Главная страница
Навигация по странице:

  • Работа 57. Определение активности аспартат- и аланин- аминотрансферазы в сыворотке крови по Райтману и Френкелю

  • Работа 58. Определение активности гистидазы в сыворотке крови по Табору и Мелеру в модификации В.А.Буробина

  • практикум по биохимии. Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,


    Скачать 1.79 Mb.
    НазваниеПрактикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,
    Анкорпрактикум по биохимии.docx
    Дата02.05.2017
    Размер1.79 Mb.
    Формат файлаdocx
    Имя файлапрактикум по биохимии.docx
    ТипПрактикум
    #6494
    страница24 из 39
    1   ...   20   21   22   23   24   25   26   27   ...   39

    Катепсины


    Глобин ——————— (n + 1) Фрагменты глобина

    + nН2О
    Экстинкцию кислоторастворимых продуктов гидролиза глобина (пептиды, свободные аминокислоты) измеряют при 280 нм на спектрофотометре. В этой области спектра в основном поглощает тирозин и в меньшей степени триптофан и фенилаланин.

    Ход определения. В опытную пробирку вносят 1 мл раствора гемоглобина и 0,5 мл сыворотки крови, а в контрольную – те же вещества в том же объеме и 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Пробы перемешивают встряхиванием.

    Ставят пробирки на 60 мин в водяную баню при 37˚С, после этого приливают к опытной пробе 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают содержимое встряхиванием. Центрифугируют пробы 10 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки.

    Измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на спектрофотометре при 280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

    Расчет. Проводят с использованием калибровочного графика на тирозин или молярного коэффициента экстинкции тирозина:
    Е5000

    х = —————— ,

    0,436

    где х – активность катепсинов, ммоль тирозина/(ч∙л);

    Е – экстинкция опытной пробы против контрольной;

    5000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

    0,436 – коэффициент экстинкции 1 ммоля тирозина.

    Оформление работы. По экстинкции рассчитать активность катепсинов в сыворотке крови, сделать вывод и отметить практическое значение определения данного фермента.

    Практическое значение работы. Катепсины, гидролизующие белки в кислой зоне рН, специфичны для лизосом тканей, поэтому в научных исследованиях их определяют как индикаторы чистоты лизосомальной фракции. При поражении органов, особенно при некрозах, активность катепсинов в сыворотке крови увеличивается. Это явление отмечено при инфаркте миокарда, причем степень повышения ферментативной активности в сыворотке крови зависит от глубины и распространенности некротического очага в сердце.

    Работа 57. Определение активности аспартат- и аланин-

    аминотрансферазы в сыворотке крови по Райтману и Френкелю
    Реактивы. Субстратные растворы № 1 и № 2*; 2,4-динитрофенилгидразин, 0,1%-ный раствор на 2 М растворе соляной кислоты; гидроксид натрия, 0,4 М раствор.

    Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,2; 1 и 5 мл; водяная баня; ФЭК.

    Материал. Сыворотка крови.
    Метод основан на определении пировиноградной кислоты, которая является одним из продуктов реакции, катализируемой аланинаминотрансферазой, или продуктом декарбоксилирования оксалацетата, образующегося в реакции, катализируемой аспартатаминотрансферазой. Образовавшаяся пировиноградная кислота определяется по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (см. работу 31).

    Ход определения. Определение активности ферментов проводят по схеме

    Последовательность операций

    АлАТ

    АсАТ


    опыт

    контроль

    опыт

    контроль

    Внесение субстратных растворов

    Раствор

    № 1 – 0,5мл

    Раствор

    № 1 – 0,5мл

    Раствор

    № 2 – 0,5мл

    Раствор

    № 2 – 0,5мл

    Нагревание

    5 мин при 37˚С

    5 мин при 37˚С

    Добавление 2,4-ДНФГ

    -

    1,0 мл

    -

    1,0 мл

    Добавление сыворотки

    0,1 мл

    0,1 мл

    0,1 мл

    0,1 мл

    Инкубация

    30 мин при 37˚С

    60 мин при 37˚С

    Добавление 2,4-ДНФГ

    0,5 мл

    -

    0,5 мл

    -

    Экспозиция

    20 мин при 18-20˚С

    20 мин при 18-20˚С

    Добавление гидроксида натрия

    5,0 мл

    5,0 мл

    5,0 мл

    5,0 мл

    Экспозиция

    10 мин при 18-20˚С

    10 мин при 18-20˚С

    Фотометрируют опытные пробы против контрольной на ФЭКе при 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см.

    Расчет производят по формулам:
    m10000 m10000∙2

    х(АсАТ) = ———— или х(АлАТ) = ———— ,

    1000 1000

    где х – активность ферментов, ммоль/(ч∙л);

    m – количество пировиноградной кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику (рис. 9), мкмоль;

    10000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки;

    1000 – коэффициент пересчета мкмоль в ммоль;

    2 – для пересчета на 1 ч.

    Практическое значение работы. В норме активность аланинаминотрансферазы составляет 0,1-0,68, а аспартатаминотрансферазы 0,1-0,45 ммоль/(ч∙л).

    Определение активности АсАТ и АлАТ и их отношения широко используется в клинической практике для выявления патологических процессов в различных органах. В миокарде более высокая активность АсАТ, чем АлАТ, в печени обратное соотношение активности этих ферментов. При инфаркте миокарда значительно увеличивается активность АсАТ в сыворотке крови с одновременным повышением коэффициента АсАТ/АлАТ. При поражении печени (цирроз, сывороточный гепатит и т.д.) более выраженно повышается активность АлАТ и снижается коэффициент АсАТ/АлАТ.

    Работа 58. Определение активности гистидазы в сыворотке крови

    по Табору и Мелеру в модификации В.А.Буробина
    Реактивы. L-гистидина моногидрохлорид, 0,2 М раствор (418 мг в 100 мл), доведенный с помощью 1 М раствора NaOH до рН 8,2; пирофосфатный буфер, 0,1 М раствор с рН 8,2*; трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор; активирующий раствор, содержащий восстановленный глутатион и альбумин*; уроканиновая кислота, 0,001 М раствор для построения калибровочного графика (8,7 мг дигидрата уроканиновой кислоты растворяют в 0,001 М растворе NaOH в мерной колбе вместимостью 50 мл).

    Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; водяная баня с лабораторным термометром; термостат, отрегулированный на 37˚С; центрифуга с центрифужными весами; спектрофотометр.

    Материал. Сыворотка крови.
    Метод основан на измерении экстинкции уроканиновой кислоты, образующейся из гистидина под действием гистидазы, в зоне ее максимального поглощения при 264 нм в кислой среде.

    Ферментативная реакция протекает по уравнению



    Ход работы. В две пробирки – контрольную и опытную – вносят по 0,3 мл пирофосфатного буфера, по 0,5 мл исследуемой сыворотки и по 1 мл активирующего раствора. В опытную пробирку приливают 1 мл раствора гистидина и доводят объем пробы до 3 мл дистиллированной водой. Перемешивают содержимое встряхиванием.

    Обе пробирки помещают на 2 ч в водяную баню или термостат при 37˚С, затем добавляют в пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. После этого в контрольную пробу приливают 1 мл активирующего раствора, объем ее доводят до 3 мл дистиллированной водой и перемешивают содержимое встряхиванием.

    Пробы центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин, после чего надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки.

    Измеряют экстинкцию опытной работы против контрольной на спектрофотометре при 264 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

    Для построения калибровочного графика в семь пронумерованных пробирок вносят компоненты, перечисленные в приведенной ниже таблице, в указанных количествах.

    Для приготовления рабочего раствора уроканиновой кислоты берут ее исходный 0,001 М раствор и разбавляют в 10 раз дистиллированной водой.

    Доводят объем всех проб до 3 мл дистиллированной водой, добавляют во все пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают содержимое. Центрифугируют пробы 5 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки и измеряют экстинкцию, как указано выше.

    №№ пробы

    Рабочий раствор уроканиновой кислоты, мл

    Пирофосфатный буфер, мл

    Активирующий раствор, мл

    Раствор гистидина, мл

    Содержание уроканиновой кислоты в пробе, мкмоль

    1

    0

    0,3

    1,0

    1,0

    0

    2

    0,05

    0,3

    1,0

    1,0

    0,005

    3

    0,10

    0,3

    1,0

    1,0

    0,010

    4

    0,15

    0,3

    1,0

    1,0

    0,015

    5

    0,20

    0,3

    1,0

    1,0

    0,020

    6

    0,30

    0,3

    1,0

    1,0

    0,030

    7

    0,40

    0,3

    1,0

    1,0

    0,040


    Расчет производят по формуле
    1   ...   20   21   22   23   24   25   26   27   ...   39


    написать администратору сайта