практикум по биохимии. Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,

• Название: Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,
• Анкор: практикум по биохимии.docx
• Дата: 02.05.2017
• Размер: 1.79 Mb.
• Имя файла: практикум по биохимии.docx
• Тип: Практикум; #6494
• страница: 29 из 39

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ПАТОЛОГИЯ

Биохимические исследования с целью выявления молекулярных болезней чрезвычайно важны в педиатрии, поскольку своевременная диагностика их помогает раннему лечению с более благоприятным исходом. При ферментопатии блокируется цепь биохимических превращений в тканях, поэтому ранним признаком такого заболевания является накопление в крови и повышенное выделение с мочой веществ, служащих субстратом для поврежденного ферментного белка. В то же время концентрация продуктов данной ферментативной реакции в биологических жидкостях понижена. Поэтому первоначально у больных с подозрением на молекулярную патологию ставят качественную реакцию на вещества, накопления которых ожидают. При положительных пробах проводят их количественное определение. Для уточнения энзимопатии исследуется качественно и количественно соответствующий фермент в сыворотке и клетках крови, а также в биоптатах.

1. Экспресс-диагностика патологии аминокислотного обмена

Работа 66. Выявление гипераминоацидурии

Реактивы. Нингидрин, 0,5%-ный раствор в ацетоне с добавлением 1 мл концентрированной уксусной кислоты на 100 мл жидкости; глицин, стандартный 20 мМ раствор.

Оборудование. Полоски фильтровальной бумаги 10х40 мм; сушильный шкаф, отрегулированный на 60˚С; глазные пипетки.

Материал. Моча, нормальная и патологическая^*.

Принцип метода см. работу 1, б.

Ход определения. В трех пробирках готовят серию разведений стандартного раствора глицина в 2,5 и 10 раз, при этом концентрация азота глицина в пробах составляет соответственно 10,4 и 2 ммоль/л.

На две полоски фильтровальной бумаги наносят по 1 капле соответственно нормальной и патологической мочи, а еще на четыре – по 1 капле неразведенного и разведенного в 2,5 и 10 раз стандартного раствора глицина. Пятна подсушивают на воздухе.

На высушенные пятна наносят по 1-2 капли раствора нингидрина, подсушивают на воздухе и затем помещают полоски на 15 мин в сушильный шкаф при 60˚С, подвешивая их на крючках.

Сравнивают интенсивность окраски проб нормальной и патологической мочи с окраской глицина на полосках фильтровальной бумаги. Цветная шкала соответствует следующим концентрациям глицина: 20. 10, 4, 2 ммоль/л.

Оформление работы. Оценить примерное содержание азота аминокислот в нормальной и патологической моче. Сделать вывод о наличии гипераминоацидурии у больного ребенка и указать возможные ее причины.

Практическое значение работы. В норме экскреция азота аминокислот составляет 0,29-5,35 ммоль/сут. У ребенка его выделяется 0,07-0,15 ммоль/кг массы тела в сутки, причем 2/3-3/4 этого количества экскретируется в ночное время. Гипераминоацидурия наблюдается при молекулярных болезнях, возникающих вследствие дефекта белков эпителия канальцев почек, переносящих аминокислоты и способствующих их реабсорбции, или в результате нарушения обмена аминокислот в тканях. Окончательно наследственная причина гипераминоацидурии устанавливается после исключения ряда заболеваний (цирроз печени, гепатиты, дистрофия, рахит и т.д.), тоже приводящих к повышенному выделению аминокислот с мочой.

Работа 67. Экспресс-методы диагностики фенилкетонурии
Фенилкетонурия, или фенилпировиноградная олигофрения, связана с дефектом фермента фенилаланингидроксилазы, вследствие чего нарушается превращение фенилаланина в тирозин. При этом увеличивается содержание фенилаланина и продуктов его обмена (в частности, фенилпировиноградной кислоты) в крови и моче.
Реактивы. Фенилаланин, стандартный раствор 0,06 г/л; растворитель (бутанол, уксусная кислота и вода в соотношении 15:15:10); нингидрин, 0,5%-ный раствор в ацетоне; хлорид железа (III), 10%-ный раствор; набор «Биофан П» (ГДР), содержащий индикаторную бумагу с цветной шкалой.

Оборудование. Хроматографическая бумага 11х11; микропипетки; чашка Петри; ножницы; сушильный шкаф, отрегулированный на 90-100˚С; фильтровальная бумага; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 мл; глазные пипетки.
Материал.

1. 
   Моча, нормальная и патологическая, содержащая фенилпировиноградную кислоту.
   
2. 
   Плазма крови здорового и больного человека с повышенным содержанием фенилаланина.
   

а. Экспресс-определение фенилаланина в плазме крови методом бумажной радиальной хроматографии. Метод основан на различной скорости передвижения фенилаланина по хроматографической бумаге вследствие разности коэффициентов распределения его между неподвижной и подвижной фазами растворителя. Положение аминокислот на хроматограмме, которая представлена в виде концентрических кругов, выявляется нингидриновой реакцией.

Ход определения. Складывают квадрат хроматографической бумаги вчетверо и делают вырез в центре его диаметром около 1 см.

Квадрат хроматографической бумаги простым карандашом делят на секторы, нумеруют их от 1 до 4, отступив от центра выреза на 1 см, и намечают карандашом в каждом секторе кружки для нанесения проб. Помещают квадрат на ножку, сделанную из фильтровальной бумаги в виде трубочки высотой 2 см и вставленную в центральный вырез.

Наносят микропипеткой в обведенный кружок 1-го сектора 0,02 мл стандартного раствора фенилаланина, затем подсушивают пятно с помощью вентилятора и на высушенное место наносят 0,02 мл плазмы крови здорового человека; в кружок 2-го сектора наносят 0,02 мл плазмы здорового человека и 3–й сектор – 0,02 мл плазмы обследуемого больного пациента. Оставляют бумагу на воздухе до полного высыхания нанесенных проб.

В чашку Петри наливают растворитель, кладут бумажный квадрат на края чашки Петри, при этом конец ножки погружается в растворитель. Закрывают чашку крышкой и оставляют при комнатной температуре, пока фронт растворителя не достигает диаметра около 5 см (отметку карандашом сделать заранее). После этого хроматограмму высушивают в сушильном шкафу при 90-100˚С, опрыскивают ее раствором нингидрина и вновь помещают в сушильный шкаф на 10 мин.

В отрицательных пробах (содержание фенилаланина ниже 0,07 г/л) окрашивается пятно нанесенной плазмы и небольшая окружающая часть. Пятно со стандартным раствором фенилаланина (0,06 г/л) и плазмой здорового человека (0,01 г/л) содержит в сумме 0,07 г/л фенилаланина. Исследуемые образцы, дающие такой же или больший ореол, считают положительными. В пробах, взятых у больных фенилкетонурией, обнаруживается четкий ореол диаметром около 3,5 см.

Оформление работы. Зарисовать полученную хроматограмму, сравнить величину окрашенных зон в трех секторах и сделать вывод относительно изменений у больного пациента.

б. Обнаружение фенилпировиноградной кислоты в моче. Метод основан на взаимодействии енольной формы фенилпировиноградной кислоты с хлоридом железа FeCl₃ с образованием комплексного соединения сине-зеленого цвета.

Ход определения. В одну пробирку наливают 0,5 мл мочи здорового, а в другую – больного человека, добавляют по 5 капель раствора хлорида железа (III) и наблюдают за появлением окрашивания.

Эту реакцию дают различные вещества, хотя окраска их соединений с хлоридом железа FeCl₃ неодинакова. При наличии в моче достаточных количеств фенилпировиноградной кислоты развивается сине-зеленое или темно-зеленое окрашивание, исчезающее через 5-10 мин. Сходное окрашивание может давать билирубин мочи.

в. Обнаружение фенилпировиноградной кислоты в моче с помощью набора «Биофан П».

Ход определения. Индикаторную бумажку смочить мочой и через 30 с сравнить окраску индикатора с цветной шкалой.

Оформление работы. Сравнить характер окрашивания в нормальной и патологической моче, сделать вывод о предполагаемой молекулярной болезни и указать причины.

Практическое значение работы. В норме содержание фенилаланина в плазме крови составляет у детей до 1 месяца 75-100 мкмоль/л (0,025-0,05 г/л) и от 2 месяцев до 14 лет 25-75 мкмоль/л. С мочой его экскретируется у детей до года 6,0-24,0 и от года до 14 лет 6,0-72,0 мкмоль/сут. Применяемые пробы на присутствие фенилпировиноградной кислоты в моче здорового ребенка отрицательны.

При фенилкетонурии содержание фенилаланина в крови повышается до 600-2400 мкмоль/л, а выделение с мочой составляет до 3,0-12,0 мкмоль/сут. Пробы на фенилпировиноградную кислоту в моче становятся положительными. Причем содержание ее в суточной моче составляет 0,05-3,0 г или 0,3-18 ммоль.

При поражениях печени (вирусный гепатит, отравление гепатотропными ядами) нарушается гидроксилирование фенилаланина, который вследствие трансаминирования превращается в фенилпировиноградную кислоту. Поэтому у таких больных увеличивается содержание фенилаланина в сыворотке крови и выделение фенилпировиноградной кислоты с мочой соответственно тяжести течения заболевания.

Работа 68. Диагностика тирозиноза пробой Миллона на тирозин

и 4-гидроксифенилпировиноградную кислоту
Тирозиноз связан с недостатком фермента 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы, вследствие чего тормозится превращение 4-гидроксифенилпировиноградной кислоты и тирозина. При этом содержание их в биологических жидкостях увеличивается.
Реактивы. Реактив Миллона^*; L-тирозин, стандартные растворы 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 г/л.

Оборудование. Полоски фильтровальной бумаги 10х20 мм; глазные пипетки.

Материал. Моча, нормальная и патологическая.
Принцип метода см. работу 1, г.

Ход определения. На одну полоску фильтровальной бумаги наносят 1 каплю мочи здорового, а на другую – больного пациента и высушивают полоски на воздухе. На каждое пятно наносят 1 каплю реактива Миллона. Через 2 мин отмечают появление характерного оранжевого окрашивания.

Для полуколичественной оценки результатов на четыре полоски фильтровальной бумаги наносят по 1 капле стандартных растворов тирозина, соответствующих концентраций 0,3; 0,4; 0,5 и 0,6 г/л. Подсушивают полоски на воздухе и в эти же зоны вносят по капле реактива Миллона.

Нижняя граница чувствительности реакции при содержании исследуемых субстанций 0,3 г/л. Сравнивают интенсивность окраски исследуемых проб мочи с цветной шкалой стандартных растворов тирозина и устанавливают примерное содержание определяемых субстанций в моче.

Оформление работы. Зарисовать цветную шкалу тирозина и окраску исследуемых проб мочи, дать полуколичественную оценку последним. В выводе указать на возможность применения пробы Миллона для экспресс-диагностики тирозиноза.

Практическое значение работы. В норме содержание тирозина в плазме крови у детей до 1 месяца составляет 90-140 и у детей от 2 месяцев до 14 лет – 55-110 мкмоль/л; экскреция с мочой этой аминокислоты у детей до года равна 4-30 и от года до 14 лет – 5-88 мкмоль/сут. При тирозинозе концентрация в этих биологических жидкостях увеличивается в 2 раза и более и пробы на присутствие их становятся положительными.

Работа 69. Выявление алкаптонурии пробой

на гомогентизиновую кислоту
Алкаптонурия – наследственное заболевание, связанное с дефектом гомогентизинатоксидазы, осуществляющей превращение гомогентизиновой кислоты в фумарилацетоуксусную. Пи этом заболевании накапливается в средах организма гомогентизиновая кислота.
Реактивы. Гидроксид натрия, 10%-ный раствор; реактив молибдата аммония^*; дигидрофосфат калия, 1%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; глазные пипетки.

Материал. Моча, нормальная и патологическая^*.
а. Проба на гомогентизиновую кислоту со щелочью. Метод основан на окислении гомогентизиновой кислоты кислородом воздуха в щелочной среде с образованием пигментного продукта сине-фиолетового цвета.

Ход определения. В одну пробирку вносят 10 капель нормальной, а в другую – патологической мочи, добавляют по 2 капли раствора гидроксида натрия, встряхивают и наблюдают за изменением окраски 1-2 мин.

Проба положительна при наличии сине-фиолетового окрашивания, свидетельствующего о присутствии гомогентизиновой кислоты.

б. Проба на гомогентизиновую кислоту с молибденовым реактивом. Метод основан на способности гомогентизиновой кислоты восстанавливать молибдат аммония с образованием молибденовой сини (см. работу 11).

Ход определения. В одну пробирку вносят 2 капли мочи здорового, в другую – 2 капли мочи больного пациента. В каждую пробирку добавляют по 10 капель воды и по 4 капли раствора однозамещенного фосфата калия. Пробирки встряхивают.

Проба положительна при наличии синего окрашивания, обусловленного присутствием в моче гомогентизиновой кислоты.

Оформление работы. Отметить наличие гомогентизиновой кислоты в исследуемой моче; в выводе указать на возможность использования применяемых проб для диагностики.

Практическое значение работы. Пробы на гомогентизиновую кислоту используются для диагностики алкаптонурии, так как в норме эта кислота в моче отсутствует.

Работа 70. Выявление цистинурии иод-азидной пробой

на цистин и гомоцистин в моче
Реактивы. Иод-азидный реактив (1,5 г азида натрия растворяют в 50 мл 0,1 М раствора иода и доводят объем до 100 мл этанолом); L-цистин, стандартные растворы концентрации 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 г/л.

Оборудование. Полоски фильтровальной бумаги 10х20 мм; глазные пипетки.

Материал. Моча, нормальная и патологическая^*.
Метод основан на способности иод-азидного реактива обесцвечиваться в присутствии цистина или гомоцистина.

Ход определения. На две полоски фильтровальной бумаги наносят по 1 капле нормальной и патологической мочи, высушивают на воздухе и на высушенные пятна добавляют по 1 капле иод-азидного реактива.

На четыре полоски фильтровальной бумаги наносят по 1 капле стандартных растворов цистина, высушивают на воздухе и добавляют на высушенные участки по 1 капле иод-азидного реактива.

Проба считается положительной, если окраска реактива выцветает в течение 5 мин. Нижняя граница чувствительности метода 0,3 г/л. Реакцию оценивают по шкале стандартов цистина от 0,3 до 0,6 г/л.

Оформление работы. Сравнить пробы с нормальной и патологической мочой; по шкале стандартов цистина определить примерное содержание его в моче больного пациента.

Практическое значение работы. Цистинурия – молекулярная патология, возникающая из-за недостатка белка, участвующего в транспорте и реабсорбции в канальцах почек цистина и гомоцистина. В норме с мочой цистина выделяется 4-350 мкмоль/сут. При цистинурии его экскреция повышается до 1-4 ммоль/сут. Для обнаружения наследственной или приобретенной цистинурии используется иод-азидная проба во время массовых обследований детского контингента. Своевременная диагностика позволяет снизить осложнения, наблюдающиеся при этом заболевании, а именно: образование цистиновых камней в почках. При проведении иод-азидной пробы следует учитывать ложно-положительную реакцию ангидрида аргининоянтарной кислоты, ацетона, некоторых лекарственных средств.

2. Экспресс-диагностика патологий углеводного обмена