практикум по биохимии. Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,
 Скачать 1.79 Mb.
|
|
По оси ординат откладывают значения экстинкции, а по оси абсцисс – соответствующие единицы щелочной фосфатазы, выраженные в ммоль/(ч∙л). Оформление работы. По полученным значениям экстинкции найти активность фермента. На основании этого сделать вывод о возможности изменения активности в исследуемой сыворотке и указать на предполагаемые причины. Практическое значение работы. В клинике используется определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови в основном у больных с поражениями костной ткани и печени, особенно с явлениями задержки оттока желчи. В норме активность фермента составляет 0,5-1,3 ммоль/(ч∙л). Повышение активности в сыворотке крови наблюдается при рахите (гиповитаминозе D), опухолях костной ткани, гиперпаратиреозе, механической желтухе, вирусном гепатите и т.д., а снижение – при гипотиреозе, гиповитаминозе С и др. 7. Исследование изоферментов Изоферменты отличаются друг от друга несколькими физико-химическими признаками и, в частности, зарядом молекул, поэтому электрофорез издавна используется для их разделения. Изоферменты лактатдегидрогеназы были открыты одними из первых. Различают пять типов изоферментов ЛДГ, которые в порядке подвижности к аноду обозначаются: ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4 и ЛДГ5. Каждый из них представляет собой тетрамер, отличающийся составом субъединиц (см. учебник, с.226, 438). Работа 33. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы сыворотки крови методом электрофореза в полиакриламидном геле по Дитцу и Лубрано Использование в качестве среды геля полиакриламида позволяет добиться высокого разрешения при электрофорезе белков и ферментов, поскольку этот гель играет роль молекулярного сита, что обеспечивает дополнительное разделение частиц по молекулярной массе. Реактивы. Раствор № 1 для полимеризации геля с рН 8,9 (1,0 М соляная кислота – 48 мл, трис-основание – 36,6 г, N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин, или ТЕМЕД – 0,23 мл и дистиллированная вода до 100 мл); раствор № 2 (акриламид – 30,0 г, N,N-метиленбисакриламид – 0,8 г и дистиллированная вода до 100 мл); персульфат аммония, 0,14%-ный свежеприготовленный раствор; сахароза, 40%-ный раствор; электродный буфер с рН 8,9 (трис-основание – 6,0 г, глицин – 28,8 г, дистиллированная вода до 1 л; перед употреблением разводят в 10 раз); уксусная кислота, 7%-ный раствор; фосфатный буфер, 0,5 М с рН 7,4; лактат натрия, 1 М раствор; НАД, 10 г/л раствор; нитротетразолиевый синий (НС), 1 г/л раствор; феназинметасульфат (ФМС), 1 г/л раствор; хлорид магния, 0,005 М раствор; хлорид натрия, 0,1 М раствор. Оборудование. Колба коническая вместимостью 25 мл; пипетки с оттянутым тонким концом; фильтровальная бумага; стеклянные палочки; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1,5 и 10 мл; резиновые колпачки; аппарат для электрофореза со стеклянными трубочками; источник постоянного напряжения; микроденситометр; спектрофотометр или ФЭК. Материал. Сыворотка крови. Метод основан на разной электрофоретической подвижности изоферментов ЛДГ, положение которых на столбиках полиакриламидного геля выявляется с помощью веществ, переносящих водород от лактата через феназинметасульфат на нитротетразолиевый синий. В результате в месте нахождения фракции ЛДГ выпадает фиолетово-синий осадок диформазана. Ход определения. Для полимеризации геля берут сухие чистые стеклянные трубочки, закрывают их с одного конца резиновыми колпачками, устанавливают в штативе строго перпендикулярно и вносят в них каплю раствора сахарозы. Затем готовят полимеризующую смесь, состоящую из растворов № 1, № 2, персульфата аммония и дистиллированной воды в соотношении 1:2:4:1. Смеси готовят из расчета 2 мл на одну трубочку. Приготовленную полимеризующую смесь разливают в стеклянные трубочки, используя по 2 мл на каждую. Затем на поверхность этого раствора осторожно наслаивают 0,2-0,3 мл дистиллированной воды пипеткой с тонким оттянутым концом (это улучшает полимеризацию геля в трубочках, которая протекает без доступа кислорода воздуха, и формирует гладкую поверхность геля). Через 30 мин обычно полимеризация завершается, о чем свидетельствует ясно различимая граница между полиакриламидным гелем и водой. После этого переворачивают трубочки и осторожно стряхивают с геля наслоенную воду, а остатки воды удаляют из трубочки с помощью фильтровальной бумаги. Стеклянные трубочки с заполимеризованным гелем закрепляют в гнездах верхней камеры для электрофореза. На поверхность геля в трубочке наносят сначала 0.1 мл сыворотки крови, затем такой же объем раствора сахарозы и перемешивают нанесенные жидкости стеклянной палочкой. Осторожно наслаивают на эту жидкость разведенный в 10 раз электродный буфер, заполняя им пространство до верхнего края трубочки. Нижнюю камеру аппарата заливают тем же электродным буфером, устанавливают верхнюю камеру над нижней так, чтобы нижние концы трубочек были погружены в электродный буфер. Затем верхнюю камеру тоже заполняют электродным буфером. Аппарат для электрофореза ставят в холодильник. Электроды подключают к источнику постоянного напряжения: нижний электрод к аноду, верхний к катоду (см. рис. 3). В течение первых 10 мин электрофорез проводят при силе тока 2 мА на каждую трубочку. Затем силу тока увеличивают до 4 мА. Длительность электрофореза около 90 мин. Пока идет электрофорез, для выявления изоферментов ЛДГ готовят в колбе инкубационную смесь следующего состава: растворы лактата натрия, хлорида магния, НАД – по 1 мл, фосфатного буфера и НС – по 2,5 мл и ФМС– 0,25 мл. Перемешивают содержимое колбочки. По окончании электрофореза гели извлекают из трубочек. Для этого используют шприц на 10-20 мл с тонкой длинной иглой. Вводят иглу между стенкой трубочки и гелем. Круговыми движениями отслаивают гель, постоянно выдавливая воду из шприца и продвигая иглу к противоположному концу трубки. При этом столбик геля легко выскакивает из трубки. Столбик геля помещают в пробирки диаметром 7-8 мм и наливают в них инкубационную смесь так, чтобы весь столбик геля был погружен в проявляющую жидкость. Пробирки ставят в термостат при 37˚С на 40-60 мин. Изоферменты ЛДГ выявляются в виде сине-фиолетовых колец на столбике геля. По истечении инкубации столбики геля промывают водой, переносят в пробирки, содержащие раствор уксусной кислоты, и хранят в темноте. Количественную обработку гелевых изоэнзимограмм проводят спектрофотометрическим методом или посредством денситометрии. В первом случае лезвием вырезают окрашенные участки геля, помещают их в пробирки и заливают 1 мл подогретого до +80-85˚С раствора диметилформамида. Затем окрашенную жидкость сливают в микрокюветы и измеряют экстинкцию на спектрофотометре или ФЭКе при 540 нм против раствора диметилформамида. Второй способ обработки заключается в сканировании гелей на микроденситометре. Денситограммы подвергаются количественной обработке. Расчет. Относительную активность каждого изофермента х (%) выражают в процентах от суммы экстинкций всех изоферментов ЛДГ: ЕА100% Е100 х = —————— , или, упрощенно, х = ——— , ∑Е ∑Е где Е – экстинкция элюата изофермента из зоны геля, относящаяся к данному изоферменту; ∑Е – сумма экстинкций всех изоферментов; А – активность ЛДГ сыворотки крови, ммоль/(ч·л). Оформление работы. Зарисовать полученную изоэнзимограмму и рассчитать относительную активность изоферментов ЛДГ (в %). Сделать вывод о сдвигах спектра изоферментов ЛДГ в исследуемой сыворотке и указать на вероятные причины этого явления. Практическое значение работы. Состав изоферментов ЛДГ имеет внутриклеточную, тканевую и видовую специфичность. Тканевые различия изоферментного спектра ЛДГ явились предпосылкой для использования его в диагностике и прогнозе ряда заболеваний, сопровождающихся некрозом органов и тканей. Известно, что в сердечной мышце, нервной ткани, почках высокая активность ЛДГ1 и ЛДГ2 (изоферменты Н-типа), в поджелудочной железе и легочной ткани преобладает ЛДГ3, а в скелетной мышце и печени – ЛДГ4 и ЛДГ5 (изоферменты М-типа). При некрозе этих тканей находящиеся в них изоферменты поступают в кровь и изменяют ее нормальный спектр. В норме сыворотка крови имеет примерно следующие соотношения изоферментов (в % от общей активности): ЛДГ1 – 32, ЛДГ2 – 47, ЛДГ3 – 12, ЛДГ4 – 5, ЛДГ5 – 4. При инфаркте миокарда в сыворотке крови увеличивается доля ЛДГ1 и ЛДГ2 (спектр смещается в сторону изоферментов Н-типа), причем этот сдвиг определяется размерами очага некроза в сердце. Заживление сопровождается нормализацией состава изоферментов в сыворотке крови. При инфекционном гепатите повышена относительная активность ЛДГ4 и ЛДГ5. Если она сохраняется при клиническом выздоровлении, то это свидетельствует о незавершенности восстановительных процессов в печени. При поражении поджелудочной железы (панкреатит), легочной ткани увеличивается относительная активность ЛДГ3 в сыворотке крови. Работа 34. Определение активности γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови Реактивы. L-γ-глутамил-п-нитроанилид; натрия хлорид; глицил-глицин*; субстратно-буферный раствор*; уксусная кислота ледяная, раствор 100 г/л; основной калибровочный раствор п-нитроанилида*. Оборудование. Пипетки на 0,1; 1,0 и 5,0 мл; термостатирующая водяная баня; спектрофотометр или фотоэлектроколориметр. Материал. Сыворотка крови. Метод основан на определении п-нитроанилида, образующегося из L-γ-глутамил-п-нитроанилида при ферментативном переносе L-γ-глутамилового остатка на глицил-глицин. ГТФ γ-глутамил-п-нитроанилид + глицил-глицин γ-глутамил-глицилглицид + п-нитроанилин Ход определения. В опытную пробирку вносят 0,5 мл раствора субстрата и помещают в водяную баню при температуре 37°С. Через 5 минут приливают 0,05 мл сыворотки крови, содержимое перемешивают и инкубируют точно 15 минут при температуре 37°С. Затем прибавляют 3 мл раствора уксусной кислоты и перемешивают. Контрольную пробу ставят также как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации. Измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм или на ФЭКе при длине волны 400-500 нм (фиолетовый или синий светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против контрольной пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов. Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику. Оформление работы. По полученным значениям экстинкции найти активность фермента. На основании этого сделать вывод о возможности изменения активности в исследуемой сыворотке и указать на предполагаемые причины. Практическое значение работы. В клинике используется определение активности γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови в основном при заболеваниях печени и желчных путей. В норме активность составляет для мужчин 250-1767 нмоль/с·л (15-106 МЕ), для женщин – 167-1100 нмоль/с·л или 10-66 МЕ. Повышение активности фермента наблюдается при заболеваниях желчных путей с явлениями обтурации, при гепатитах, опухолях и метастазах в печень. Следует отметить, что увеличение γ-глутамилтрансферазы, как правило, увеличивается параллельно активности щелочной фосфатазы, но активность γ-глутамилтрансферазы возрастает раньше, остается повышенной более длительное время и относительное увеличение активности фермента в несколько раз выше, чем щелочной фосфатазы. Следует отметить, что наркотики, седативные средства, этанол, стимулируют активность фермента, что используется для диагностики алкогольно-токсических заболеваний печени. БИОХИМИЯ ПИЩЕВАРЕНИЯ Пищеварение – это ферментативный гидролиз компонентов пищи. Для оценки его используются методы исследования активности ферментов и других компонентов пищеварительных соков, играющих вспомогательную роль в переваривании питательных веществ, например, соляная кислота, желчные кислоты, ионы кальция и т.д. Отклонения в составе пищеварительных соков или появление в них компонентов, не содержащихся в физиологических условиях, дают важную информацию о патологии пищеварения. Работа 35. Исследование кислотных компонентов желудочного сока Реактивы. Гидроксид натрия, 0,1 М раствор; n-диметиламиноазобензол, 0,5%-ный раствор в 36%-ном этаноле; фенолфталеин, 0,5%-ный раствор в 70%-ном этаноле; фенол, 1%-ный раствор; хлорид железа (III), 1%-ный раствор. Оборудование. Колбы конические вместимостью 25 мл; микробюретка; пипетки вместимостью 1,5 и 10 мл; штатив с пробирками. Материал. Желудочный сок нормальный и патологический*. а. Определение содержания соляной кислоты и общей кислотности желудочного сока. Метод основан на определении кислотных веществ желудочного сока путем титрования их раствором гидроксида натрия с использованием двух разных индикаторов: n-диметиламиноазобензола (имеющего зону перехода окраски при рН 2,3-4,2) и фенолфталеина (имеющего зону перехода окраски при рН 8,2-10,0). По изменению окраски (от красной к оранжевой) индикатора n-диметиламиноазобензола определяется свободная соляная кислота, а по переходу окраски фенолфталеина (от бесцветной к розовой) – общая кислотность желудочного сока. Ход определения. В одну колбу для титрования вносят 5 мл исследуемого нормального, в другую – патологического желудочного сока. Добавляют 1-2 капли раствора n-диметиламиноазобензола и 2 капли раствора фенолфталеина. Пробы оттитровывают раствором гидроксида натрия до появления оранжево-красной окраски и отмечают объем щелочи (в мл), пошедший на титрование свободной соляной кислоты (I пункт титрования). Продолжают титрование до появления лимонно-желтой окраски (II пункт титрования) и снова отмечают объем щелочи, израсходованный с начала титрования до II пункта. Затем титрование продолжают до появления розовой окраски (III пункт титрования) и отмечают количество щелочи, пошедшее на титрование от начала до III пункта. Расчет. За единицу кислотности желудочного сока принимается объем 0,1 М раствора гидроксида натрия (в мл), пошедший на титрование 100 мл желудочного сока. Поэтому расчеты кислотности даются на 100 мл. Например, на титрование 5 мл желудочного сока до I пункта пошло 1,5 мл раствора гидроксида натрия, тогда количество свободной соляной кислоты равно: 1,5 · 100 ———— = 30 ммоль/л, или 30 ед. 5 Для вычисления связанной соляной кислоты необходимо знать общую соляную кислоту. Последнюю определяют на основании данных титрования. Известно, что количество щелочи, необходимое для связывания всей соляной кислоты, равно среднему арифметическому количеству щелочи, пошедшему на титрование до II и III пунктов Следовательно, если до II пункта титрования пошло, например, 2 мл, а до III – 3 мл щелочи, то среднее арифметическое равно 2+3 ———— = 2,5 мл. 2 Отсюда содержание общей соляной кислоты в 100 мл желудочного сока составит 2,5∙100 ————— = 50 ед. 5 Связанная с белками соляная кислота определяется по разнице между количествами общей и свободной соляной кислоты: 50 ед. – 30 ед. = 20 ед. Кроме того, III пункт титрования служит для определения общей кислотности. Если на титрование 5 мл желудочного сока пошло 3 мл раствора гидроксида натрия, то общая кислотность равна: 3∙100 ————— = 60 ед. 5 б. Качественная реакция на молочную кислоту в желудочном соке (проба Уфельмана). Метод основан на способности молочной кислоты в присутствии фенолята железа (III) образовывать малодиссоциирующую соль лактата железа желто-зеленого цвета. Ход определения. Для приготовления фенолята железа в пробирку вносят 10 мл раствора фенола и добавляют к нему 3 капли раствора хлорида железа FeCl3. Содержимое перемешивают стеклянной палочкой (развивается фиолетовое окрашивание). Берут еще две пробирки: в одну наливают 2 мл нормального желудочного сока, а в другую – такой же объем желудочного сока, взятого у больного. Приливают к содержимому обеих проб по 3 мл приготовленного фенолята железа и перемешивают их встряхиванием. Отмечают наличие характерного окрашивания в пробирках. Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы.
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||