практикум по биохимии. Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,
 Скачать 1.79 Mb.
|
|
Практическое значение работы. Цитохромоксидаза как гемсодержащий белок очень чувствительна к действию цианидов, сульфидов, азидов и прочих веществ, взаимодействующих с железом гема. При отравлении этими соединениями происходит угнетение цитохромоксидазы и развивается гистотоксическая гипоксия, т.е. кислородное голодание тканей, связанное с невозможностью использовать кислород как акцептор электронов и протонов в дыхательной цепи митохондрий. Метод выявления цитохромоксидазы реактивом НАДИ используется в клинике и цитологии для выявления этого фермента в биоптатах и мазках клеток крови с целью диагностики нарушений тканевого дыхания. Работа 40. Демонстрация процесса окислительного фосфорилирования и действия на него разобщителей Для исследования окислительного фосфорилирования определяют величину поглощения кислорода в тканях и одновременно убыль добавленного в среду неорганического фосфата. Это позволяет вычислить коэффициент фосфорилирования – Р/О. Потребление кислорода тканями при окислении субстратов не является достоверным показателем интенсивности окислительного фосфорилирования, поскольку кислород расходуется и в других, немитохондриальных, реакциях. Кроме того, активная утилизация его еще не означает аналогичного по интенсивности фосфорилирования, т.е. эти два процесса могут быть в той или иной степени разобщены. Использование неорганического фосфата в реакции этерификации: Фн+АДФ→АТФ происходит не только в ходе окислительного фосфорилирования, но и в гликолизе. При отсутствии в среде субстратов гликолиза или при ингибировании его и при создании необходимых условий для функции дыхательной цепи митохондрий можно считать, что почти весь Фн расходуется в ходе окислительного фосфорилирования и его убыль является индикатором этого процесса. Реактивы. Хлорид калия, 0,15 М раствор; К-фосфатный буфер (рН 7,4), приготовленный из KH2PO4 (содержание неорганического фосфора 0.1 моль/л); малат натрия, 0,16 М раствор; хлорид магния, 0,6 М раствор; фторид натрия, 5,7 М раствор; АДФ, динатриевая соль, 9,1∙10-2 М раствор; сукцинат натрия, 0,3 М раствор; 2,4-динитрофенол, 0,01 М раствор; азид натрия, 1 М раствор; трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; реактив молибдата аммония*; аскорбиновая кислота, 1%-ный раствор на 0,1 М растворе соляной кислоты. Оборудование. Штатив с пробирками; гомогенизатор с пестиком из тефлона; моторчик для гомогенизации; пипетки вместимостью 1 мл; бюретка вместимостью 25 мл; стеклянные палочки; воронка со складчатым бумажным фильтром; водяная баня с лабораторным термометром или баня аппарата Варбурга; часы; ФЭК. Материал. Печень белой крысы. Метод основан на измерении расхода добавленного неорганического фосфата Фн в ходе реакции окислительного фосфорилирования в митохондриях, содержащихся в гомогенатах печени. Использование Фн в гликолизе блокируется содержащимся в среде инкубации фторидом натрия. О действии разобщителя (2,4-динитрофенол) и ингибитора (азид натрия) окислительного фосфорилирования также судят по убыли неорганического фосфата в присутствии малата как субстрата окисления. Неорганический фосфат утилизируется по схеме H3PO4 + АДФ → АТФ + H2O Определение содержания Фн до и после инкубации основано на реакции, приведенной в работе 11. Ход определения. Животное забивают, извлекают печень и погружают ее в чашку Петри с раствором хлорида калия, стоящую на льду или на снегу. Тщательно промывают печень от крови средой выделения и промокают фильтровальной бумагой. Навеску около 2 г отмытой ткани печени переносят на часовое стекло или в чашку Петри, стоящую на льду, и мелко измельчают ножницами. Измельченную ткань помещают в стакан гомогенизатора, куда предварительно налито 18 мл охлажденного раствора хлорида калия. Стакан гомогенизатора помещают в лед или снег, находящийся в мешочке. Ткань гомогенизируют в течение 40-50 с при вращении пестика 800-1200 об/мин, делая 40-50 движений стаканчика вверх-вниз. В пять пробирок наливают по 1 мл инкубационной смеси следующего состава:
Вносят во все пробы по 2 мл полученного гомогената печени, перемешивают стеклянной палочкой и помещают в штатив водяной бани при 37˚С, снабженной устройством для встряхивания пробирок. Отмечают время начала инкубации. Через 30 мин инкубации реакции во всех пробах останавливают, добавляя к каждой по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Содержимое их перемешивают и фильтруют в другие пробирки через складчатый бумажный фильтр. Из каждой пробы отбирают по 1 мл безбелкового фильтрата в чистые пробирки и приливают к ним по 1 мл реактива молибдата аммония и по 1 мл раствора аскорбиновой кислоты. Перемешивают содержимое стеклянной палочкой, затем из бюретки добавляют по 7 мл дистиллированной воды и вновь перемешивают. Оставляют стоять 5 мин для развития окрашивания. Перед фотометрией готовят стандартную пробу, для чего в пробирку вносят 0,1 мл фосфатного буфера, 0,9 мл трихлоруксусной кислоты, 1 мл реактива молибдата аммония и 1 мл раствора аскорбиновой кислоты. Содержимое перемешивают, затем добавляют из бюретки 7 мл дистиллированной воды и опять перемешивают. Оставляют стоять 5 мин для развития окрашивания. Фотометрируют опытную и стандартную пробы против контрольной (1 мл трихлоруксусной кислоты и 9 мл дистиллированной воды) на ФЭКе при 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см. Расчет. Содержание неорганического фосфора х (в мкмоль) в пробах рассчитывают по формуле Еоп∙10 х = ————— , Ест где Еоп – экстинкция опытной пробы; Ест – экстинкция стандартной пробы; 10 – количество неорганического фосфора в стандартной пробе, мкмоль. Убыль Фн рассчитывают по разнице между количеством его в стандартной и соответствующей опытной пробах. Оформление работы. Полученные данные внести в таблицу.
В выводе указать возможность протекания окислительного фосфорилирования без субстрата окисления и особенность действия на него разобщителей и ингибиторов; отметить практическое значение обнаруженных феноменов. Практическое значение работы. Клетки и ткани организма человека отличаются друг от друга скоростью дыхания и связанного с ним фосфорилированием. Наиболее активное окислительное фосфорилирование отмечается в тканях, богатых митохондриями, например, в почках, сетчатке глаза, корковом веществе головного мозга, сердце, печени; менее развит этот процесс в скелетных мышцах, коже, а в эритроцитах человека он вообще отсутствует. В клинико-биохимических исследованиях используются методы определения окислительного фосфорилирования в лейкоцитах крови и биоптатах для оценки энергетического обмена при различных патологических состояниях, а также для изучения действия лекарств и ядов, которые могут проявлять свойства разобщителей или ингибиторов. Работа 41. Выявление гликолиза в мышечной тканиДля оценки вклада гликолиза в энергетику клеток измеряют скорость этого процесса при оптимальных условиях. С этой целью добавляют в среду, содержащую исследуемый материал (клетки, срезы или кусочки тканей, гомогенат ткани), один из субстратов гликолиза (гликогенолиза), чаще всего глюкозу, гликоген, фруктозобисфосфат и др., необходимые кофакторы и создают анаэробные условия. Обязательным компонентом при изучении скорости гликолиза является неорганический фосфат, который расходуется в этом процессе на образование АТФ из АДФ. Индикаторами гликолиза служат скорость убыли глюкозы или накопления молочной кислоты, а также потребление Фн при анаэробном распаде углеводов в тканях. Реактивы. Фосфатный буфер, 0,1 М раствор с рН 8,0*; глюкоза, 10 г/л раствор, свежеприготовленный; трихлоруксусная кислота, 100 г/л раствор; сульфат меди (II), 100 г/л раствор; серная кислота, конц.; гваякол, 1,0 г/л раствор в 70%-ном этаноле; о-толуидиновый реактив*; фторид натрия, 3 М раствор; вазелиновое масло; оксид кальция, порошок, навески по 0,25 г в бумажных пакетиках. Оборудование. Водяная баня с лабораторным термометром; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; глазные пипетки; воронки со складчатыми бумажными фильтрами; стеклянные палочки; аптечные весы с разновесами. Материал. Мышечная ткань (свежая) забитого животного. Метод основан на выявлении убыли глюкозы и накопления молочной кислоты в среде под действием ферментов гликолиза мышечной ткани в присутствии и в отсутствие фторида натрия, являющегося ингибитором гликолиза. Глюкоза обнаруживается по реакции с о-толуидином, в результате чего образуется окрашенное соединение зеленого цвета при нагревании в среде с уксусной кислотой. Молочная кислота при нагревании с концентрированной серной кислотой превращается в ацетальдегид, дающий с гваяколом характерное красное окрашивание. Ход определения. В три пробирки отмеривают по 2 мл фосфатного буфера и по 1 мл раствора глюкозы. Затем в первую пробу добавляют 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, а во вторую – 0,2 мл раствора фторида натрия. Мышечную ткань мелко измельчают ножницами и вносят во все пробирки по 1 г мышечной кашицы, содержимое тщательно перемешивают стеклянной палочкой и приливают 10 капель вазелинового масла (для защиты от кислорода воздуха). Пробирки выдерживают на водяной бане при 37˚С в течение 30 мин. После инкубации во вторую и третью пробы добавляют по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают. Содержимое всех пробирок фильтруют через бумажный фильтр в чистые пробирки. С фильтратом проделывают реакции на глюкозу и молочную кислоту. Для проведения реакции на глюкозу берут по 0,1 мл фильтрата, переносят его в чистые пробирки и добавляют в них по 0,4 мл воды и по 2,0 мл о-толуидинового реактива. Помещают пробирки в водяную кипящую баню на 8 мин, после чего охлаждают под струей холодной воды. Сравнивают интенсивность окраски исследуемых проб. Для проведения реакции на молочную кислоту к оставшемуся фильтрату в обеих пробах добавляют по 5 капель раствора сульфата меди и по 0,25 г оксида кальция (для осаждения углеводов, которые мешают обнаружению молочной кислоты). Пробы оставляют стоять 10 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая их. Затем содержимое пробирок фильтруют через бумажный фильтр в две чистые пробирки, помещенные в лед или снег. Отбирают по 10 капель фильтрата и осторожно добавляют в каждую из них по 30 капель концентрированной серной кислоты. Все пробирки помещают на 5 мин в кипящую водяную баню (для превращения молочной кислоты в ацетальдегид). Затем пробирки охлаждают и добавляют по 2 капли спиртового раствора гваякола. Через 20 мин сравнивают интенсивность окрашивания в пробах. Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы.
Сделать вывод о наличии гликолиза в мышечной ткани и о методических подходах к его изучению. Практическое значение работы. При анаэробном распаде углеводов образуется две молекулы АТФ на одну молекулу расщепленной глюкозы, что является важным дополнительным источником образования энергии. В эритроцитах гликолиз является единственным способом производства энергии. В анаэробных условиях, когда организм испытывает недостаток кислорода, этот путь образования энергии является основным для сохранения жизнедеятельности тканей. В эксперименте и клинике определение скорости гликолиза в клетках крови и биоптатах широко используется для оценки образования энергии анаэробным путем. Кроме того, этот метод позволяет изучить механизм действия различных лекарственных препаратов и ядов, которые могут оказывать отрицательное действие, блокируя одну из стадий ферментативного процесса. Работа 42. Анализ адениннуклеотидов методом ионообменной тонкослойной хроматографии Реактивы. Стеклянные пластинки (9х12 см) с нанесенным тонким слоем диэтиламиноэтилцеллюлозы (ДЭАЭ-целлюлоза), являющейся анионообменной смолой; соляная кислота, 0,02 М раствор. Оборудование. Химический стакан; глазная пипетка; лист белой бумаги; вентилятор; хроматоскоп. Материал. Аденозинтрифосфат натрия, 1%-ный раствор для инъекций. Метод основан на эффекте ионного обмена, состоящего в том, что адениннуклеотиды, имеющие отрицательный заряд, взаимодействуют с положительными группами ДЭАЭ-целлюлозы (неподвижная фаза), а при прохождении по адсорбенту раствора соляной кислоты нуклеотиды замещаются на анионы Clˉ. При этом легче всего вытесняется АМФ, из-за чего он продвигается дальше всех, затем АДФ и АТФ, который остается рядом с линией старта1. Просматривают хроматограмму в ультрафиолетовом свете, в котором нуклеотиды, вследствие поглощения при 260 нм, выглядят в виде темных пятен. Ход определения. Стеклянную пластину с ДЭАЭ-целлюлозой кладут адсорбентом вверх на лист белой бумаги и, отступив от края пластинки на 2 см, проводят простым карандашом линию старта, а в центре очерчивают кружок диаметром 3-4 мм для нанесения исследуемой пробы. Наносят глазной пипеткой каплю раствора натрия аденозинтрифосфата в центр кружка и подсушивают пятно на воздухе в течение 5 мин с помощью вентилятора. В химический стакан, который используют как хроматографическую камеру, наливают раствор соляной кислоты так, чтобы слой жидкости был высотой примерно 1 см. Опускают конец пластинки с нанесенной пробой в раствор соляной кислоты. Для герметичности стакан закрывают лоскутом резиновой перчатки, натянув его и закрепив с помощью резинового колечка. После того как фронт растворителя достигает верхнего края пластинки, ее вынимают из стакана и подсушивают на воздухе с помощью вентилятора. Хроматограмму помещают в хроматоскоп и в ультрафиолетовом свете очерчивают простым карандашом темные пятна разделившихся адениннуклеотидов. Оформление работы. Зарисовать положение пятен адениннуклеотидов на хроматограмме и сделать вывод о качестве исследуемого препарата АТФ для инъекций. Практическое значение работы. Разделение нуклеотидов методом тонкослойной ионообменной хроматографии используется для изучения состава нуклеотидов и определения их содержания в тканях, а также для расчета энергетического заряда адениловой системы в норме и при различных патологических состояниях. В фармации этот метод используется для контроля качества препаратов, содержащих адениннуклеотиды. Работа 43. Определение активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови по Эннору и Розенбергу Реактивы. Креатинфосфат, 0,006 М раствор; аденозиндифосфат динатриевая соль, 6,0 г/л раствор; трис-буфер, 0,1 М раствор с рН 7,2, содержащий 0,1 моль/л хлорида магния; сульфат цинка, 50 г/л раствор; гидроксид бария, 50 г/л раствор; щелочной реактив, содержащий 160 г/л карбоната натрия и 60 г/л гидроксида натрия; диацетил, рабочий раствор; α-нафтол, 10 г/л раствор; креатин, стандартный раствор концентрации 0,1 ммоль/л. Примечание. Все перечисленные реактивы, кроме трис-буфера, готовят перед употреблением. Оборудование. Штатив с пробирками; стеклянные палочки; пипетки вместимостью 1 мл; водяная баня с лабораторным термометром; центрифуга лабораторная с центрифужными весами. Материал. Сыворотка крови. Метод основан на определении креатина, образующегося из креатинфосфата под действием креатинфосфокиназы, об активности которой судят по количеству выявляемого креатина.  Креатин образует с диацетилом и α-нафтолом комплексное соединение, интенсивность розовато-желтой окраски которого пропорциональна концентрации креатина. Ход определения. В две пробирки последовательно вносят следующие реактивы (объемы растворов указаны в миллилитрах):
Обе пробирки помещают на 3 мин в водяную баню при 37˚С, не вынимая из бани, прибавляют в них по 0,2 мл раствора АДФ (запускают креатинкиназную реакцию). Отмечают время начала инкубации. Через 30 мин реакцию останавливают, последовательно добавляя в обе пробы по 0,2 мл гидроксида бария и сульфата цинка. Содержимое пробирок охлаждают и оставляют стоять 10 мин (для осаждения белка). Затем осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5-10 мин. Отбирают по 0,5 мл надосадочной жидкости в две чистые пробирки и приливают в них по 3 мл дистиллированной воды, по 1 мл раствора α-нафтола и по 0,5 мл рабочего раствора диацетила. Пробы тщательно перемешивают стеклянной палочкой и помещают на 20 мин в темное место для развития окрашивания. Перед фотометрией готовят стандартную пробу и контроль стандарта. Для этого в одну пробирку (стандартная проба) вносят 0,5 мл раствора креатина, 3 мл дистиллированной воды, 1 мл α-нафтола и 0,5 мл рабочего раствора диацетила, а в другую (контроль стандарта) – те же реактивы, только вместо раствора креатина добавляют 0,5 мл дистиллированной воды. Обе пробирки выдерживают в темноте 20 мин. Измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной и стандартной против контроля стандарта на ФЭКе при 520-540 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1,0 см. Расчет. Активность креатинфосфокиназы рассчитывают по формуле 0,00005Еоп1,2∙2∙10000 х = ———————————— , Ест0,5 где х – активность креатинфосфокиназы, ммоль/(ч∙л); 0,00005 – содержание креатина в стандартной пробе, ммоль; Еоп – экстинкция опытной пробы против контроля; Ест – экстинкция стандартной пробы против контроля стандарта; 2 – коэффициент пересчета на час инкубации; 1,2 – объем проб до центрифугирования; 0,5 – объем надосадочной жидкости, взятой на исследование; 10000 – коэффициент пересчета на литр сыворотки крови. После сокращения формула приобретает следующий вид: 2,4Еоп х = ———— Ест Оформление работы. Рассчитать активность креатинфосфокиназы в сыворотке крови и по полученным данным сделать вывод о возможных изменениях активности фермента и причинах этих отклонений. Практическое значение работы. Больше всего креатинфосфокиназы в мышечной (скелетная мышца и сердце) и нервной тканях, в которых она участвует в переносе энергии. В остальных тканях и органах ее активность в 100-1000 раз ниже. Поэтому при повреждении мышечной и нервной тканей или при заболеваниях, вызывающих повышение их проницаемости, имеет место «утечка» фермента из тканей и повышение его количества в крови. В норме активность креатинфосфокиназы в сыворотке крови составляет 0,30-0,70 ммоль/(ч∙л). В клинической практике определение активности этого фермента используется при диагностике инфаркта миокарда (причем повышение активности его наблюдается через 3 ч после начала некротического процесса и достигает максимума через 24 ч), а также при дистрофии скелетных мышц, поражении нервной ткани.
фотосинтезирующих организмов В клетках фотосинтезирующих организмов имеется система пигментов (хлорофиллы, фикобилины, каротиноиды) избирательно улавливающие кванты света в видимой области спектра, которые затем трансформируются в энергию фосфатных связей АТФ. В темновой период суток эти организмы преобразуют энергию окислительно-восстановительных реакций в энергию АТФ как хемотрофы. В митохондриях животных и растительных клеток функционируют сходные ферменты биологического окисления и системы трансформации энергии в дыхательной цепи. Исследование этих процессов проводится аналогичными методами, что и в гетеротрофных организмах. В то же время в растениях отмечается высокая активность ряда оксидаз (пероксидаза, полифенолоксидаза и др.), принимающих участие в окислении вторичных продуктов обмена. Работа 44. Качественные реакции на пигменты растенийРеактивы. Этанол, 96%-ный; бензин; гидроксид бария, насыщенный раствор; аскорбиновая кислота, кристаллическая; соляная кислота, 10%-ный раствор. Оборудование. Водяная баня с лабораторным термометром; штатив с пробирками; капельницы; пипетки вместимостью 5 мл; аптечные весы с разновесками; ступка с пестиком. Материал. Листья крапивы, сушеные. а. Экстрагирование пигментов из листьев крапивы. Метод основан на способности хлорофилла и других пигментов под действием горячего спирта переходить в раствор, при этом хлорофилл при взаимодействии со спиртом превращается в этилхлорофиллид – сложный эфир, в котором остаток фитола замещен остатком этилового спирта. Ход определения. 0,5 г сушеной крапивы растирают в ступке с 5,0 мл этилового спирта, переносят в пробирку и нагревают на водяной бане при 90-100˚С до закипания спирта. Содержимое фильтруют через бумажный фильтр в другую пробирку. Фильтрат, содержащий хлорофиллид, ксантофилл и другие пигменты, имеет зеленый цвет с интенсивной красной флюоресценцией. Его используют для исследования. б. Разделение пигментов по Краусу. Метод основан на различной способности пигментов растворяться в бензине: хлорофилл, хлорофиллид растворимы, а ксантофилл нерастворим в нем. Ход определения. К 10 каплям полученного фильтрата прибавляют равный объем бензина, содержимое тщательно встряхивают, постукивая пальцем по дну пробирки. Наблюдают за окраской пигментов, содержащихся в разных растворителях. в. Осаждение хлорофилла. Метод основан на способности эфирных групп при омылении раствором гидроксида бария образовывать бариевые соли хлорофиллидов А и В, нерастворимых в воде; жидкость над осадком имеет желтую окраску вследствие присутствия в вытяжке каротина и ксантофилла. Ход определения. К 10 каплям фильтрата добавляют 20 капель раствора гидроксида бария и тщательно взбалтывают. Наблюдают за происходящими изменениями. г. Восстановление хлорофилла аскорбиновой кислотой. Метод основан на способности аскорбиновой кислоты восстанавливать хлорофилл, приобретающий вследствие этого желтое окрашивание. Ход определения. К 10 каплям фильтрата добавляют 2 капли воды, несколько кристалликов аскорбиновой кислоты и в течение 3-5 мин нагревают в водяной бане при 70-80˚С. Наблюдают за изменением окраски. д. Получение феофитина из хлорофилла. Метод основан на способности соляной кислоты связывать ион магния, входящий в состав хлорофилла, с образованием феофитина, имеющего оливково-бурый цвет. Ход определения. К 5 каплям фильтрата прибавляют 1 каплю раствора соляной кислоты. Наблюдают за изменением окраски. Оформление работы. Дать оценку качественным реакциям на пигменты растений. В выводах обосновать значение хлорофилла и других пигментов для фотосинтетических процессов. Практическое значение работы. Методы разделения и анализа пигментов фотосинтетического аппарата растений используются для изучения физико-химических свойств, фотохимической активности и характеристики их состава на разных стадиях онтогенеза растений и влияния на него факторов внешней среды. Работа 45. Определение активности пероксидазы в растительном материале по методу А.Н.Бояркина Реактивы. Ацетатный буфер, 0,1 М раствор с рН 5,4*; пероксид водорода, 0,03%-ный раствор; бензидин, 0,92 г/л раствор на ацетатном буфере*. Оборудование. Колбы вместимостью 25 мл; пипетки вместимостью 5 мл; центрифуга лабораторная с центрифужными весами; ФЭК. Материал. Листья растений, свежие. Метод основан на непрерывном измерении светопоглощения бензидиновой сини, образующейся при окислении бензидина под действием пероксидазы.  Реакция описывается уравнением.Ход определения. Навеску 100 мг растительного материала помещают в ступку и растирают, прибавляя порциями 10 мл дистиллированной воды. Растертую массу переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки. Содержимое колбы настаивают 10 мин, затем сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Для определения активности фермента берут кювету с толщиной слоя 2 см и наливают в нее по 2 мл водной вытяжки из листьев, ацетатного буфера и раствора бензидина. Ставят кювету в кюветодержатель и устанавливают стрелку прибора на нулевую отметку, затем добавляют 2 мл раствора пероксида водорода пипеткой с широким носиком (чтобы сильная струя перемешала жидкость в кювете) и одновременно с добавлением пероксида включают секундомер. Раствор в кювете начинает синеть и по мере нарастания интенсивности окраски стрелка прибора отклоняется. Отмечают время от начала приливания раствора пероксида водорода до достижения стрелкой гальванометра отметки 0,250. Повторяют определение трижды и берут среднее значение времени. Расчет. Активность фермента рассчитывают по формуле ∆Е 25∙1000 х = ———————— , t∙d 0,1∙2 где х – активность пероксидазы, Е∙с-1∙кг-1 (Е – единица экстинкции); ∆Е – изменение экстинкции, равное 0,250; t – время реакции, с; d – толщина слоя кюветы, равная 2; 1000 – коэффициент пересчета граммов в килограммы; 0,1 – навеска, г; 2 – объем пробы, мл. После сокращений формула принимает вид 15625 х = ————— t Оформление работы. Рассчитать и сравнить активность пероксидазы в исследуемом материале; в выводе отметить биологическое значение фермента. Практическое значение работы. Пероксидаза выполняет две функции: собственно пероксидазную, т.е. окисляет вещества с участием пероксида водорода, и оксидазную, т.е. катализирует окисление субстратов за счет молекулярного кислорода без участия пероксида водорода. Этот фермент проявляет перокисдазную активность в отношении практически всех фенолов (пирокатехин, пирогаллол, галловая кислота, гваякол и др.), ароматических аминов (бензидин, n-фенилендиамин и др.), аскорбиновой кислоты, нитритов и т.д. В то же время пероксидаза, обладая оксидазной функцией, способна участвовать в окислении флороглюцина, НАД∙Н2, НАДФ∙Н2, индолилуксусной кислоты, оксалата, фенилпирувата и т.д. В практике широко используют определение активности пероксидазы для оценки метаболизма ростовых веществ, лигнина и других вторичных продуктов обмена при физиологических и патологических процессах. Пероксидаза, выделенная из хрена, широко используется как аналитический реагент при проведении клинико-биохимических исследований. Поэтому метод измерения активности фермента необходим для контроля качества продажного препарата фермента. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||