практикум по биохимии. Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,
 Скачать 1.79 Mb.
|
|
Оформление работы. Рассчитать содержание креатина и креатинина в исследуемой пробе и в выводах дать оценку полученным результатам, сравнивая с нормой. Практическое значение работы. Креатинин, наряду с мочевиной и солями аммония являются нормальными продуктами азотистого обмена и на его долю приходится около 2,5-7% всего азота мочи. Креатинина в норме выделяется с мочой: 4,4-17,7 ммоль/сутки или 0,5-2,0 г/сутки. В норме моча взрослых людей креатина не содержит. У детей имеет место физиологическая креатинурия, поэтому в моче он обнаруживается в небольших количествах. Появление креатина в моче взрослого человека связано с нарушением обмена креатина и наиболее часто встречается при поражении мышечной ткани (мышечная дистрофия, мышечная атрофия, миастения, миозит, миотония), Е-авитаминозе, при тонических судорогах, усиленном распаде тканевых белков. При этом содержание креатинина в моче понижается. 2. Изучение обмена нуклеиновых кислот и нуклеотидов Распад нуклеиновых кислот и их мономеров до конечных продуктов можно выразить следующей схемой: Нуклеиновые → Нуклеотиды → Пурины, → Мочевая кислота, кислоты пиримидины β-аланин и аммиак О состоянии нуклеинового и нуклеотидного обмена судят по активности ферментов, участвующих на разных стадиях их распада и превращения, а также по содержанию мочевой кислоты – конечного продукта обмена пуриновых оснований. Работа 63. Определение активности кислой дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) в сыворотке крови по А.А.Покровскому, А.И.Арчакову и О.Н.Любимцевой Реактивы. ДНК, 1 г/л раствор в ацетатном буфере, 0,1 М с рН 5,0; хлорная кислота, 0,5 М раствор. Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; термостат, отрегулированный на 37˚С; холодильник; центрифуга с центрифужными весами; часы; спектрофотометр. Материал. Сыворотка крови. Метод основан на спектрофотометрическом измерении при 260 нм кислоторастворимых продуктов гидролиза ДНК, образующихся под действием ДНКазы, содержащейся в исследуемом материале: ДНК, ДНКаза высокополимерная ———— (n + 1) фрагментов ДНК + nН2О Ход определения. В опытную и контрольную пробирки отмеривают по 1,2 мл раствора ДНК. Затем в опытную пробу добавляют 0,2 мл сыворотки крови и перемешивают содержимое встряхиванием. Помещают обе пробы на 30 мин в термостат при 37˚С, после чего в контрольную пробирку приливают 1,6 мл хлорной кислоты и 0,2 мл сыворотки крови, а в опытную – такой же объем хлорной кислоты. Содержимое проб перемешивают. Ставят пробирки на 30 мин в холодильник при 4˚С, а затем обе пробы центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин (для осаждения негидролизованной ДНК). Надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки и измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на спектрофотометре при 260 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Расчет проводят по формуле х =Е2602∙500 , где х – активность ДНКазы в Е260/г∙л; 2 – коэффициент пересчета на 1 час; 500 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови; Оформление работы. Рассчитать активность фермента в исследуемом материале, сделать вывод о присутствии кислой ДНКазы в сыворотке крови и практическом значении работы. Практическое значение работы. Кислая ДНКаза сосредоточена в лизосомах клеток различных тканей, поэтому в научных исследованиях определение этого энзима используют для контроля чистоты выделяемой фракции лизосом. Кроме того, кислая ДНКаза является индикатором повреждения или повышенной проницаемости мембран лизосом, что имеет практическое значение при оценке действия лизосомотропных препаратов и патологического процесса. Работа 64. Определение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови по методу Мюллера и Зейферта Реактивы. Реактив Фолина*; трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор; карбонат натрия, насыщенный раствор; мочевая кислота, стандартный раствор 0,02 мг/мл, свежеприготовленный. Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК. Материал. Сыворотка крови. Метод основан на способности мочевой кислоты восстанавливать фосфорновольфрамовый реактив (реактив Фолина) с образованием соединений, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации данной кислоты. Ход определения. В центрифужную пробирку вносят по 1,5 мл сыворотки крови, дистиллированной воды и трихлоруксусной кислоты. Содержимое пробирки перемешивают, через 5 мин центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин. Берут две чистые градуированные пробирки: опытную и стандартную; добавляют в них реактивы в соответствии с таблицей.
|