практикум по биохимии. Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,
 Скачать 1.79 Mb.
|
      ПРЕДИСЛОВИЕПрактикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды, биохимия пищеварения, обмен углеводов, белков, молекулярной патологии и особенно в разделе исследований биологических жидкостей. Практикум содержит лабораторные работы разной степени сложности, позволяющие студентам приобрести навыки самостоятельного биохимического анализа материала. Ряд работ можно использовать при проведении студентами учебно-исследовательской и научной работы. Каждый раздел имеет краткое введение и ссылки на учебник Е.А.Строева «Биологическая химия». В начале каждой работы приведен перечень реактивов, оборудования и материалов, требуемых для ее выполнения. Прописи приготовления некоторых многокомпонентных реактивов, буферных растворов и перечень биохимических констант вынесены в приложение. В практикуме представлено значительное число унифицированных методов, применяемых в клинике для диагностики заболеваний, приведены скрининг-тесты, для выявления молекулярных болезней, биохимические методы анализа лекарственного растительного сырья и биогенных препаратов. Кроме того, при описании лабораторных работ кратко излагается практическое использование данного метода в медицинской, фармацевтической и биохимических исследованиях. При переработке практикума авторы руководствовались опытом преподавания биохимии на лечебном, фармацевтическом факультетах Рязанского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова. ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ Биохимические исследования проводятся для получения информации о многочисленных химических и физикохимических процессах, протекающих в клетках и тканях живых организмов в норме и при патологии. В зависимости от цели исследования используются специальные приемы обработки биологического материала и соответствующие физикохимические методы, которыми студенты овладевают при выполнении биохимического практикума. Однако прежде чем приступить к изучению конкретных методик исследования, необходимо познакомиться с некоторыми общими положениями и приемами практической биохимии. I. Материал и его подготовка для биохимических исследований Объект биохимических исследований. В экспериментальных условиях можно получить любой биологический материал для биохимических исследований. В клинике такие возможности ограничены. Для клинико-биохимических анализов используют: а) биологические жидкости внутренних сред организма – плазму (или сыворотку) крови, спинно-мозговую жидкость, лимфу, амниотическую, внутрисуставную и внутриглазную жидкости, а также эксудат и транссудат; б) биологические выделения (экскреты) – мочу, желчь, слюну, желудочный и кишечный соки, кал, пот, слезную жидкость, женское молоко и молозиво, семенную жидкость, слизистые выделения. Получение этих жидкостей и экскретов относительно несложно и безвредно. В то же время изучение биохимических процессов непосредственно в клетках, тканях и органах человека сопряжено с большими трудностями. Прижизненное взятие кусочков тканей и органов – биопсия – осуществляется во время операции или с помощью специального инструментария, что позволяет получить материал для исследований – биоптат. Ввиду сложности, а порой и небезвредности получения биоптатов их используют для биохимических анализов в клинике относительно редко. Лишь клетки крови, процедура получения которых проста, все чаще служат объектом обстоятельных клинико-биохимических лабораторных исследований. В судебно-медицинских целях и для более обстоятельного изучения причин и исхода болезни проводятся посмертные биохимические анализы тканей и органов. Объектом биохимических исследований в фармацевтической практике служит биологический материал животных и сами лекарственные препараты. Взятие для анализа биологического материала экспериментальных животных используется при стандартизации и контроле качества лекарств. Например, по концентрации глюкозы в крови проводится стандартизация и контроль качества препаратов инсулина. В то же время анализ таких биологических препаратов, как ферментные, проводится только биохимическими методами. Получение и хранение проб для биохимических исследований. Точность биохимического анализа зависит от правильного отбора и при необходимости хранения проб биологического материала. Остановимся на ряде общих положений этого раздела. Моча чаще всего исследуется в клинико-биохимических лабораториях. Для этой цели, как правило, собирают в стеклянную или полиэтиленовую бутыль суточную мочу (для специальных случаев собирают ее порционно) и хранят в холодильнике. Иногда анализируют отдельно ночную и дневную порции мочи. Бактериальные загрязнения обычно мало влияют на результаты исследования мочи, но если необходимо задержать рост микроорганизмов, то добавляют консервант, например, толуол. При некоторых специальных исследованиях, например, при определении стероидных гормонов и их метаболитов, в мочу добавляют концентрированную HCl (из расчета 10мл на 1 л мочи) и т.д. При определении ферментов целесообразно проводить анализ свежевыпущенной мочи. Для сбора мочи у мелких лабораторных животных (белые крысы или мыши) их помещают в стеклянные выделительные воронки (рис.1), обычно на 12 или 24 ч. Моча через стеклянную воронку для фильтрования, в отверстие которой вставлен стеклянный «гвоздик» (для задержки фекалий), стекает в мерный цилиндр. Кровь для исследования берут утром натощак. Капиллярную кровь получают чаще всего из пальца руки, у маленьких детей ее берут путем прокола мочки уха, большого пальца ноги или пятки. На лабораторных занятиях обычно используется для биохимических исследований капиллярная кровь. Техника взятия крови из пальца для лабораторного анализа. Как правило, кровь берут из безымянного пальца левой руки. Если по каким-то причинам это сделать невозможно, то ее получают из любого другого пальца. Сначала участок кожи пальца обследуемого очищают ватным тампоном, смоченным этиловым спиртом, а затем эфиром. Левой рукой захватывают безымянный палец левой руки обследуемого и слегка сдавливают мякоть пальца в месте предполагаемого укола. Наиболее удобно делать укол в мякоть пальца слева от срединной линии, несколько отступя от ногтя. Прокол кожи производят стерильной иглой одноразового пользования, причем иглу располагают строго перпендикулярно относительно места укола и вводят почти на всю длину ее острия, рассекая кожу поперек папиллярных линий (это способствует большему зиянию ранки и более длительному кровотечению). Появившуюся каплю крови удаляют ватным тампоном. Затем кровь, свободно выделяющуюся из ранки или после легкого надавливания на мякоть пальца, берут для анализа с помощью микропипетки, обычно предварительно смоченной антикоагулянтом (противосвертывающим веществом). Кончиком микропипетки следует касаться капель выступающей крови, избегая попадания в нее пузырьков воздуха. Кончик микропипетки, куда забирают кровь, должен располагаться несколько выше, чем другой ее конец, что помогает лучшему поступлению крови в микропипетку. После того как кровь будет взята, к ранке прикладывают ватный тампон, смоченный настойкой иода, и прижимают палец к ладони до остановки кровотечения. Для получения большого количества крови ее берут из локтевой вены (у маленьких детей из подкожных вен головы) обязательно с соблюдением необходимых мер предосторожности. В зависимости от целей биохимическому исследованию может подвергаться цельная кровь или ее составные части – форменные элементы (клетки), плазма или сыворотка. Если для анализа необходимы плазма и клетки крови, то взятую из вены кровь смешивают в пробирке с подходящим антикоагулянтом, который предотвращает ее свертывание. В качестве антикоагулянта обычно используют раствор оксалата или цитрата натрия (концентрации 0,1 моль/л), который связывает ионы кальция в крови и не дает ей свернуться. В тех же целях применяется и гепарин, которого добавляют около 2 мг на 10 лмл крови. Благодаря большому отрицательному заряду он взаимодействует с белками, участвующими в свертывании крови, и препятствует образованию сгустка. Взятую цельную кровь с добавлением антикоагулянтов используют для получения плазмы и форменных элементов путем центрифугирования. Для получения сыворотки кровь собирают в сухую пробирку без антикоагулянта и оставляют свертываться, помещая пробирку в холодильник на ночь. Выделившуюся после образования сгустка сыворотку отсасывают пипеткой и используют для анализа. Сыворотка отличается от плазмы тем, что в ней отсутствуют фибриноген и другие белки крови, участвующие в ее свертывании и вошедшие в сгусток. Взятую кровь хранят в холодильнике. Другие биологические жидкости и экскреты берут, как правило, с помощью специального инструментария и хранят в холодильнике. Биоптаты получают с помощью скальпеля или специальных игл для биопсии, или с помощью специальной эндоскопической техники, снабженной инструментом для взятия кусочков ткани. Хранить ткани можно в замороженном состоянии при -20С. Перед исследованием их размораживают. Обработка биологического материала. В зависимости от вида биохимического исследования полученный биологический материал обычно подвергают предварительной обработке. Как правило, при проведении исследования требуется определить содержание какого-нибудь нормального или патологического компонента в биологическом материале или изучить отдельные биохимические реакции, катализируемые ферментами. Плазма или сыворотка крови и другие биологические жидкости (включая экскреты) представляют собой смесь различных природных веществ, растворенных в водной среде. При определении ферментов биологическую жидкость используют для исследования целиком, не подвергая какой-либо обработке. Лишь при высокой концентрации фермента в средах их перед определением разводят. В то же время присутствие ферментов часто мешает определению в биологических жидкостях тех веществ, превращение которых они катализируют. Поэтому полученный материал сразу обрабатывают реактивом, прекращающим действие ферментов, и осаждающим как ферментные, так и любые другие белки. Для осаждения используют трихлоруксусную, хлорную, азотную, фосфорно-вольфрамовую, серную и другие кислоты, гидроксид бария с сульфатом цинка или просто термическую обработку биологического материала. При биохимическом исследовании клеток, тканей и органов приемы их обработки усложняются, поскольку изучаемый компонент может быть локализован в каком-либо органоиде или даже его части, например, в мембране. Поэтому сначала клетки или ткань подвергают разрушению различными способами. Чаще всего применяют механическое разрушение ткани с помощью гомогенизатора. Он представляет собой стеклянный стакан, форма которого и размеры могут быть различны. В этот стакан помещают кусочек ткани, измельченный ножницами, и соответствующую жидкую среду (обычно раствор сахарозы, хлорида калия), позволяющую сохранить интактность выделяемых структурных образований клетки. Растирание ткани осуществляется при движении вверх и вниз вращающегося в стакане гомогенизатора пестика, который соединен через привод с осью электромоторчика. На время гомогенизации стакан гомогенизатора помещают в лед, чтобы избежать нагревания и повреждения субклеточных структур. В простейшем случае гомогенат получают, растирая ткань с толченым стеклом или кварцевым песком в фарфоровой ступке. Возможно также разрушение ткани и клеток высокочастотными ультразвуковыми колебаниями и с помощью «осмотического шока». Последний метод используют при разрушении эритроцитов и других клеток крови. Он заключается в том, что при добавлении дистиллированной воды мембрана клеток разрывается от избыточного внутриклеточного осмотического давления. Гомогенизация ткани и разрушение клеток – стадия обработки, предшествующая разделению клеточных компонентов. 2. Основные методы разделения и выделения веществ при биохимиеских иследованиях Гомогенаты представляют собой сложную смесь частиц, отличающихся по размеру, форме и химическому составу. Для разделения и выделения этих частиц, а также молекул, содержащихся в биологическом материале, используются различные методы, которые суммированы в табл.1. Таблица 1. Основные методы разделения и выделения веществ, применяемые при биохимических исследованиях (по В.В.Меньшикову, с дополнениями)
3. Основные приборы, используемые в практикуме При проведении биохимических исследований используются различные приборы и оборудование, позволяющие выделить изучаемое вещество и определить его содержание в биологическом материале. |