1%-ный раствор аскорбиновой кислоты, приготовленный на 0,016%-ном растворе сульфата меди. Гемоглобин, 4%-ный раствор на ацетатном буфере (рН 4,0). Сначала готовят 8%-ный раствор гемоглобина на 8 моль/л растворе мочевины, выдерживают его 2 ч в термостате при 60˚С и перед употреблением разводят ацетатным буфером в 2 раза. Глицил-глицин. 0,55 ммоль/л, рН – 8,3. 3,63 г глицил-глицина помещают в мерную колбу на 50 мл, доливают водой до метки (буферный раствор). Денатурирующий раствор. Растворить 1 ампулу ацетонциангидрина (0,5 мл – 0,47 г из набора по определению гемоглобина в крови) в 1 л дистиллированной воды. Диазореактив для определения билирубина. Готовят два раствора. Первый раствор: 3 г сульфаниловой кислоты растворяют в 500 мл дистиллированной воды, добавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты (на горячей бане), доводят объем водой до 1 л. Второй раствор: 0,5%-ный водный раствор нитрита натрия. Перед употреблением смешивают 5 мл первого раствора и 0,25 мл второго. Диацетил, рабочий раствор. 1 мл диацетила разводят дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл (раствор хранят в холодильнике). Рабочий раствор диацетила готовят перед употреблением, добавляя в 1 мл основного раствора диацетила 24 мл дистиллированной воды. Дифениламиновый реактив. 1 г дифениламина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты. К раствору прибавляют 2,75 мл концентрированной серной кислоты. Калибровочный раствор. Основной – 0,75 ммоль/л АЛК (100 мкг/мл) в пересчете на основание: 0,00635 г АЛК гидрохлорида растворяют в ацетатном буфере рН 3,6 в мерной колбе на 50 мл. Хранят в холодильнике не более месяца. Из основного готовится рабочий калибровочный раствор, 1 мкг/мл. Готовят перед употреблением разведением основного раствора ацетатным буфером в 100 раз. Калибровочный раствор. 22,5 мг диоксиацетона при нагревании растворяют в 25 мл воды. 1 мл такого раствора содержит 10 мкмолей диоксиацетона. В ряд пробирок (см. работу) разливают калибровочный раствор диоксиацетона, доливают до нужного объема и далее проводят реакцию также, как и при определении активности фермента. Калибровочный (стандартный) раствор железа (30 мкмоль/л). Сначала готовят соли Мора. содержащий 3 ммоль/л, растворяя 1,178 г в 5 мл 0,3 н. соляной кислоты, после чего доводят до 1 л водой (подкисленной 1 мл концентрированной серной кислоты). Рабочий стандартный раствор железа получают из основного путем разведения подкисленной водой в 100 раз. Полученный раствор содержит 30 мкмоль/л или 1,67 мкг/мл железа. Кофеиновый реактив. 1 г чистого кофеина, 7,5 г бензоата натрия, 12,5 г ацетата натрия растворяют в 90 мл дистиллированной воды, нагревают до 50-60˚С, перемешивают, охлаждают и доводят до 100 мл дистиллированной водой. Молибдат аммония в азотной кислоте. 7,5 г молибдата аммония растворяют в 100 мл воды и прибавляют 100 мл 32%-ной азотной кислоты. Моча при алкаптонурии. При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют гидрохинон из расчета 20 г/л. Моча при гипераминоацидурии. При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют глицин из расчета 1,0 г/л. Моча при мукополисахаридозе. При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют хонсурид или гепарин из расчета 0,05-0,1 г/л. Моча при пентозурии. При отсутствии патологической в мочу добавляют ксилулозу или рибозу из расчета 1,0 г/л. Моча при тирозинозе. При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют тирозин из расчета 0,4-0,5 г/л. Моча при фруктозурии. При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют фруктозу из расчета 0,3-0,4 г/л. Моча при цистинурии. При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют цистин из расчета 0,4-0,5 г/л. Натрия ацетат 3-водный, насыщенный раствор. 375 г ацетата натрия 3-водного (или 226 г безводной соли) растворяют в 250 мл теплой воды, охлаждают до комнатной температуры. Хранят при комнатной температуре. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным. Натрий фосфат двузамещенный 0,25 моль/л. Готовят, растворяя 9,7 г Na2HPO4∙12H2O или 18 г Na2HPO4∙12H2O в воде в колбе на 200 мл. При добавлении 2 мл этого раствора к 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты рН должен быть в пределах 5,0-6,0. Основной калибровочный раствор креатинина, 10 ммоль/л. 113,1 мг креатинина доводят до 100 мл 0,1 моль/л раствором соляной кислоты. При построении калибровочного графика из основного раствора готовят рабочий раствор путем разведения основного раствора водой в 100 раз, 1 мл раствора содержит 0,1 ммоль креатинина. Исходя из этого получают ряд пробирок с соответствующими концентрациями креатина. Окислительная смесь для определения тиамина. К 8 мл 1%-ного гексацианоферрата (III) калия приливают 20 мл 30%-ного раствора NaOH, тщательно перемешивают. Готовят перед употреблением. Орциновый реактив. К 1 г орцина прилить 500 мл 30%-ной соляной кислоты (плотностью 1,15 г/см3). Перемешать до растворения и добавить 4-5 мл 10%-ного раствора хлорида железа (III) FeCl3. Реактив хранят в плотно закупоренной темной склянке. Основной калибровочный раствор п-нитроанилина. 0,0829 г п-нитро анилина помещают в мерную колбу на 100 мл, доводят до метки водой и растворяют. Осаждающий раствор. Растворить 561 г сульфата аммония в 1 л дистиллированной воды и через сутки профильтровать. Основной фосфатный буферный раствор и его рабочие растворы № 1-4. Растворяют 33,5 г NaOH в 400 мл воды в мерной колбе вместимостью 500 мл и добавляют 226,8 г KH2PO4, встряхивают до полного растворения, охлаждают и доливают водой до метки. Для приготовления рабочих растворов основного фосфатного буфера в мерные колбы вместимостью 100 мл отмеривают следующие объемы основного фосфатного буфера (в мл): № 1 – 92,51; № 2 – 74,91; № 3 – 59,18 и № 4 – 48,68, после чего доводят их содержимое водой до метки. Пикриновая кислота, насыщенный раствор. Товарная пикриновая кислота содержит 15-20% влажности, кислоту не сушить. Взрывоопасно! В 100 мл воды растворяют 2 г пикриновой кислоты при нагревании в горячей бане. После этого раствор оставляют стоять на 24 часа, периодически перемешивая. Затем раствор фильтруют. Раствор стабилен и хранится в посуде из темного стекла. Пирофосфатный буфер 0,05 М с рН 8,2. Переносят 4,46 г пирофосфата натрия в мерную колбу вместимостью 200 мл, растворяют его примерно в 100 мл воды, доводят рН с помощью 0,1 М раствора HCl до 8,2 и доливают дистиллированной водой до метки. Пирофосфатный буфер 0,1 М с рН 8,5. Переносят 4,46 г пирофосфата натрия в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют его в 50 мл воды, доводят рН с помощью 0,1 М раствора HCl до 8,5 и доливают дистиллированной водой до метки. Рабочий реактив. Готовят в день определения, смешивая 30 частей 0,3 н гидроксида натрия. 2 части 0,5% раствора фенолфталеина и 1 часть 0,12% раствора сульфата меди. Раствор ацетонциангидрина. Растворить 1 ампулу ацетонциангидрина (0,5 мл – 0,47 г из набора по определению гемоглобина в крови) в 1 л дистиллированной воды. Раствор ферриацетонциангидрина. Растворить в 1 л дистиллированной воды 200 мг железосинеродистого калия и 1 ампулу (0,5 мл – 0,47 г) ацетонциангидрина: возможно использование из набора реактивов для приготовления трансформирующего раствора по определению гемоглобина крови. Устойчив в течение нескольких месяцев при хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре. Раствор глюоксидазы. Содержит около 300 ед. в 1 мг. Готовят, растворяя соответствующее количество сухого препарата в 10 мл воды. Раствор сульфонированного бато-фенантролина. В пробирке к 100 мг бато-фенантролина приливают 0,5 мл хлорсульфоновой кислоты, нагревают на кипящей водяной бане 30 с, охлаждают и медленно приливают 10 мл бидистиллированной воды, вновь нагревают на водяной бане в течение 5 мин. Смесь переносят в колбу на 200 мл, добавляют 100 мл воды, рН раствора доводят до 4-5 н NaOH и добавляют водой до объема 200 мл. Раствор иода в иодиде калия (раствор Люголя). В 100 мл дистиллированной воды растворяют 20 г иодида калия и 10 г иода. Перед употреблением раствор разводят в 5 раз. Раствор п-нитрозодиметиланилина (НДМА). Имеющийся в продаже препарат НДМА перекристаллизовывают из этилового эфира. Для измерения алкогольдегидрогеназы 1 мг НДМА растворяют в 100 мл 0,1 М пирофосфатного буфера (рН 8,5). Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр и разводят фильтрат в 2 раза тем буфером. Хранят при 4˚С в течение двух месяцев. Реактив Илька. К 5 частям (по объему) уксусного ангидрида добавляют 1 часть ледяной уксусной кислоты, затем постепенно вливают 1 часть концентрированной серной кислоты. Хранить реактив на холоду! Реактив Миллона. (Готовят под тягой!) В 57 мл концентрированной азотной кислоты растворяют 40 г ртути сначала на холоду, а затем нагревая на водяной бане. Полученный раствор разбавляют 2 объемами воды, дают отстояться и сливают с осадка. Хранят во флаконе из темного стекла. Реактив молибдата аммония. 2,5 г молибдата аммония растворяют в 60 мл дистиллированной воды, фильтруют. Раствор вносят в колбу вместимостью 100 мл. В другой колбе к 25 мл дистиллированной воды приливают 7,5 мл концентрированной серной кислоты. Второй раствор приливают к первому, охлаждают и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор пригоден в течение месяца. Реактив «НАДИ». 1%-ный раствор диметил-п-фенилендиамина смешивают с равным объемом 1%-ного раствора α-нафтола в спирте и 1,5%-ного раствора карбоната натрия. Раствор окрашен в темно-коричневый цвет и не должен иметь розового оттенка. Готовят за 1 ч до занятия. Реактив Наша. В колбу вместимостью 100 мл вносят 15,4 г ацетата аммония, 0,3 г ледяной уксусной кислоты и 0,2 г ацетилацетона, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки. Реактив Несслера. В мерной колбе вместимостью 500 мл смешивают 150 г иодида калия, 110 г иода, 100 мл дистиллированной воды и около 140-150 г металлической ртути и сильно встряхивают в течение 15 мин. При этом раствор самопроизвольно разогревается, и окраска, обусловленная растворенным иодом, постепенно бледнеет. Затем смесь начинают охлаждать под струей воды до сохранения отчетливой красной окраски, после чего содержимое встряхивают до перехода красной окраски в зеленоватую. После декантации осадок ртути тщательно промывают водой. Объединяют раствор и промывные воды, разбавляют их водой до 2 л. Отбирают 75 мл полученного раствора в мерную колбу вместимостью 0,5 л, содержащую 75 мл воды и 350 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия и доводят водой до метки. Реактив Фелинга. Готовят отдельно два раствора. Раствор 1: в мерной колбе вместимостью 1 л растворяют 200 г сегнетовой соли и 150 г NaOH и доводят водой до метки. Раствор 2: в мерной колбе вместимостью 1 л растворяют в воде 40 г сульфата меди (II) и доводят водой до метки. Перед употреблением смешивают равные объемы этих растворов. Реактив Фолина. В колбе вместимостью 1 л растворяют 1 г вольфрамата натрия и 20 г фосфорномолибденовой кислоты в 750 мл воды. Закрывают колбу пробкой с обратным холодильником и, включив ток воды в холодильнике, содержимое кипятят 10 ч; затем его охлаждают, переливают в мерную колбу и доводят водный объем реактива до 1 л. Реактив Эрлиха. 0,7 г п-диметиламинобензальдегида растворяют в 150 мл концентрированной соляной кислоты, приливают к 100 мл воды и смешивают. Раствор должен быть бесцветным или слегка желтым. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стабилен. Реактив Эрлиха. 1 г п-диметиламинобензальдегида растворяют в мерной колбе на 50 мл в 35 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют 8 мл 57%-ной хлорной кислоты и доводят до метки ледяной уксусной кислотой. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике не более недели. Спиртовой раствор тимола (10%). 10 г очищенного тимола растворяют в 100 мл 96˚ этилового спирта. Получение очищенного тимола проводят следующим образом. 100 г тимола растворяют в 100 мл 96˚ этилового спирта, фильтруют. К фильтрату добавляют 1 л холодной дистиллированной воды, сильно встряхивают и оставляют стоять на 20 мин. Фильтруют и кристаллы, оставшиеся на фильтре, промывают два раза холодной дистиллированной водой. Сушат вначале на фильтровальной бумаге, потом в течение 2-3 дней в эксикаторе над безводным хлористым кальцием до постоянного веса. Стандартный раствор. Приготовление стандартного раствора проводится смешением двух растворов: 1) 0,0962 н раствор хлористого бария: 1,175 г кристаллического BaCl2∙2H2O растворяют в 100 мл воды в мерной колбе. 2) 0,2 н раствор серной кислоты. Далее получают суспензию сульфата бария: 3 мл 0,0962 н раствора хлористого бария вливают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем 0,2 н раствором серной кислоты при температуре +10˚С (при этой температуре размеры частиц преципитированного сульфата бария дают относительно стабильный результат). Субстратно-буферный раствор: в пробирку наливают 10 мл воды и добавляют 0,028 г L-глутамил-п-нитроанилина и 0,082 г хлорида натрия и, не переставая перемешивать, растворяют содержимое пробирки на кипящей водяной бане в течение 60 сек. Затем раствор охлаждают до 37˚С и добавляют 2,5 мл буферного раствора. Приготовленный раствор субстрата во время работы хранят в водяной бане при 37˚С. Неиспользованный раствор субстрата можно хранить в холодильнике в течение недели. Субстрат плохо растворим и при комнатной температуре выпадает в осадок. Поэтому перед употреблением выкристаллизовавшийся субстрат растворяют нагреванием в кипящей водяной бане. Нагревание и растворение субстрата можно повторять не более двух раз. Субстратный раствор для определения АлАТ (раствор № 1). Навески 29,2 мг α-кетоглутаровой кислоты и 1,78 г аланина (0,89 г α-аланина) взвешивают на аналитических весах и растворяют в 1 М растворе гидроксида натрия до полного растворения осадка (рН 7,4). Раствор переливают в колбу вместимостью 100 мл и доводят объем до метки 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,4). Добавляют 1 каплю хлороформа. Раствор хранят в холодильнике в замороженном состоянии. Субстратный раствор для определения АсАТ (раствор № 2). Навески 29,2 мг α-кетоглутаровой кислоты и 2,66 г α-аспарагиновой кислоты (1,33 г α-аспарагиновой кислоты) взвешивают на аналитических весах. Далее раствор готовят так же, как раствор № 1. Субстратный раствор для определения глюкозофосфатизомеразы. Готовят мединалово-ацетатный буферный раствор с рН 7,4 (9,714 г ацетата натрия и 14,714 г мединала растворяют в воде и доводят объем до 500 мл). Смешивают 8,33 мл 0,03 М раствора двунатриевой соли глюкозо-6-фосфата с 25 мл мединалово-ацетатного буфера; добавляют к смеси 25 мл 0,1 М раствора соляной кислоты и доводят водой до 100 мл. Хранят на холоду. Субстратный раствор для определения лактатдегидрогеназы. Смешивают по 1 мл 1 М раствора лактата натрия, 9 М раствора NаCl, 0,05 M Cl2, раствора НАД концентрации 10 г/л. Добавляют к содержимому по 2,5 мл 0,5 М раствора фосфатного буфера (рН 7,4) и 1 г/л раствора нитротетразолиевого синего. Перед употреблением к смеси прибавляют 0,25 мл раствора фенанзинметасульфата концентрации 1 г/л. Субстратный раствор для определения фруктозобисфосфатальдолазы. 270 мг бариевой соли фруктозобисфосфата растворяют в 3,5 мл 1 М раствора соляной кислоты. Добавляют 1 мл 14%-ного раствора сульфата натрия, а выпавший при этом осадок удаляют центрифугированием. К надосадочной жидкости добавляют 1 каплю сульфата натрия. Появление мути свидетельствует о недостаточно полном осаждении ионов бария. В этом случае добавляют еще сульфата натрия и вновь центрифугируют. Центрифугат доводят 3%-ным раствором гидроксида натрия до рН 7,4-7,6, переносят в колбу вместимостью 25 мл и объем доводят до метки. Полученный раствор смешивают с 25 мл 0,56 М раствора гидразинхлорида, 25 мл 0,002 М раствора моноиодуксусной кислоты, 100 мл 0,5%-ного раствора карбоната натрия и 25 мл дистиллированной воды. Хранят в холодильнике. Тимолово-вероналовый буфер. В мерной колбе на 100 мл смешивают 80 мл буферного раствора и 1 мл 10%-ного спиртового раствора тимола, встряхивают и доливают буферным раствором до метки. Величина рН должна составить 7,55. о-Толуидиновый реактив. 0,15 г тиомочевины растворяют в 94 мл ледяной уксусной кислоты и смешивают с 6 мл перегнанного О-толуидина. Хранят в темной склянке. Фенол, насыщенный водой. В 100 г перегнанного фенола добавляют 35 мл воды и перемешивают, слегка подогревая смесь для ускорения растворения фенола. Фенолфталин, рабочий раствор. Готовят, растворяя 75 мг вещества в 15 мл 0,1 н раствора гидроксида натрия, раствор должен быть бесцветным или слегка розоватым, окрашенные растворы для работы не пригодны. Для увеличения стойкости реактива к нему добавляют 3 мг трилона, который, связывая соли тяжелый металлов, препятствует самоокислению фенолфталеина кислородом воздуха. Фибрин. Фибрин бычьей крови отмывают от кровяных пигментов в проточной воде в течение нескольких дней до получения белого сгустка. Воду отжимают, а фибрин, залитый глицерином, хранят в плотно укупоренной банке. Перед употреблением фибрин отмывают от глицерина. Фосфорно-ванилиновый реактив. 4 части (по объему) концентрированной ортофосфорной кислоты смешивают с 1 частью 0,6%-ного водного раствора ванилина. Реактив хранят в посуде из темного стекла при комнатной температуре. Фруктозо-1,6-бисфосфат, натриевая соль. 2,0 мл 10%-ного раствора натриевой соли фруктозо-1,6-бисфосфата разводят в колбе на 25 мл водой до метки. Стабилен при условии хранения в холодильнике. Цветной реактив на мочевину. Таблетку из набора для определения мочевины, содержащую диацетилмонооксим и тиосемикарбазид, растворяют при нагревании в колбе на 50 мл. Раствор устойчив в течение трех недель. Перед употреблением смешивают равные объемы приготовленного раствора и 9,6%-ного раствора серной кислоты. Щелочной раствор β-глицерофосфата. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 1 г β-глицерофосфата натрия и 0,85 г мединала, приливают около 30 мл дистиллированной воды, растворяют и доводят водой объем до метки. В другую мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 50 мл приготовленного раствора β-глицерофосфата, 2,8 мл 0,1 М раствора гидроксида натрия и доводят дистиллированной водой до метки (рН раствора 8,6). Наслаивают на жидкость около 3 мл толуола. Хранят раствор в холодильнике не более 10 дней. ОГЛАВЛЕНИЕ
1 Здесь и далее звездочкой отмечены реактивы, приготовление которых описано в приложении. 1 Если нет в наличии продажного препарата лактатдегидрогеназы, то кристал. суспензию фермента можно получить из скелетных мышц кролика (см. Г.А.Кочетов. Пр.рук.по энзимологии.М.,Высш.шк.,1980, с.71). 1 Методика модифицирована В.И.Глобиным. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||