практикум по биохимии. Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,

• Название: Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,
• Анкор: практикум по биохимии.docx
• Дата: 02.05.2017
• Размер: 1.79 Mb.
• Имя файла: практикум по биохимии.docx
• Тип: Практикум; #6494
• страница: 23 из 39

ОБМЕН БЕЛКОВ И АМИНОКИСЛОТ

В обмене белков можно условно выделить два этапа: первый – распад белков (в том числе апопротеинов сложных белков) до аминокислот и второй – превращение аминокислот до конечных продуктов метаболизма (мочевина, СО₂ и Н₂О) или до некоторых азотсодержащих производных (биогенные амины, креатин, порфирины и т.д.). Для оценки состояния белкового обмена организма исследуют содержание белков и отдельных их фракций в сыворотке крови, аминокислот, а также активность ферментов, катализирующих отдельные стадии превращения белков и аминокислот.

Работа 55. Определение содержания белковых фракций

сыворотки крови турбидиметрическим методом
Реактивы. Основной фосфатный буферный раствор и его рабочие растворы № 1-4^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1; 2,5 и 10 мл; палочки стеклянные; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на способности отдельных белковых фракций сыворотки крови осаждаться в виде мелкой взвеси в фосфатных растворах определенной концентрации. Степень мутности раствора пропорциональна содержанию белковых фракций.

Ход определения. Нумеруют шесть пробирок: 0, 1, 2, 3, 4, 5 и ставят их в штатив. В пробирку «0» (контрольная) вносят 5 мл дистиллированной воды, а в пробирки 1-4 по 5 мл соответствующих рабочих буферных растворов.

В пробирку № 5 наливают 0,5 мл сыворотки крови, 0,75 мл дистиллированной воды и 3,75 мл основного раствора фосфатного буфера, содержимое тщательно перемешивают.

Из пробирки № 5 переносят 0,5 мл в контрольную пробирку и по 0,5 мл в пробирки № 1-4, после чего содержимое их перемешивают стеклянной палочкой.

Через 15 мин определяют степень мутности (экстинкцию) растворов № 1-4 против контрольной (нулевая проба) на ФЭКе при 610-640 нм (светофильтр красный) в кювете с толщиной слоя 1 см (перед фотометрией пробирки встряхивают).

Расчет. Подобранные концентрации растворов фосфатного буфера позволяют осаждать разные фракции белков в зависимости от их изоэлектрической точки. В пробирке № 1 осаждаются все фракции; № 2 – все фракции глобулинов; № 3 –β- и γ-глобулины и № 4 – только γ-глобулины. Исходя из этого, рассчитывают содержание отдельных белковых фракций в процентах или в абсолютных величинах (в г/л).

В процентах расчет проводят следующим образом. Вычисляют Е для каждой фракции:

для альбуминов Е = Е₁ – Е₂;

для α-глобулинов Е = Е₂ – Е₃;

для β-глобулинов Е = Е₃ – Е₄;

для γ-глобулинов Е = Е₄

Полученные значения Е для каждой белковой фракции складывают и условно принимают за 100%, после чего находят содержание для каждой фракции х (в %) по формуле
Е_оп 100%

х = ————— ,

Е_общ
где Е_оп – экстинкция данной фракции,

Е_общ – сумма экстинкций всех фракций.

Для расчета содержания белковых фракций в абсолютных значениях предварительно определяют концентрацию белка в сыворотке крови биуретовым методом (см. работу 8) и затем делают расчеты по формуле
Е_оп С

х = ————— ,

Е_общ
где х – содержание данной фракции, г/л;

С – концентрация белка в сыворотке крови, определенная биуретовым методом, г/л.

Оформление работы. Рассчитать процентное и абсолютное содержание белковых фракций в сыворотке крови (для расчета в абсолютных единицах можно использовать данные содержания белка в сыворотке крови, полученные в работе 8), а также альбумин/глобулиновый индекс и сделать вывод.

Практическое значение работы. В норме содержание белковых фракций в сыворотке крови следующее: альбумины 35-60 г/л и глобулины 25-35 г/л, из них α₁-глобулины 2,5-5%, α₂-глобулины 7-13%, β-глобулины 8-14% и γ-глобулины 12-22%. В абсолютных единицах концентрация α₁-глобулинов равна 2,0-5,0, α₂-глобулинов 4,0-7,0, β-глобулинов 5,0-9,0 и γ-глобулинов 8,0-17,0 г/л. Индекс альбумины/глобулины колеблется от 1,5 до 2,3. При различных патологических состояниях происходит изменение протеинограммы. Острый воспалительный процесс характеризуется уменьшением содержания альбуминов и возрастанием содержания α-глобулинов, а в более поздние сроки – увеличением концентрации γ-глобулинов. Для хронического воспаления более типично выраженное повышение уровня α₂ и γ-глобулинов и умеренное снижение альбуминов в сыворотке крови; при злокачественных новообразованиях резко снижается содержание альбуминов с одновременным существенным увеличением всех глобулиновых фракций. Поражения печени (гепатиты, цирроз печени) сопровождаются снижением альбуминов, которые образуются в печеночной ткани, и относительным увеличением γ-глобулинов.
Работа 56. Определение активности катепсинов в сыворотке крови

по А.А.Покровскому, А.И.Арчакову и О.Н.Любимцевой
Реактивы. Ацетатный буфер, 0,1 М раствор с рН 4,0; гемоглобин, 4%-ный раствор на ацетатном буфере с рН 4,0^*; трихлоруксусная кислота, 8%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; центрифуга с центрифужными весами; спектрофотометр.

Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на спектрофотометрическом определении при 280 нм кислоторастворимых продуктов гидролиза гемоглобина, образующихся под действием катепсинов сыворотки крови.

Реакция протекает по уравнению