практикум по биохимии. Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,
 Скачать 1.79 Mb.
|
|
В выводе отметить возможность практического использования этих реакций. Работа 82. Качественные реакции на стероидные гормоны и их метаболиты Реактивы. Серная кислота, конц.; гидроксид натрия, 30%-ный раствор; реактив Фолина; м-динитробензол, 2%-ный раствор в 96%-ном этаноле. Оборудование. Глазные пипетки; штатив с пробирками; пипетка для концентрированных кислот; водяная баня. Материал. Фолликулин (эстрон), 0,1%-ный масляный раствор для инъекций в ампулах. (Для приготовления спиртового раствора содержимое 5 ампул фолликулина выливают в делительную воронку, содержащую 50 мл этанола. Воронку встряхивают и после расслоения фаз нижний, масляный слой отбрасывают, а для исследования используют верхний – спиртовой раствор). а. Реакция на фенольную группу эстрона (фолликулин) с серной кислотой. Метод основан на взаимодействии эстрона и серной кислоты с образованием соединения, имеющего соломенно-желтый цвет, переходящий при нагревании в оранжевый. Ход определения. В сухую пробирку вносят 5 капель спиртового раствора фолликулина и помещают ее на 5 мин в кипящую водяную баню (для испарения спирта). Добавляют в пробирку 1 мл концентрированной серной кислоты и ставят ее на 5-10 мин в кипящую водяную баню. Наблюдают за изменением окрашивания содержимого пробирки. б. Реакция на фенольную группу эстрона (фолликулин) с реактивом Фолина. Принцип метода см. работу 58. Ход определения. В пробирку вносят 5 капель спиртового раствора фолликулина и добавляют по 2 капли раствора гидроксида натрия и реактива Фолина. Наблюдают за появлением синего окрашивания, обусловленного наличием фенольной группы в молекуле эстрона. в. Реакция на 17-кетогруппу эстрона (фолликулин) и на 17-кетостероиды, содержащиеся в моче. Метод основан на способности 17-кетостероидов образовывать с м-динитробензолом в щелочной среде продукты конденсации вишнево-красного цвета. Ход определения. В одну пробирку вносят 5 капель спиртового раствора фолликулина, в другую – 5 капель мочи и добавляют в них по 5 капель растворов гидроксида натрия и м-динитробензола. Перемешивают содержимое встряхиванием и наблюдают за развитием характерного окрашивания. Оформление работы. Данные занести в таблицу. В выводе указать на возможность использования реакции для определения стероидных гормонов.
Практическое значение работы. Специфические реакции на гормоны разной структуры используются для их количественного определения и при анализе гормональных препаратов в контрольно-аналитических лабораториях. Определение продуктов обмена стероидных гормонов 17-кетостероидов используется в клинике для оценки функционального состояния коры надпочечников и половых желез. К 17-кетостероидам относятся эстрон и андростерон; часть их образуется из 17-гидроксистероидов (кортизол, кортизон) в коре надпочечников. В норме содержание 17-кетостероидов в суточной моче составляет у мужчин 0,10-0,16 г, у женщин 0,06-0,13 г. В состоянии стресса (напряжения) повышается содержание кортикостероидов в крови и увеличивается выделение их с мочой. Работа 83. Регуляция инсулином и адреналином уровня глюкозы в крови животных Реактивы. Цитрат натрия, 10%-ный раствор; хлорид натрия, 9 г/л раствор; этанол, 70%-ный. Оборудование. Шприцы; инъекционные иглы; ножницы; вата; микропипетки; весы. Остальные реактивы и оборудование как в работе 46. Материал.
Объект исследования. Кролики. Метод основан на определении в динамике содержания глюкозы в крови после введения инсулина или адреналина. Концентрация глюкозы в крови измеряется о-толуидиновым методом, описанным в работе 48. Ход определения. Для взятия крови берут двух кроликов, голодавших 12 ч. Их взвешивают, выстригают шерсть на ухе, находят краевую вену, зажимают ее пальцем у основания уха. После того, как вена наполнится кровью, ее прокалывают инъекционной иглой и вытекающие капли крови собирают на часовом стекле, смоченном раствором цитрата натрия (чтобы кровь не свернулась). Набирают примерно 0,5 мл крови, ранку на ухе кролика зажимают ватным тампоном, смоченным этанолом, в течение полминуты. Одному кролику вводят раствор инсулина, разведенный хлоридом натрия из расчета 1,5 ЕД на 1 кг массы тела, а другому – раствор адреналина из расчета 0,35 мл на 1 кг массы тела. Через 30 и 60 мин у обоих кроликов забирают кровь, как описано выше. Микропипеткой отбирают по 0,1 мл крови, взятой перед опытом и через 30 и 60 мин после введения инсулина и адреналина. Определяют содержание глюкозы в крови по методике, описанной в работе 46. Примечание. После введения инсулина постоянно наблюдают за кроликом, так как большая доза инсулина может вызвать резкое снижение содержания сахара в крови и привести к смерти. Если у кролика начнутся признаки судорог, следует немедленно ввести 1 мл адреналина. По окончании опыта кролику вводят 20 мл 20%-ного стерильного раствора глюкозы под кожу. Оформление работы. Полученные результаты занести в таблицу и построить график зависимости содержания глюкозы в крови от вводимых гормонов и времени их действия.
В выводах отметить разницу в действии инсулина и адреналина на уровень глюкозы в крови животных и практическое значение работы. Практическое значение работы. Инсулин и адреналин регулируют содержание глюкозы в крови, что позволяет по изменению ее концентрации судить об эффекте данных гормональных препаратов. В фармации это используют для стандартизации заводских препаратов инсулина и контроля его качества. Гипогликемическое действие инсулина используют для лечения больных сахарным диабетом, а адреналин применяют при гипогликемических состояниях, в частности, вызванных передозировкой инсулина. Работа 84. Количественное определение гистамина в крови с диазотированным n-нитроанилином по Н.В.Климкиной и С.И.Плитману Реактивы. Диазотированный n-нитроанилин (готовят перед употреблением из 0,1%-ного раствора n-нитроанилина в 0,1 М соляной кислоте, добавляют к 10 мл охлажденного на льду раствора n-нитроанилина 1 мл 4%-ного раствора нитрита натрия); гистамин, стандартный раствор концентрации 200 мкмоль/л; карбонат натрия, 20%-ный раствор; гидроксид натрия, 5 М раствор; трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; универсальная индикаторная бумага. Оборудование. Штатив с пробирками; воронка с бумажным фильтром; стеклянные палочки; водяная баня; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; ФЭК. Материал. Цельная кровь крысы или кролика, осажденная 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты в отношении 1:9 для экстракции гистамина (выдерживается в холодильнике в течение суток). Метод основан на взаимодействии между гистамином и диазотированным n-нитроанилином с образованием соединения оранжево-красного цвета. Ход определения. Трихлоруксусный экстракт крови фильтруют через бумажный фильтр. В одну пробирку отмеривают 2 мл фильтрата (опыт), в другую – 0,2 мл стандартного раствора гистамина и 1,8 мл дистиллированной воды (стандарт). В обе пробы прибавляют по 3 мл дистиллированной воды и 1 мл раствора нитрита натрия. Пробирки тщательно встряхивают и ставят на 2 мин в кипящую водяную баню. Затем пробирки охлаждают под струей водопроводной воды и к охлажденным пробам добавляют по 1 мл диазотированного n-нитроанилина. Тщательно перемешивают пробы и доводят их рН до 10,0 по универсальной индикаторной бумаге, прибавляя сначала 1,5 мл, а затем 0,5 мл раствора карбоната натрия. Содержимое пробирок перемешивают, охлаждают под струей водопроводной воды и прибавляют 2-3 капли раствора гидроксида натрия до развития окрашивания. Экстинкцию опытной и стандартной проб измеряют на ФЭКе при 520-540 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против контроля на реактивы (10 мл дистиллированной воды, по 2 мл растворов нитрита натрия и диазотированного n-нитроанилина, 4 мл раствора карбоната натрия перемешивают и приливают 0,6 мл раствора гидроксида натрия). Расчет проводят по формуле Еоп200 х = ————— , Ест где х – концентрация гистамина в цельной крови, мкмоль/л; Еоп – экстинкция опытного раствора; Ест – экстинкция стандартного раствора; 200 – концентрация стандартного раствора гистамина, мкмоль/л. Оформление работы. Рассчитать содержание гистамина в крови и сделать вывод о возможных причинах изменения его уровня. В выводе отразить практическое значение определения гистамина в крови. Практическое значение работы. Гистамин относится к биогенным аминам. Он играет роль тканевого регулятора и медиатора в нервной системе. Гистамин усиливает проницаемость стенок кровеносных сосудов, стимулирует функцию желез желудка (выработку соляной кислоты), сократительную деятельность матки и т.д. Избыточное содержание гистамина в организме ведет к вегетативным нарушениям и аллергическим реакциям. Определение гистамина в практике используется для исследования уровня его в крови и тканях животных при действии на них аллергенных веществ. Содержание гистамина в крови имеет видовые колебания. В крови лабораторных животных (крысы, кролики) его концентрация составляет 90-220 мкмоль/л, а у здорового человека его содержится 0,02-0,04 мкмоль/л. В контрольно-аналитических лабораториях этот метод применяется для контроля качества заводских препаратов гистамина в ампулах, выпускаемых в виде 0,1%-ного раствора. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙСостояние биохимических процессов в тканях и органах оценивается прямым и косвенным способом. В первом случае для этой цели берутся на исследование кусочки ткани (биоптаты), а во втором, который более приемлемым для клиники, - биологические жидкости, главным образом кровь и моча. Кровь является жидкой тканью организма, состоящей из клеток и плазмы. Обмен веществ клеток крови частично отражает общие закономерности метаболизма, по которым можно судить о его сдвигах в других тканях. Однако форменные элементы крови выполняют также специальные функции, для оценки которых изучают соответствующие биохимические показатели. Составные компоненты плазмы (белки, небелковые органические и минеральные вещества) дают необходимую информацию о функциях собственно крови (транспортной, регуляторной и т.д.) и об изменениях метаболизма, произошедших в разных тканях. Биохимические исследования мочи позволяют судить об изменениях не только в выделительной и мочеобразовательной функциях почек, но и об обмене веществ в других органах и организме в целом. 1. Биохимические исследования крови Работа 85. Определение содержания гемоглобина в крови по его светопоглощению Реактивы. Гидроксид аммония, 0,4 г/л раствор. Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1 и 10 мл; ФЭК. Материал. Кровь, взятая из пальца обследуемого. Метод основан на измерении при 450 нм светопоглощения содержащегося в крови гемоглобина, которое пропорционально его концентрации. Ход определения. В пробирку отмеривают 8 мл раствора гидроксида аммония. Микропипеткой берут из пальца обследуемого 0,05 мл крови и вносят ее в пробирку. Микропипетку трижды ополаскивают этим же раствором, тщательно перемешивают содержимое, при этом происходит полный гемолиз эритроцитов и просветляется жидкость. Пробирку встряхивают 2-3 мин для полного оксигенирования гемоглобина. Определяют экстинкцию гемолизированной крови против воды на ФЭКе при 540 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 0,5 см. Расчет. Содержание гемоглобина в крови определяют по калибровочному графику, построенному по серии растворов кристаллического гемоглобина с известными концентрациями. Оформление работы. По полученным экстинкциям определить содержание гемоглобина в крови (в г/л), сделать вывод о возможном изменении количества гемоглобина и указать вероятные его причины. Практическое значение работы. Нормальное содержание гемоглобина у взрослого человека составляет у мужчин 130-160 г/л, у женщин 120-140 г/л. У новорожденных концентрация гемоглобина выше, чем у взрослых, а к концу первого года жизни она уменьшается до 110 г/л и вновь достигает уровня взрослого человека в период половой зрелости. Пониженное содержание гемоглобина (анемия) наблюдается при кровопотерях, недостатке железа в организме, дефиците витамина В12 и фолиевой кислоты, при отравлении лекарствами и токсическими веществами, вызывающими гемолиз эритроцитов (гемолитическая анемия) и т.д. Высокое содержание гемоглобина (200 г/л и выше) имеет место при повышенном количестве эритроцитов в крови (полицитемия). Работа 86. Определение содержания фетального гемоглобина в эритроцитах крови человека Реактивы. Раствор ферриацетонциангидрата*; раствор ацетонциангидрина*; денатурирующий раствор едкого натрия*; осаждающий раствор сульфата аммония (3,28 моль/л)*. Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 0,2 и 5,0 мл; центрифуга с центрифужными весами; секундомер; обеззоленные фильтры; спектрофотометр или фотоколориметр. Материал. Гепаринизированная кровь. Метод основан на способности ацетонциангидрина в присутствии раствора гемоглобина образовывать цианметгемоглобин (гемоглобинцианид), интенсивность окрашивания которого пропорциональна содержанию гемоглобина в пробе. Ход определения. Кровь в количестве 1-2 мл, полученную при наличии гепарина, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования плазму сливают и оставшийся осадок эритроцитов отмывают 8-10 объемами изотонического раствора хлористого натрия. Центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут и отсасывают супернатант. Из полученных эритроцитов готовят эритроцитарную массу путем разведения физиологическим раствором в отношении 1:1, которая и используется для получения гемолизата. С этой целью к 0,2 мл эритроцитарной взвеси добавляют 5 мл раствора ферриацетонциангидрина. В полученном гемолизате проводят определение содержания общего и фетального гемоглобина. При определении общего гемоглобина через 15 минут к 0,1 мл полученного гемолизата добавляют 5 мл раствора ацетонциангидрина. При определении фетального гемоглобина к 3,0 мл гемолизата добавляют 0,2 мл гидроксида натрия (для денатурации нормального гемоглобина) и выдерживают точно 2 минуты (по секундомеру) при температуре 22-24˚С и затем добавляют 3,2 мл раствора сульфата аммония. Пробирку встряхивают несколько раз и через 10 минут содержимое фильтруют через двойной обеззоленный фильтр диаметром 9 см. Растворы общего и фетального гемоглобина фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 420 нм. В качестве контроля служат: для определения общего гемоглобина – раствор ацетонциангидрина, для определения фетального гемоглобина – 0,2 мл гидроксида натрия и 3,2 мл сульфата аммония. Расчет проводится по формуле фетал.Нв∙(6,4/3,0)∙100 %Нв = —————————————— , общий Нв∙51 где 6,4 – конечный объем фетального гемоглобина после денатурации гидроксидом натрия и осаждения сульфатом аммония; 3,0 – исходный объем гемолизата, содержащий общий гемоглобинцианид; 51 – фактор разбавления общего гемоглобинцианида; 100 – перевод в проценты. Оформление работы. По экстинкции рассчитать содержание фетального гемоглобина, сравнить с нормой и сделать вывод о возможных отклонениях. Практическое значение работы. В норме содержание фетального гемоглобина в эритроцитах составляет 0,75-0,97%. Повышение фетального гемоглобина является важным критерием для диагностики бета-талассемии, при которой одновременно повышается и содержание гемоглобина А2. Особенно высокое содержание фетального гемоглобина может быть при гомозиготной бета-талассемии до 20-90%. При гетерозиготной форме бета-талассемии содержание фетального гемоглобина может быть нормальным или умеренно повышенным – 2,57%. Следует отметить, что увеличение содержания фетального гемоглобина однако не является специфичным для бета-талассемии. Оно встречается и при других состояниях: гемолитических анемиях, железодефицитной гипопластической анемии, лейкозах и других состояниях, сопровождающих гипоксией, что вероятно, связано с компенсаторными процессами. Работа 87. Определение содержания гликозилированного гемоглобина в эритроцитах крови фотоколориметрическим методом Реактивы. 40%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; 1 М раствор щавелевой кислоты; 0,05 М раствор тиобарбитуровой кислоты; 0,04%-ный раствор гидроксида аммония; 0,9%-ный раствор хлорида натрия. Оборудование. Центрифуга лабораторная; ФЭК (спектрофотометр); водяная баня; термостат; пробирки с плотно притертыми пробками. Материал. Кровь забирают натощак из локтевой вены. Добавляют гепарин из расчета 5ед/1мл для предотвращения свертывания. Эритроциты отделяют от плазмы центрифугированием 3000 об/мин в течение 10 минут и трехкратно отмывают физиологическим раствором. Затем к суспензии эритроцитов добавляют дистиллированную воду и 1-2 капли хлороформа для гемолиза. Метод основан на способности 5-гидроксиметилфурфурола, образующегося из углеводного компонента гликозилированного гемоглобина при его кислотном гидролизе, образовывать с тиобарбитуровой кислотой окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию гликозилированного гемоглобина в эритроцитах. Ход определения.
В пробирку внести 8 мл раствора аммиака и добавить 0,05 мл гемолизата (микропипеткой, многократно промывая ее раствором аммиака). Встряхивать 2 минуты, после чего определить экстинкцию на ФЭКе (длина волны 540 нм, зеленый светофильтр) против раствора аммиака. Содержание гемоглобина в гемолизате в г/л определяют по калибровочному графику.
В пробирку внести объем гемолизата, содержащего 10 мг гемоглобина, довести до 1 мл 0,9% раствором хлорида натрия, добавить 1 мл 1 М щавелевой кислоты, плотно закрыть пробкой и инкубировать в термостате при 100˚С в течение 5 часов. Пробирку охладить, внести 1 мл 40% раствора трихлоруксусной кислоты, тщательно перемешать и центрифугировать 10 минут при 3000 оборотов в минуту. В чистую пробирку отобрать 2 мл надосадочной кислоты, перемешать и инкубировать 40 минут на водяной бане при 40˚С, после чего фотометрируют при длине волны 443 нм против дистиллированной воды. Содержание гликозилированного гемоглобина (в % от общего) определяют по калибровочному графику. Практическое значение работы. Содержание гликозилированного гемоглобина в норме составляет от 3 до 5,5% от общего. Известно, что уровень гликозилированного гемоглобина может являться показателем уровня гликемии за предшествующие 2-3 месяца. В связи с этим определением уровня гликозилированного гемоглобина в настоящее время применяют для ранней диагностики и оценки компенсации сахарного диабета. Помимо сахарного диабета, повышение уровня гликозилированного гемоглобина может наблюдаться при кистозном фиброзе, заболеваниях, сопровождающихся укорочением жизни эритроцитов, хронической почечной недостаточности. Работа 88. Определение концентрации гаптоглобинов в сыворотке крови фотоколориметрическим методом Реактивы. Гемоглобин, 5 г/л раствор; риванол, 3 г/л раствор; сульфат аммония, 10%-ный раствор. Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК. Материал. Сыворотка крови. Метод основан на осаждении риванолом образующегося комплекса гемоглобин-гаптоглобин. Избыток добавленного к сыворотке крови гемоглобина после осаждения риванолом определяется фотоколориметрически. Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 0,5 мл сыворотки, 0,2 мл раствора гемоглобина и 0,3 мл дистиллированной воды. В контрольную пробирку вносят те же вещества, только вместо раствора гемоглобина приливают 0,2 мл дистиллированной воды. Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивают взбалтыванием, через 10 мин прибавляют в них по 2 мл раствора риванола и оставляют стоять 5 мин. Пробы центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Прозрачную или слегка опалесцирующую надосадочную жидкость сливают в две чистые пробирки, добавляют по 0,2 мл 10%-ного раствора сульфата аммония (для просветления жидкости) и оставляют стоять при комнатной температуре 20 мин. В стандартную пробирку помещают 2,8 мл дистиллированной воды, 0,2 мл раствора гемоглобина и 0,2 мл сульфата аммония. Измеряют экстинкцию всех трех проб против воды на ФЭКе при 540 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1 см. Расчет проводят по формуле [Ест – (Еоп – Ек)]2000∙0,003 х = ——————————————— , Ест где х – содержание гаптоглобинов в сыворотке крови, г/л; Еоп – экстинкция опытной пробы; Ек – экстинкция контрольной пробы; Ест – экстинкция стандартной пробы; 2000 – пересчет на литр сыворотки; 0,003 – содержание гемоглобина в стандартной пробе, г/л. Оформление работы. По значениям экстинкции рассчитать содержание гаптоглобинов в сыворотке крови. Сделать вывод о возможных изменениях количества гаптоглобинов. Практическое значение работы. В сыворотке крови взрослого здорового человека концентрация гаптоглобинов составляет 0,28-1,90 г/л. Гаптоглобины входят в состав фракции α-глобулинов сыворотки крови. У новорожденных гаптоглобины, как правило, отсутствуют. Они начинают появляться в возрасте один-два месяца и достигают уровня взрослых к первому полугодию. Гаптоглобины связывают внеэритроцитарный гемоглобин, образуя с ним комплекс. Тем самым гаптоглобин выполняет в организме защитную функцию, например, при разрушении эритроцитов (гемолизе). При гемолизе гаптоглобин препятствует экскреции гемоглобина почками, предотвращая нарушение функции канальцев. Работа 89. Проба Вельтмана в модификации Тейфеля на коллоидную устойчивость белков сыворотки крови Реактивы. Хлорид кальция, 5 г/л раствор. Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1 и 5 мл. Материал. Сыворотка крови. Метод основан на разной устойчивости отдельных белковых фракций сыворотки крови к коагуляции под действием определенных концентраций хлорида кальция и нагревания. Ход определения. В пробирку вносят 0,1 мл сыворотки крови и 4,9 мл дистиллированной воды и перемешивают встряхиванием. К содержимому добавляют 0,1 мл раствора хлорида кальция, пробирку встряхивают и осторожно нагревают раствор над пламенем до закипания. После этого пробирку охлаждают и смотрят на свет. Равномерное помутнение жидкости, независимо от его интенсивности, не свидетельствует об окончании реакции. Она завершается только при появлении хлопьев. Если же они не образуются, то вновь приливают в ту же пробирку 0,1 мл хлорида кальция, нагревают ее до закипания жидкости и так повторяют, пока не выпадет хлопьевидный осадок. Отмечают объем хлорида кальция, пошедший на образование хлопьевидного осадка белков, и определяют состояние коагуляционной ленты Вельтмана по схеме
Оформление работы. Отмечают объем хлорида кальция (в мл), пошедший на образование хлопьевидного осадка. В выводах указать изменения коагуляционной ленты Вельтмана. Практическое значение работы. Нарушение соотношения белковых фракций крови (диспротеинемия) при ряде патологических процессов приводит к нарушению коллоидной устойчивости белков. Сдвиг коагуляционной ленты вправо (на образование хлопьевидного осадка пошло менее 0,4 мл CaCl2), обусловленный повышением содержания γ-глобулинов в сыворотке крови, наблюдается при повреждении печени (гепатит, цирроз, дистрофия), гемолизе и хронических воспалительных процессах (пневмония, туберкулез, остеомиелит, пиелонефрит, ревматизм и др.). Сдвиг коагуляционной ленты влево (на образование хлопьевидного осадка пошло более 0,5 мл CaCl2), обусловленный увеличением содержания сывороточных α- и β-глобулинов, отмечается при острых воспалительных и экссудативных процессах (ревматизм, туберкулез), сахарном диабете, поражении почек и злокачественных опухолях. Работа 90. Определение активности α-амилазы в сыворотке крови амилокластическим методом Реактивы. Крахмал, 20 г/л раствор; фосфатный буфер, 0,1 М раствор с рН 7,2; натрия хлорид, 30 г/л раствор; соляная кислота, 1 М раствор; иод, 0,1 М раствор в 30 г/л растворе иодида калия. Оборудование. Водяная баня; термостат, отрегулированный на 37˚С; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 мл; мерные колбы вместимостью 50 мл; ФЭК. Материал. Сыворотка крови. Метод основан на фотометрическом определении убыли крахмала в ходе реакции гидролиза его α-амилазой сыворотки крови. Разница концентраций крахмала до и после гидролиза пропорциональна активности фермента. Ход определения. В две пробирки, опытную и контрольную, вносят по 0,5 мл растворов крахмала, по 0,3 мл фосфатного буфера и по 0,1 мл раствора хлорида натрия. Содержимое перемешивают встряхиванием и помещают на 10 мин в водяную баню при 37˚С. В опытную пробу добавляют 0,1 мл сыворотки крови, а в контрольную – 0,1 мл раствора соляной кислоты и затем 0,1 мл сыворотки крови. Тщательно перемешивают смесь в пробирках и ставят пробы на 30 мин в термостат при 37˚С. По окончании инкубации в опытную пробирку прибавляют 0,1 мл раствора соляной кислоты и быстро перемешивают содержимое встряхиванием – реакция останавливается. Отбирают по 0,2 мл содержимого обеих пробирок и переносят в две мерные колбы на 50 мл. Приливают в них по 40 мл дистиллированной воды и по 0,5 мл раствора иода в иодиде калия. Перемешивают и доводят объем до метки дистиллированной воды. Полученные растворы тотчас фотометрируют на ФЭКе против воды при 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см. Примечание. Опытные и контрольные пробы должны иметь одинаковую температуру, так как ее изменение сказывается на интенсивности окраски иод-крахмального раствора. Расчет проводят по формуле (Ек – Еоп)0,01∙2∙1000 х = —————————— Ек0,1 где х – активность амилазы сыворотки крови, г/(ч∙л); Ек – экстинкция контрольной пробы; Еоп – экстинкция опытной пробы; 0,01 – масса крахмала в пробе, г; 2 – пересчет на 1 ч инкубации; 1000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови; 0,1 – объем сыворотки крови, взятой на исследование, мл. Оформление работы. Рассчитать активность фермента, сравнить ее с нормой и сделать вывод. Практическое значение работы. В норме активность амилазы сыворотки крови, определенная амилокластическим методом, составляет 15-30 г/(ч∙л). Источником сывороточной амилазы служат поджелудочная железа и слюнные железы. У здорового человека количество слюнной и панкреатической амилазы примерно одинаково. Возрастание активности амилазы крови (гиперамилаземия) наблюдается при остром панкреатите, когда она повышается в 10-30 раз, достигая максимума через 24 ч после начала заболевания, и затем постепенно приходит к норме на 2-6-й день. При хронических панкреатитах гиперамилаземия умеренная. Она встречается также при поражении слюнных желез. Гипоамилаземия отмечается при недостатке внешнесекреторной функции поджелудочной железы, заболеваниях печени (гепатит, цирроз, интоксикации), расстройствах питания (токсические диспепсии), сахарном диабете и т.д. Работа 91. Определение содержания кальция в сыворотке крови мурексидным методом Реактивы. Комплексон III, 0,665 г/л раствор; гидроксид натрия, 9 М раствор; мурексид, растертый в тонкий порошок с NaCl в соотношении 1:50. Оборудование. Конические колбочки вместимостью 50 мл; микробюретка. Материал. Сыворотка крови. Метод основан на способности мурексида образовывать с ионами кальция в щелочной среде комплексные соединения, окрашенные в красно-фиолетовый или бледно-розовый цвет (в зависимости от концентрации). При титровании раствором более сильного комплексообразователя (комплексон III) это комплексное соединение разрушается и связанный мурексид вновь освобождается, что приводит к появлению его натуральной окраски (фиолетовой или бледно-сиреневой). Объем комплексона III, пошедший на титрование, пропорционален содержанию кальция в сыворотке крови. Ход определения. В коническую колбочку вносят 50 мл дистиллированной воды, 0,4 мл раствора гидроксида натрия, на кончике скальпеля мурексид и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Появляется бледно-сиреневая окраска, обусловленная цветом самого индикатора. Отбирают 25 мл полученного раствора в колбочку для титрования (оставшийся раствор служит эталоном сравнения) и добавляют 0,5 мл сыворотки крови, при этом появляется бледно-розовое окрашивание, обусловленное образованием кальциево-мурексидного комплекса. Смесь титруют раствором комплексона III до первоначальной окраски индикатора. Конец титрования контролируют, сопоставляя окраску опытной пробы с эталоном (неиспользованная часть раствора). Расчет. Содержание кальция рассчитывают по формуле V72 х = —————————— , 40∙0,5 где х – содержание кальция в сыворотке крови, ммоль/л; V – объем раствора комплексона III, пошедший на титрование, мл; 0,5 – объем сыворотки, взятый на исследование, мл; 72 – коэффициент пересчета количества кальция на 1 л сыворотки с учетом эквивалентности комплексообразователя; 40 – молекулярная масса кальция. Оформление работы. Рассчитать содержание кальция в сыворотке крови (в ммоль/л), сравнить с нормой и сделать вывод. Практическое значение работы. В норме содержание кальция в сыворотке крови составляет 2,25-2,75 ммоль/л. Гиперкальциемия наблюдается при гипервитаминозе D, гиперпаратиреоидизме, при сердечной недостаточности, желтухе. Гипокальциемия встречается при спазмофилии, рахите, хронических заболеваниях почек, гипопаратиреоидизме и т.д. Работа 92. Тимоловая проба по Хуэрго и ПопперРеактивы. 10%-ный спиртовой раствор тимола*; буферный раствор*; тимолововероналовый буфер*; стандартный раствор*. Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки на 0,2 и 10 мл; фотоэлектроколориметр. Материал. Исследуемая сыворотка крови. Метод основан на взаимодействии белков сыворотки крови с тимолово-вероналовым буфером, при этом появляется мутность вследствие образования глобулино-тимоло-фосфолипидного комплекса. Ход определения. К 6,0 мл тимолово-вероналового буферного раствора прибавляют 0,1 мл негемолизированной сыворотки, оставляют стоять 30 минут, затем фотометрируют при 660 нм против буферного раствора в кюветах с толщиной 10 мм. Реакцию проводят при температуре +25˚С. Расчет ведут по калибровочной кривой. Примечание. Для получения точных данных важным является взятие крови натощак: алиментарная гиперлипемия существенно влияет на результаты исследования. При постановке пробы может использоваться сыворотка, хранившаяся в течение нескольких дней. Умеренный гемолиз не отражается на результатах исследования. Расчет. По полученной величине экстинкции по калибровочному графику проводят определение величины тимоловой пробы. Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора готовят разведение, соответствующее единицам помутнения по S-H. Так, 1,35 мл суспензии и 4,65 мл 0,2 н серной кислоты соответствует 5 S-H помутнения; 2,70 мл суспензии и 3,30 мл кислоты – 10 S-H; 5,40 мл суспензии и 0,60 мл кислоты – 20 S-H помутнения. Разведения смешивают, хорошо встряхивают и фотометрируют при длине волны 660 нм (630-690 нм – красный светофильтр) против воды в кюветах на 10 мм. По полученным данным строят калибровочную кривую Оформление работы. После определения величины тимоловой пробы по полученным данным сделать вывод о возможных изменениях и причинах их отклонений. Практическое значение работы. В норме составляет 0-4 ед (SH). Тимоловая проба более пригодна для функционального исследования печени. Она положительна при болезни Боткина, при токсическом гепатите, коллагеновых заболеваниях, малярии и вирусных инфекциях. При механической желтухе проба отрицательна, что имеет дифференциально-диагностическое значение. Работа 93. Сулемово-осадочная реакция (сулемовая проба по Гринседту). Реактивы. 0,1% раствор сулемы (готовят из кристаллической сулемы, растворяя соль в горячей дистиллированной воде); 0,85% раствор хлорида натрия. Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки на 1,0 и 2,0 мл. Материал. Исследуемая сыворотка крови. Метод основан на способности сулемы образовывать с мелкодисперсными белками коллоидный раствор солей ртути. Нарушение дисперсности белковых фракций сыворотки крови вызывает осаждение грубодисперсных частиц. Ход определения. К 0,5 мл негемолизированной сыворотки крови добавляют 1 мл физиологического раствора и титруют 0,1% раствором сулемы из микробюретки или пипетки емкостью 2 мл. В начале раствор приливают по каплям в быстрой последовательности до первоначального образования помутнения, затем медленно до появления стойкого помутнения. Результаты сулемовой реакции выражают количеством мл раствора сулемы, израсходованного на титрование. Расчет. Проводят на основании количества сулемы, пошедшей на титрование исследуемой пробы. Оформление работы. После определения величины сулемовой пробы по полученным данным сделать вывод о возможных изменениях и причинах их отклонений. Практическое значение работы. В норме у здоровых людей на титрование идет 1,6-2,2 мл сулемы. Положительная проба встречается при ряде патологических состояний: заболеваниях печени (при болезни Боткина сулемовая проба составляет около 1 мл, приходя к норме при выздоровлении), хроническом нефрите, нефрозе, пневмонии, туберкулезе легких, миеломе, инфекционных заболеваниях и т.д. Работа 94. Количественное определение содержания железа в сыворотке крови Реактивы. Трихлоруксусная кислота, 20% раствор; уксуснокислый аммоний, 70% раствор; насыщенный раствор сульфата гидразина (2,5 г соли растворяют в 100 мл воды); раствор батофенантролина*; стандартный раствор*. Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью на 1,0; 2,0 и 5,0 мл; водяная баня на 100˚С; центрифуга лабораторная; фотоколориметр. Материал. Сыворотка, не содержащая следов гемолиза. Метод основан на способности бато-фенантролина в сульфатированной форме образовывать с ионами двухвалентного железа окрашенный комплекс, интенсивность которого определяется фотометрически. Ход определения. К 2 мл исследуемой сыворотки прибавляют 2,5 мл воды, 1,5 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и ставят на 15 минут на водяную баню при температуре 90-95˚С. Центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин и отбирают 4 мл надосадочной жидкости, к которой добавляют 0,35 мл 70% раствора ацетата аммония и 0,3 мл раствора сульфата гидразина. Смесь фотометрируют при длине волны 535 нм в кювете 10 мм. Затем добавляют 0,4 мл раствора сульфонированного бато-фенантролина, оставляют стоять на 1 час, после чего фотометрируют при тех же условиях. Фотометрию проводят против контрольной пробы, в которую вместо исследуемой сыворотки вносят 2 мл воды. Калибровку проводят так же как и основной опыт, но вместо сыворотки берут 2 мл стандартного раствора. Расчет проводят по формуле: Еоп-1 – Еоп-2 ——————— ∙30 (мкмоль/л) Ек-1 – Ек-2 где Еоп-1 и Еоп-2 – экстинкции опытной пробы до и после прибавления раствора бато-фенантролина; Ек-1 – Ек-2 – результаты фотометрии калибровочной пробы; 30 – содержание железа в калибровочном растворе, мкмоль/л. Примечание.
Оформление работы. Рассчитать содержание железа по представленной формуле и сделать вывод его в соответствии норме. Практическое значение работы. В норме содержание негеминового железа у мужчин 12-32 мкмоль/л, у женщин – на 10-15% ниже. Содержание железа сыворотки значительно снижается при железодефицитной анемии, независимо от причины ее вызывающей. При воспалительных, инфекционных, септических состояниях, интоксикации, опухолях анемии обусловлены не столько дефицитом железа, сколько его недостаточным освобождением из РЭС, вследствие чего снижается синтез гемоглобина. 2. Биохимическое исследование мочи Моча образуется и выделяется почками. Первичная моча представляет собой ультрафильтрат крови. Она содержит все компоненты крови, кроме форменных элементов и белков, масса которых превышает 50000. В результате реабсорбционных и секреторных процессов в канальцах и собирательных трубках почек формируется окончательная моча. Изменения функции и повреждения различных органов отражаются на химическом составе крови, а следовательно, на компонентах ее ультрафильтрата (первичная моча) и затем на составе окончательной мочи. Нарушения деятельности почек непосредственно сказываются на физико-химических свойствах выделяемой мочи и содержании в ней различных веществ. Поэтому биохимические исследования мочи играют важную роль в клинике для диагностики и определения прогноза заболевания, а также для контроля за эффективностью проводимого лечения. В состав мочи входят вода, органические и минеральные соли, всего около 150 веществ. В клинико-биохимических лабораториях проводят общий и специальный анализ мочи. Общий анализ включает исследование физико-химических свойств мочи и определение в ней ряда патологических компонентов: белок, сахар, кетоновые (ацетоновые) тела, гемоглобин, пигменты и индикан. При необходимости подсчитывают также количество эритроцитов и лейкоцитов в моче. Общий анализ обязателен при первичном обследовании пациента и диспансерном наблюдении. Специальный анализ, т.е. определение прочих компонентов мочи (метаболиты, ферменты, отдельные минеральные вещества и т.д.) проводится при подозрении на поражение конкретного звена обмена или определенного органа. Работа 95. Исследование физико-химических свойств мочиОборудование. Мерный цилиндр вместимостью 1 или 2 л; урометры с делениями от 1,000 до 1,030 кг/л и от 1,030 до 1,060 кг/л; термометр; фильтровальная бумага; стеклянные цилиндры вместимостью 50 или 100 мл; универсальная индикаторная бумага; стаканчик. Материал. Суточная моча, взятая у обследуемого. а. Характеристика суточного объема мочи (диурез). Суточный объем мочи замеряют с помощью мерного цилиндра на 1 или 2 л. В норме он составляет в среднем 1500 мл у мужчин и 1200 мл у женщин. Объем мочи выше 2200 мл и ниже 500 мл в сутки указывают на патологию. б. Характеристика цвета мочи. Цвет мочи оценивают визуально. В норме он соломенно-желтый и обусловлен присутствием пигментов: урохрома (темно-желтый), уробилина (бледно-розовый), уроэритрина (бледно-красный). При патологии или приеме с пищей красящих веществ цвет мочи меняется. Бледно-желтая или почти бесцветная моча характерна для полиурии (сахарный и несахарный диабет), почечные заболевания. Красная окраска бывает при гемоглобин- и миоглобинурии или от пищевых красителей, содержащихся в конфетах, чернике, смородине, свекле и т.д. Коричнево-темный цвет наблюдается при алкаптонурии или меланинурии. Зелено-синяя окраска отмечается при бактериальном загрязнении мочи или избытке в ней индикана, который превращается в синее индиго. Желто-зеленая окраска (цвет пива) мочи обусловлена присутствием в ней желчных кислот и пигментов. в. Оценка прозрачности мочи. Прозрачность мочи оценивается визуально. В норме моча прозрачна; при стоянии из нее осаждается рыхлая слизистая масса, состоящая из слущенного эпителия мочевых путей и слизистых телец. Помутнение мочи может быть вызвано присутствием в ней избытка солей (ураты, фосфаты, оксалаты, карбонаты) или слизи, гноя, микробов и слущенных клеток. г. Определение запаха мочи. В норме запах мочи ароматический, напоминающий запах мясного бульона или миндаля. Пахучие пищевые вещества или лекарства могут придавать моче свойственный им запах. Загнившая моча имеет запах аммиака, при разложении клеток в мочевых путях моча приобретает гнилостный запах, а присутствие большого количества кетоновых тел (сахарный диабет) придает ей плодовый запах. д. Исследование плотности мочи. Стеклянный цилиндр ставят строго вертикально и наливают в него мочу. Если образуется пена, ее снимают фильтровальной бумагой. Осторожно погружают в мочу сухой урометр так, чтобы он свободно плавал, не касаясь стенок цилиндра, и производят отсчет по отметке шкалы урометра, совпадающей с нижним мениском жидкости. Измеряют температуру мочи. По шкале урометра сразу находят плотность мочи (в кг/л), но так как он откалиброван при определенной температуре (чаще всего при 15˚С), необходимо внести поправку на температуру мочи. Для этого на каждые 3˚С выше 15˚С прибавляют по 0,001 кг/л к измеренной плотности и, наоборот, если температура ниже 15˚С,на каждые 3˚С вычитают по 0,001 кг/л. е. Определение рН мочи. Полоску универсальной индикаторной бумаги погружают в исследуемую мочу, вынимают ее и определяют по цветной шкале рН. В норме рН мочи колеблется от 5,0 до 7,0. Сдвиг рН в кислую сторону отмечается при выделении ацетоновых тел (сахарный диабет, голодание) или при тяжелой недостаточности почек. Смещение рН в щелочную сторону наблюдается при употреблении с пищей гидрокарбонатов, щелочных минеральных вод, молочно-растительных продуктов, воспалении слизистой мочевого пузыря и после длительной рвоты. Оформление работы. Занести полученные данные анализа в тетрадь, сделать вывод о характерных изменениях и указать причины. Работа 96. Определение кетоновых тел и глюкозы в мочеК кетоновым (ацетоновым) телам относятся ацетон, ацетоуксусная и β-гидроксимасляная кислоты. Реактивы. Нитропруссид натрия, 10%-ный раствор свежеприготовленный; уксусная кислота, конц.; гидроксид натрия, 10%-ный раствор; хлорид железа (III), 10%-ный раствор. Оборудование. Глазные пипетки; штатив с пробирками; набор «Глюкотест». Материал. Моча, нормальная и патологическая. а. Проба Легаля на ацетон и ацетоуксусную кислоту мочи. Метод основан на способности ацетона и ацетоуксусной кислоты в щелочной среде образовывать с нитропруссидом натрия комплексы оранжево-красного цвета, а при подкислении раствора – соединений вишнево-красного цвета. Ход определения. В одну пробирку вносят 10 капель нормальной, в другую – 10 капель патологической мочи и добавляют в обе пробы по 2 капли раствора нитропруссида натрия и по 4 капли раствора гидроксида натрия. Появляется оранжево-красное окрашивание. Вносят в обе пробирки по 10 капель концентрированной уксусной кислоты, при этом возникает вишнево-красное окрашивание. Примечание. Креатинин мочи с нитропруссидом натрия также дает оранжево-красное окрашивание, но при добавлении концентрированной уксусной кислоты жидкость окрашивается в желтый цвет. б. Проба Герхарда на ацетоуксусную кислоту мочи. Метод основан на взаимодействии железа с енольной формой ацетоуксусной кислоты с образованием комплекса красно-фиолетового цвета. Ход определения. В одну пробирку вносят 20 капель нормальной, а в другую – 20 капель патологической мочи и прибавляют по 5 капель раствора хлорида железа (III) в обе пробы. Развивается красно-фиолетовое окрашивание. в. Экспресс-тест на ацетон мочи. Ход определения. На каждую из таблеток наносят по 2 капли нормальной и патологической мочи. Через 2 мин сравнивают окраску таблеток с цветной шкалой, приложенной к набору. При отсутствии ацетона окраска не развивается. г. Определение глюкозы в моче с помощью набора «Глюкотест». Метод основан на визуальной оценке изменения цвета красителя (о-толидин), которым пропитана полоска бумаги «Глюкотест»; по цветной шкале устанавливают примерное содержание глюкозы в моче. Ход определения. Одну полоску бумаги «Глюкотест» смачивают нормальной, а другую – патологической мочой. Сравнивают через несколько минут окраску полосок с цветной шкалой, имеющейся в комплекте. Содержание глюкозы в моче определяют по наиболее совпадающему со шкалой цвету полоски. Оформление работы. Результаты занести в таблицу.
Сделать вывод о присутствии ацетоновых тел и глюкозы в образцах нормальной и патологической мочи и указать на вероятные их причины. Практическое значение работы. В норме пробы на ацетоновые тела и глюкозу в моче отрицательны. Одновременное выделение ацетоновых тел и глюкозы с мочой наблюдается наиболее часто при сахарном диабете, реже при действии глюкокортикоидов (стероидный диабет), соматотропина и кортикотропина. Глюкозурия без ацетонурии имеет место при употреблении большого количества углеводов с пищей, а ацетонурия без глюкозурии – при голодании. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||