практикум по биохимии. Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,
 Скачать 1.79 Mb.
|
Работа 71. Выявление пентозурии пробой БиаляПентозурия возникает из-за недостатка белка, участвующего в транспорте пентоз и способствующего их реабсорбции в канальцах почек. Реактивы. Орциновый реактив*. Оборудование. Штатив с пробирками; водяная баня; пипетки вместимостью 5 мл. Материал. Моча, нормальная и патологическая*. Принцип метода см. работу 16, б. Ход определения. В две пробирки отмеривают по 5 мл орцинового реактива и по 1 мл соответственно нормальной и патологической мочи. Затем осторожно нагревают на водяной бане до закипания. При наличии в моче пентоз развивается яркая желто-зеленая окраска. Оформление работы. Сравнить окраску проб нормальной и патологической мочи и сделать вывод о возможности использования данной реакции для диагностики пентозурии. Работа 72. Выявление фруктозурии пробой СеливановаРеактивы. Резорцин, 0,05%-ный раствор в 20%-ной соляной кислоте. Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 2 мл; водяная баня. Материал. Моча, нормальная и патологическая*. Метод основан на превращении фруктозы при нагревании и в присутствии соляной кислоты в гидроксиметилфурфурол, который конденсируется с резорцином, образуя соединение красного цвета. Ход определения. В две пробирки наливают по 1 мл раствора резорцина и добавляют в одну из них 2 мл нормальной, а в другую – патологической мочи. Обе пробирки нагревают в водяной бане до закипания. При наличии в моче фруктозы появляется интенсивное красное окрашивание. Оценку пробы производят в момент закипания; при более длительном нагревании положительную реакцию может дать и глюкоза. Оформление работы. Сравнить окраску исследуемых проб и сделать вывод о практическом применении пробы Селиванова. Работа 73. Выявление мукополисахаридозов пробойс толуидиновым синим на мукополисахаридыМукополисахаридозы – врожденное нарушение обмена кислых гетерополисахаридов. При этом заболевании появляются мукополисахариды в моче. Аналогичное явление наблюдается также при ревматоидном артрите и других повреждениях соединительной ткани. Реактивы. Толуидиновый синий, 0,1%-ный раствор в водном ацетоне, разведенном с водой в соотношении 4:1; уксусная кислота, 10%-ный раствор. Оборудование. Полоски фильтровальной бумаги 10х20 мм; глазные пипетки. Материал. Моча, нормальная и патологическая*. Метод основан на образовании окрашенных продуктов (пурпурного цвета) при взаимодействии мукополисахаридов с толуидиновым синим в кислой среде. Ход определения. На одну полоску фильтровальной бумаги наносят каплю нормальной мочи, на вторую – каплю патологической. Полностью высушивают их при комнатной температуре и помещают в раствор толуидинового синего. Через 1 мин бумажки вынимают из красящего раствора и отмывают в растворе уксусной кислоты. Проба положительна при развитии пурпурной окраски, говорящей о наличии мукополисахаридов в моче. Оформление работы. Отметить наличие окрашивания, сделать вывод о возможности практического использования данной пробы. Практическое значение работы. Полуколичественные методы анализа субстанций называются «просеивающими» или скрининг-тестами. Они позволяют осуществлять отбор больных с предполагаемыми наследственными или приобретенными дефектами обмена; их применяют при массовом обследовании больших контингентов детей для выявления наиболее распространенных и новых молекулярных болезней, при которых повышено выделение углеводов и продуктов их обмена. Эти вещества дают положительные реакции при проведении скрининг-тестов. В дальнейшем при выявлении молекулярной патологии проводится тщательное биохимическое обследование с помощью точных количественных методов. Работа 74. Определение содержания порфобилиногена в мочеРеактивы. Реактив Эрлиха*, насыщенный раствор натрия ацетата; хлороформ; бутиловый спирт; бумага индикаторная для измерения рН (в интервале 4,0-5,0). Оборудование. Пипетки на 5,0 и 10 мл; штатив с пробирками; центрифуга лабораторная с центрифужными пробирками. Материал. Моча (подвергается исследованию в течение 2-3-х часов после мочеиспускания). Метод основан на взаимодействии порфобилиногена с п-диметилами нобензальдеги дом с образованием соединения, окрашенного в красный цвет. Ход определения. В пробирке смешивают 2,5 мл реактива Эрлиха и 2,5 мл мочи. Добавляют 5 мл насыщенного раствора ацетата натрия и перемешивают стеклянной палочкой. Затем измеряют рН индикаторной бумагой, значение рН должно быть в интервале 4,5-5,0, если рН меньше 4,0 добавляют раствор ацетата натрия для установления нужного рН. Если окраска не образуется – результат отрицательный. При образовании розовой или красной окраски добавляют 5 мл хлороформа и встряхивают. Если окраска переходит в слой хлороформа, а верхний водный слой становится бесцветным или желтым – результат отрицательный. При сохранении окрашивания водной фазы переносят 6-8 мл водного слоя в другую пробирку, добавляют бутиловый спирт в соотношении 2:1 и встряхивают. Обычно фазы разделяются быстро, в противном случае смесь центрифугируют. При переходе окраски в бутиловый слой результат отрицательный, а если водная фаза остается окрашенной – результат положительный для порфобилиногена. Примечание. При хранении мочи свыше 3-х часов при комнатной температуре реакция может быть ложноотрицательной, что, по-видимому, связано с превращением порфобилиногена в порфирины и образованием ингибиторов реакции. Если нет возможности исследовать мочу в первые 2-3 часа, ее хранят в холодильнике при 4˚С или в замороженном состоянии. При хранении в холодильнике и доведении рН мочи до 6,0-7,0 порфобилиноген стабилен длительное время. Оформление работы. Отметить характер развившегося окрашивания, сделать вывод о возможности практического использования данного определения. Практическое значение работы. В норме порфобилиноген в моче не обнаруживается (0,2 мг/л). Данным методом он выявляется при концентрации, превышающей 6 мг/л ) при различных формах печеночных порфирий – острая перемежающая, копропротопорфирия, наследственная копропорфирия). Работа 75. Количественное определение содержания дельта-аминолевулиновой кислоты в моче Реактивы. Уксусная кислота ледяная; хлорная кислота 57%; натрия ацетат 3-х водный; дельта-аминолевулиновая кислота гидрохлорид; уголь активированный с дисперсностью 0,25-1 мм; ацетил-ацетон; п-диметиламинобензальдегид; ацетатный буфер рН 3,6*; взвесь угля*; реактив Эрлиха*; беззольные фильтры (синяя лента), калибровочный раствор*. Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки вместимостью 0, 1, 2,0 и 10 мл; пробирки с притертыми пробками; спектрофотометр. Материал. Моча. Хранится в холодильнике, рН мочи должен быть равен 6,0, для чего добавляют на 10 мл мочи 0,1 мл ледяной уксусной кислоты. Метод основан на способности дельта-аминолевулиновой кислоты взаимодействовать с п-диметиламинобензальдегидом после удаления порфобилиногена и других мешающих определению веществ с помощью активированного угля. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации данной кислоты в пробе. Ход определения. К 1 мл мочи в пробирке с притертой пробкой добавляют 9 мл взвеси активированного угля в ацетатном буфере рН 3,6. Суспензию взбалтывают 1 минуту и фильтруют через бумажный фильтр. В две пробирки (контрольную и опытную) отбирают по 2 мл фильтрата. В опытную пробу добавляют 0,05 мл ацетилацетона, в контрольную – такое же количество ацетатного буфера. Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Затем пробирки помещают на 20 минут в кипящую водяную баню, охлаждают, доводят объем жидкости ацетатным буфером до 2 мл и в каждую пробирку добавляют по 2 мл реактива Эрлиха, перемешивают. Через 15 минут спектрофотометрируют опытную пробу против контрольной при длине волны 553 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска раствора стабильна в течение часа. Расчет. Содержание дельта-аминолевулиновой кислоты проводят по калибровочному графику, условия построения которого представлены в таблице.
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||