Ответы ординатура БАКТЕРИОЛОГИЯ. Правила работы и поведения в бактериологической лаборатории общего назначения

• Название: Правила работы и поведения в бактериологической лаборатории общего назначения
• Анкор: Ответы ординатура БАКТЕРИОЛОГИЯ
• Дата: 02.01.2023
• Размер: 1.49 Mb.
• Имя файла: Otvety_Ordinatura_dob_dobavleno_31-35.docx
• Тип: Документы; #870435
• страница: 4 из 10

Эндоферменты катализируют метаболические реакции, происходящие внутри клетки.

Ферменты бактерий классифицируются также на конститутивные и индуцибельные. Конститутивными называются такие ферменты, которые синтезируются клеткой независимо от наличия субстрата в среде, индуцибельные ферменты образуются бактериями только при наличии в среде соответствующего индуцирующего соединения, т. е. субстрата данного фермента. Например, в геноме кишечной палочки заложена способность разлагать лактозу, но только при наличии в среде лактозы клеткой синтезируется фермент, катализирующий ее гидролиз.

Известны также ферменты, которые получили название аллостерических . Кроме активного центра у них имеется регуляторный или аллостерический центр, который в молекуле фермента пространственно разделен с активным центром. Аллостерическим (от греч. allos - иной, чужой) он называется потому, что молекулы, связывающиеся с этим центром, по строению ( стерически ) не похожи на субстрат, но оказывают влияние на связывание и превращение субстрата в активном центре, изменяя его конфигурацию. Молекула фермента может иметь несколько аллостерических центров. Вещества, связывающиеся с аллостерическим центром, называют аллостерическими эффекторами. Они влияют через аллостерический центр на функцию активного центра: или облегчают ее, или затрудняют. Соответственно аллостерические эффекторы называются положительными (активаторы) или отрицательными (ингибиторы). Аллостерические ферменты играют важную роль в тонкой регуляции метаболизма бактерий. Поскольку практически все реакции в клетке катализируются ферментами, регуляция метаболизма сводится к регуляции интенсивности ферментативных реакций.

Патогенные бактерии обладают наряду с ферментами обмена также ферментами агрессии, являющимися факторами вирулентности. К таким ферментам относятся

• 
  гиалуронидаза,
  
• 
  дезоксирибонуклеаза,
  
• 
  коллагеназа,
  
• 
  н е й р а м и и и д аза, и др.
  

Гиалуронидаза стрептококков, например, расщепляет гиалуроновую кислоту в мембранах клеток соединительных тканей макроорганизма , что способствует распространению возбудителей и их токсинов в организме, обуславливая высокую инвазивность этих бактерий.

Плазмокоагулаза является главным фактором патогенности стафилококков, так как участвует в превращении протромбина в тромбин, который вызывает образование фибриногена, в результате чего каждая бактерия покрывается пленкой, предохраняющей ее от фагоцитоза.

Ферменты бактерий обладают высокой специфичностью, и именно это свойство широко используется при идентификации и определении видов микроорганизмов. Наибольшее значение имеет определение сахаролитических (ферментация сахаров) и протеолитических (разложение белков) свойств.

28. Генетический материал бактерий.

1.Ядерные структуры бактерий - хроматиновые тельца или нуклеоиды (хромосомная ДНК). У бактерий одна замкнутая кольцевидная хромосома (до 4 тысяч отдельных генов). Бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы (репликация ДНК) сопровождается делением клетки. Вегетативная репликация хромосомной (и плазмидной) ДНК обусловливает передачу генетической информации по вертикали - от родительской клетки- к дочерней. Передача генетической информации по горизонтали осуществляется различными механизмами - в результате конъюгации, трансдукции, трансформации, сексдукции.

2.Внехромосомные молекулы ДНК представлены плазмидами, мигрирующими генетическими элементами - транспозонами и инсервационными (вставочными) или IS- последовательностями.

Плазмиды - экстрахромосомный генетический материал (ДНК), более просто устроенные по сравнению с вирусами организмы, наделяющие бактерии дополнительными полезными свойствами. По молекулярной массе плазмиды значительно меньше хромосомной ДНК, содержат от 40 до 50 генов.

Плазмиды могут распространяться по вертикали (при клеточном делении) и по горизонтали, прежде всего путем конъюгационного переноса. В зависимости от наличия или отсутствия механизма самопереноса (его контролируют гены tra- оперона) выделяют конъюгативные и неконъюгативные плазмиды. Плазмиды могут встраиваться в хромосому бактерий - интегративные плазмиды или находиться в виде отдельной структуры- автономные плазмиды ( эписомы).

Классификация и биологическая роль плазмид.

Функциональная классификация плазмид основана на свойствах, которыми они наделяют бактерии. Среди них - способность продуцировать экзотоксины и ферменты, устойчивость к лекарственным препаратам, синтез бактериоцинов.

Основные категории плазмид.

1.F- плазмиды - донорские функции, индуцируют деление (от fertility - плодовитость). Интегрированные F - плазмиды- Hfr- плазмиды (высокой частоты рекомбинаций).

2.R- плазмиды (resistance) - устойчивость к лекарственным препаратам.

3.Col- плазмиды - синтез колицинов (бактериоцинов)- факторов конкуренции близкородственных бактерий (антогонизм). На этом свойстве основано колицинотипирование штаммов.

4.Hly- плазмиды - синтез гемолизинов.

5.Ent- плазмиды - синтез энтеротоксинов.

6.Tox- плазмиды - токсинообразование.

Близкородственные плазмиды не способны стабильно сосуществовать, что позволило объединить их по степени родства в Inc- группы (incompatibility- несовместимость).

Биологическая роль плазмид многообразна, в том числе:

- контроль генетического обмена бактерий;

- контроль синтеза факторов патогенности;

- совершенствование защиты бактерий.

Бактерии для плазмид - среда обитания, плазмиды для них- переносимые между ними дополнительные геномы с наборами генов, благоприятствующих сохранению бактерий в природе.

Мигрирующие генетические элементы - отдельные участки ДНК, способные определять свой перенос между хромосомами или хромосомой и плазмидой с помощью фермента рекомбинации транспозазы. Простейшим их типом являются инсерционные последовательности (IS- элементы) или вставочные элементы, несущие только один ген транспозазы, с помощью которой IS- элементы могут встраиваться в различные участки хромосомы. Их функции- координация взаимодействия плазмид, умеренных фагов, транспозонов и генофора для обеспечения репродукции, регуляция активности генов, индукция мутаций. Величина IS- элементов не превышает 1500 пар оснований.

Транспозоны (Tn- элементы) включают до 25 тысяч пар нуклеотидов, содержат фрагмент ДНК, несущий специфические гены, и два Is- элемента. Каждый транспозон содержит гены, привносящие важные для бактерии характеристики, как и плазмиды (множественная устойчивость к антибиотикам, токсинообразование и т.д.). Транспозоны- самоинтегрирующиеся фрагменты ДНК, могут встраиваться и перемещаться среди хромосом, плазмид, умеренных фагов, т.е. обладают потенциальной способностью распространяться среди различных видов бактерий.

29. Генетические основы патогенности бактерий.

Важнейшие факторы вирулентности бактерий – адгезины, капсулы, токсины и ферменты являются структурными единицами бактерий и кодируются хромосомами.

Другая часть кодируется внехромосомными факторами наследственности – плазмидами и эписомами. Плазмидные гены обычно определяют взаимодействие возбудителей с эпителием, а хромосомные – существование и размножение бактерий внеклеточно в органах и тканях.

Передача генов вирулентности среди бактерий осуществляется путем: 1) лизогении (дифтерийный экзотоксин, передающийся при специфической трансдукции, цитотоксин кишечной палочки); 2) при конъюгации, которую индуцируют факторы переноса, широко распространенные в популяции бактерий.

Факторы переноса могут содержать гены вирулентности либо мобилизовать неконъюгативные плазмиды, несущие эти гены. Плазмиды, несущие гены вирулентности, разделяют на плазмиды устойчивости и плазмиды вирулентности.

Плазмиды устойчивости (R-плазмиды) содержат информацию об устойчивости к антибиотикам. Часто в плазмиды включены многие гены, детерминирующие множественную резистентность ко многим препаратам.

Плазмиды вирулентности могут кодировать экзотоксины, адгезины или факторы инвазии.

Например, у энтеротоксигенных E.coli присутствуют плазмиды, кодирующие синтез энтеротоксина и образование адгезинов – специфических пилей, известных как Аг факторов колонизации; плазмиды инвазивности Shigella dysenteriae кодируют белки, определяющие способность бактрий проникать в эпителий СО кишечника и прямо распространяться от клетки к клетке. Способность к системным инвазиям некоторых штаммов E.coli определяет конъюгативная плазмида Col-E, кодирующая способность к образованию бактериоцина и железосвязывающего белка сидерофора.

Генетической основой для синтеза факторов вирулентности являются так называемые генетические «острова» или «островки» патогенности, а также гены особой системы клеточной секреции. «Острова патогенности» – нестабильные участки ДНК размерами до 200 тыс Да, обнаруживаемые только у патогенных бактерий. Они часто являются местом интеграции бактериофагов и подвижных элементов генома. Известны острова, несущие гены адгезинов, различного типа токсинов, генов лекарственной устойчивости и т. д. Система секреции, в свою очередь, определяет одноэтапный транспорт эффекторных молекул из цитоплазмы к поверхности бактериальной клетки к месту их контакта с чувствительными клетками макроорганизма. Эти молекулы изменяют белки поражаемых клеток.

Распространение и передача генов вирулентности среди бактерий осуществляется несколькими путями. Одним из важных способов является фаговаяили лизогенная конверсия. В этом случае клетка становится вирулентной только при наличии в геноме профага, кодирующего факторы вирулентности (в первую очередь – токсины). Так, дифтерийный токсин выделяют только те коринебактерии, у которых имеются tox-гены, полученные от умеренного фага. Часть лизогенных штаммов E.coli образуют цитотоксин, напоминающий по действию классический токсин Shigella dysenteriae.

Одним из наиболее распространенных механизмов передачи генов патогенности является и передача плазмид при конъюгации.

30. Мутации бактерий. Репарации.

Мутации – изменения структуры ДНК генов, проявляющиеся наследственно закрепленным изменением какого-либо признака или признаков. В природе они могут наступать спонтанно, без участия экспериментатора. Такие мутации относят к спонтанным. Они имеют свою причину, но не контролируются.

Индуцированные мутации – направленные изменения структуры ДНК, контролируемые экспериментатором.

Факторы, вызывающие мутации, называются мутагенами. Они могут быть химическим, физическими и биологическими.

Химические мутагены – соединения, способные изменять структуру генов, прямо взаимодействуя с ДНК клетки или реагируя с ферментами, контролирующими метаболизм нуклеиновых кислот. Известно огромное количество химических мутагенов – красители, галогены, соли металлов переходных валентностей (например – никеля), азотистый натрий, некоторые антибиотики и т.д.

К физическим мутагенам относятся такие факторы, как температура, гамма-излучение, ультрафиолетовые лучи, ренгеновские лучи и т.д.

К биологическим мутагенам можно отнести действие бактериофагов, накопление продуктов метаболизма и т.п.

По величине мутации делятся на генные – изменения в пределах 1 гена; хромосомные – изменения более, чем в одном гене, и точковые – в паре оснований нуклеотидов, что приводит к изменению одного триплета.

В случае точковых мутаций вместо одной аминокислоты кодируется другая или образуется бессмысленный кодон, не кодирующий аминокислоты. Последние мутации называются нонсенс-мутациями. Возможны молчащие мутации (без изменения смысла). Они возникают вследствие вырожденности генетического кода; образовавшийся в результате мутирования триплет кодирует ту же самую аминокислоту, что и исходный триплет. Миссенс-мутации(мутации с изменением смысла) – это результат изменения последовательности ДНК, ведущий к появлению в белковой цепи иной аминокислоты. Образующийся измененный белок может быть как активным, так и неактивным в зависимости от размеров мутации. Мутации со сдвигом рамки чтения обусловлены удалением или вставкой одного нуклеотида в ДНК, что приводит к «сдвигу» считывания и следовательно – к изменению всех последующих триплетов.

Мутации могут происходить вследствие замены одной пары оснований на другую (вместо гуанилового нуклеотида – цитидиловый, аденилового – тимидиловый или наоборот). В таких случаях часто бывают реверсии – возвращение структуры ДНК в исходное состояние. Также может быть включение дополнительной пары оснований (дупликация) или потеря (делеция) пары оснований. Реверсии обычно редки. Возникают также перемещения (транслокации) группы оснований или даже генов в пределах хромосомы. Здесь практически реверсий не бывает. Возможен поворот ДНК на 180 градусов – изменение ориентации сегмента ДНК (инверсия).

Могут возникать также структурные искажения ДНК (или мутации деформации спирали ДНК). Они могут возникать, например,в результате димеризации расположенных близко нуклеотидов, особенно тимина, под действием ультрафиолета, что препятствует правильной репликации.

Как уже упоминалось, мутации могут быть связаны и с подвижными элементами генома – с перемещением инсерционных последовательностей и транспозонов по хромосоме бактерии или из репликона в репликон (из хромосомы в плазмиду и наоборот). При транспозиции они могут вызывать делеции или инверсии генетического материала, а при включении в новый участок ДНК – дупликации.

По расположению мутации делятся на нуклеоидные и цитоплазменные (за счет плазмид).

По направлению выделяют прямые и обратные мутации

Прямые – это изменения бактерий «дикого» типа. «Дикий» тип представляет собой комплекс наследственных признаков клеток в естественных условиях обитания. Обратные мутации – это возврат от измененного типа к «дикому». Данный процесс может осуществляться и другим способом. Могут возникать мутации, подавляющие фенотипические проявления исходных (прямых) мутаций. Такие мутации называются супрессорными или вторичными.

По фенотипическим последствиям выделяют нейтральные мутации – фенотипически не проявляются; условно-летальные и летальные.

Мутации, которые ведут к изменению (обычно – ограничению), но не к исчезновению функциональной активности фермента, называют условно-летальными. Некоторые температурочувствительные мутанты сохраняют способность к синтезу ферментов, активных при 37⁰С, но не способных к катализу при при 42⁰С. У бактерий же дикого типа эти ферменты функционируют при обеих температурах.

Летальные мутации ведут к полной потере способности синтезировать жизненно важный фермент или ферменты, что ведет к гибели бактериальной клетки.

Мутации проявляются в фенотипе в виде утраты или изменения морфологических и биохимических признаков (например, жгутиков, пилей, капсулы, клеточной стенки; способности ферментировать какие-либо углеводы, синтезировать определенные аминокислоты, витамины и другие соединения, возникновении устойчивости к лекарственным или дезинфицирующим веществам и т.д.)

Оценку мутаций на молекулярном уровне проводят путем определения последовательности ДНК соответствующих генов (секвенирования). На клеточном уровне мутации выявляют по фенотипическим изменениям – по утрате или приобретению конкретного белка или изменению его функции (ферментативной или регуляторной активности). Для оценки мутаций на уровне популяции определяют частоту появления мутаций и проводят последующую селекцию измененных клеток в популяции для дальнейшего изучения.

У бактерий в результате мутаций могут меняться самые различные свойства: вирулентность, чувствительность к антибиотикам, биохимические свойства. Мутанты, нуждающиеся для своего развития в определенных ростовых факторах (аминокислотах, азотистых основаниях и т.д.), называются ауксогетеротрофными. Они не имеют ферментов для их синтеза и сохраняют жизнеспособность лишь при наличии в среде соответствующих факторов роста.

Диссоциация – это особый, присущий только бактериям вид изменчивости, при котором происходит расщепление в пределах одного вида на S- и R-формы микроорганизмов. Это явление впервые исследовали Э.Вейльи А.Феликс (1917 г.).

В основу этого подразделения положены генетические перестройки, приводящие к изменению ряда свойств (культуральных, антигенных, биохимических). Так, S-формы (англ. smooth – гладкий) чаще вирулентны, обладают хорошо выраженными антигенными свойствами, имеют капсулу, на средах дают рост мелких блестящих колоний. R-формы (англ. rough – грубый, неровный) реже вирулентны, не имеют капсулы, колонии крупные, шероховатые.

Однако не у всех микробов S-форма свидетельствует о вирулентности. Так сибиреязвенные культуры, возбудители туберкулеза и чумы вирулентны в R-форме.

Диссоциация обычно протекает в одном направлении: от S- к R-форме, иногда через промежуточные стадии образования слизистых колоний.

Причиной диссоциации могут быть мутации, возникающие после встраивания внехромосомных факторов наследственности (эписом и умеренных фагов) в нуклеоид. Мутации сопровождают и процессы встраивания в нуклеоид транспозонов и инсерционных последовательностей. Если эти мутации нарушают функцию оперонов, которые отвечают за образование липополисахаридов клеточной стенки микроба, то образуются R-формы. Они дают шероховатые колонии, меняют антигенные свойства и ослабляют патогенность. Тем не менее, у дифтерийных бактерий S-R-диссоциация связана с их лизогенизацией бактериофагом; при этом R-формы образуют токсин, и их вирулентность резко увеличивается.

Значение диссоциации заключается в получении бактериями селективных преимуществ, обеспечивающих их существование в организме человека или во внешней среде. Например, S-формы более устойчивы к фагоцитозу. R-формы, в свою очередь, более устойчивы к факторам окружающей среды.

Репарации

Большинство изменений генетического кода, возникающих в результате мутаций, ведут к нарушению структуры и функции бактериальных клеток и часто являются летальными. Лишь небольшое количество из них является приспособительными и закрепляется отбором. Отсюда в процессе эволюции неизбежно возникли мощные механизмы, приводящие к восстановлению структуры поврежденной ДНК. Такие системы получили название репарационных, а сам процесс восстановления – репарации.

Эти системы состоят из многочисленных ферментов, контролирующих состояние ДНК.

Типичным примером репарационных систем является система фотореактивации. Она активизируется при образовании тиминовых димеров в ДНК под действием ультрафиолетового облучения. Ферменты, ответственные за фотореактивацию (в частности – фотолиаза), действуют в присутствии видимого света и деполимеризуют тиминовые димеры до исходных мономеров.

Аналогичная система, функционирующая в отсутствие видимого света, называется системой темновой репарации.

Существуетдорепликативная и пострепликативная репарация, которые отличаются по механизмам.

В случае дорепликативной репарации происходит выявление поврежденных участков и их эксцизия (вырезание) эндонуАклеазами с последующим удалением. Далее осуществляется синтез поврежденной цепи по матрице сохранившейся и сшивание участков ДНК-лигазой.

Пострепликативная репарация обеспечивается рекомбинационными процессами с замещением поврежденных участков.

Особое место в жизнедеятельности как отдельных бактериальных клеток, так и всей микробной популяции в целом занимает так называемая SOS-репарация или SOS-ответ.

SOS-ответ представляет собой индуцируемую реакцию клеток на резкую остановку синтеза нуклеиновых кислот, вызванную обширным повреждением ДНК, голоданием клетки или другими факторами. Это крайний ответ клетки на критическое состояние, приближающее ее к гибели. У Е. соli результатом SOS-ответа является индукция синтеза около 25 белков, имеющих прямое отношение к репарации, рекомбинации и синтезу ДНК.

Этот вид репарации у микробов контролируется так называемой SOS-областью (или SOS-регулоном). В норме эта область находится в репрессированном состоянии и активируется лишь в критические для клетки моменты. Возникает взрыв генетических процессов – возрастает частота мутаций как точечных, так и по типу сдвига рамки считывания, увеличивается частота хромосомных перестроек, активируются специализированные системы делеции ДНК, возрастает частота рекомбинационных обменов, и наконец, становится возможной запрещенная межвидовая рекомбинация.

Задача SOS-индуцированного мутагенеза – заставить ДНК-полимеразу пройти повреждение даже ценой ошибки.

SOS-ответ имеет весьма важное значение для развития микробной популяции в целом. К настоящему времени уже выяснено, что и эволюция генома, и шоковая адаптация популяции к изменившимся внешним условиям происходит не только путем постепенного накопления необходимого числа мутаций для получения нового признака. Лишь горизонтальный (в том числе – межвидовой) перенос блоков, составляющих гены, или даже целых генов, может обеспечить моментальное приобретение нужного качества.

+В природной популяции Е. соli до 1% клеток имеют мутантный фенотип. Таково условие выживания данной популяции. В благоприятных же искусственных условиях число клеток-мутантов снижается на несколько порядков. Отсюда для постоянно идущего процесса эволюционной изменчивости более выгодны стрессовые ситуации, предусматривающие, в частности, межвидовой обмен генетическим материалом. Это и обеспечивает индуцибельная система SOS

31 Рекомбинации у бактерий

Генетическая рекомбинация — это взаимо­действие между двумя геномами, т. е. между двумя ДНК, обладающими различными ге­нотипами, которое приводит к образованию рекомбинантной ДНК, формированию до­чернего генома, сочетающего гены обоих родителей.

Отсутствие полового размножения и мей-оза, в процессе которых у высших организ­мов происходит рекомбинация, гаплоидный набор генов и определяют особенности ре­комбинации у бактерий. В процессе реком­бинации бактерии условно делятся на клет­ки-доноры, которые передают генетический материал, и клетки-реципиенты, которые воспринимают его. В клетку-реципиент проникает не вся, а только часть хромо­сомы клетки-донора, что приводит к фор­мированию неполной зиготы — мерозиготы. В результате рекомбинации в мерозиготе об­разуется только один рекомбинант, генотип которого представлен в основном генотипом реципиента, с включенным в него фрагмен­том хромосомы донора. Реципроктные ре-комбинанты не образуются.

По молекулярному механизму генетичес­кая рекомбинация у бактерий делится на три вида: гомологичную, сайт-специфическую и незаконную.

5.3.1. Гомологичная рекомбинация

При гомологичной рекомбинации в процессе раз­рыва и воссоединения ДНК происходит обмен меж­ду участками ДНК, обладающими высокой степенью гомологии. Гомологичная рекомбинация происхо­дит через образование промежуточного соединения, крестообразной структуры Холидея или полухиаз­мы (рис. 5.3). В полухиазме осуществляется комп­лементарное спаривание между одноцепочечными участками, принадлежащими разным родительским молекулам ДНК. Процесс гомологичной рекомби­нации находится под контролем генов, объединен-ных в REC-систему, состоящую из генов recA,B,C,D. Продукты этих генов производят расплетание нитей ДНК и их переориентацию с образованием структу­ры Холидея, а также разрезают структуру Холидея для завершения процесса рекомбинации.

5.3.2. Сайт-специфическая рекомбинация

Происходит в определенных участках генома и не требует высокой степени гомологии ДНК. Этот тип рекомбинации не зависит от функционированиягенов recA,B,C,D. Примером этого типа рекомби­нации является встраивание плазмиды в хромосому бактерий, которое происходит между идентичными IS-элементами хромосомы и плазмиды, интеграция ДНК фага в хромосому Е. coli. Сайт-специфическая рекомбинация, происходящая в пределах одного репликона, участвует также в переключении актив-

Рис, 5.4. Схемы: 1 — конъюгации у бактерий; 2 — трансдукции; 3 — трансформации

ности генов. Например, у сальмонелл следствием этого процесса являются фазовые вариации жгути­кового Н-антигена.

5.3.3. Незаконная или репликативная рекомбинация

Незаконная или репликативная рекомбинация не зависит от функционирования генов recA,B,C,D. Примером ее является транспозиция подвижных ге­нетических элементов по репликону или между реп-ликонами, при этом, как уже было отмечено в разд. 5.1.3, транспозиция подвижного генетического эле­мента сопровождается репликацией ДНК.

+Рекомбинация у бактерий является конечным эта­пом передачи генетического материала между бакте­риями, которая осуществляется тремя механизмами: конъюгацией (при контакте бактерий, одна из кото­рых несет конъюгативную плазмиду), трансдукцией (при помощи бактериофага), трансформацией (при помощи высокополимеризованной ДНК) (рис. 5.4).

32 Методы изучения морфологии и структуры бактерии

Для изучения морфологии микроорганизмов необходим микроскоп. В микробиологии используют два вида микроскопии – электронную и световую.

А. Электронная микроскопия используется специализированными лабораториями.

1. Для ее осуществления необходим электронный микроскоп

Рис. 6-1. Электронный микроскоп (лаборатория Нижегородского университета, Россия)

2. Принцип его действия заключается в том, что вместо световой волны используется пучок электронов, что позволяет увеличить чувствительность метода на несколько порядков.

3. Электронная микроскопия используется для обнаружения и изучения вирусов, а также для изучения ультраструктуры бактериальной клетки.

Б. Световая микроскопия может использоваться и обычными лабораториями.

1. Обычная световая микроскопия используется в микробиологической практике сравнительно редко. В обиходе микробиологов этот метод часто называется «сухим», в противоположность иммерсионному методу микроскопии.

а. Для этого вида микроскопии используется обычный биологический микроскоп (Рис. 6-2).

б. Принцип действия этого микроскопа рассматривается в курсе физики.

в. «Сухой» объектив может использоваться, например, для микроскопирования препарата «придавленная капля» при определении подвижности бактерий.

2. При иммерсионной микроскопии используется специальное иммерсионное масло.

а. В качестве иммерсионного микроскопа служит обычный биологический микроскоп, но оснащенный специальным объективом (маркированным черной полосой).

б. Принцип метода заключается в том, что иммерсионное масло, обладая коэффициентом преломления чрезвычайно близким к коэффициенту преломления стекла, делает потерю световых лучей на границе сред стекло предметного стекла/масло и масло/стекло объектива минимальной, что улучшает качество микроскопической картины и увеличивает разрешающую способность микроскопа.

в. Именно иммерсионная микроскопия используется в бактериологии наиболее часто.

3. Более редко в бактериологии используется темнопольная микроскопия.

а. С этой целью обычный биологический микроскоп оснащается специальным темнопольным конденсором.

б. Принцип его действия заключается в том, что все прямые лучи минуют объектив, куда попадают лишь те из них, которые преломились на объекте микроскопирования. Поэтому микроорганизмы видны как светящиеся объекты на темном фоне.

в. Темнопольная микроскопия наиболее часто используется для обнаружения спирохет, так как позволяет визуализировать очень тонкие объекты.

4. В ряде случаев в бактериологических лабораториях используется фазово-контрастная микроскопия.

а. Для этого обычный биологический микроскоп оснащается специальной приставкой с особым набором линз (Рис. 6-3).

б. Принцип её действия заключается в том, что смещение фазы световой волны, происходящее при её прохождении через прозрачные для нашего глаза объекты и не воспринимаемое человеческим глазом (собственно именно поэтому такие объекты и выглядят прозрачными), преобразовывается в изменение амплитуды световой волны. А изменение этого параметра воспринимается нашим глазом – объект становится видимым.

в. Фазово-контрастная микроскопия используется, как правило, для обнаружения очень тонких (например, спирохеты, жгутики бактериальной клетки) или высоко прозрачных (например, микоплазмы) объектов.

5. И бактериологические и иммунологические и вирусологические лаборатории не могут считаться современными без возможности использования люминесцентной микроскопии.

а. Для этой цели служит особый люминесцентный микроскоп (Рис.6-4).

б. Принцип её действия заключается в том, что используемые при обработке мазка для этого вида микроскопии особые, люминесцентные, красители вызывают свечение микроскопируемого объекта под воздействием коротковолнового (чаще всего – синего) света, которым он освещается (явление наведённой люминесценции).

в. Люминесцентная микроскопия широко используется в современной микробиологии.

1. Для выявления в мазке некоторых видов бактерий используются специальные флюоресцентные красители, обуславливающие специфическое свечение изучаемых микроорганизмов.

а. Для выявления возбудителя сибирской язвы используется родамин.

б. Красное свечение зёрнам волютина, наличие которых позволяет идентифицировать коринебактерии, обуславливает корефосфин.

в. Аурамин используется для выявления микобактерий туберкулёза, которые, при обработке мазка этим флюорохромом и микрокопировании его в люминесцентном микроскопе, выглядят как жёлтые палочки на зелёном фоне.

+2. Люминесцентная микроскопия используется также для оценки реакции иммунофлюоресценции. Если антитела диагностической сыворотки адсорбируются на поверхности клетки, содержащий выявляемый антиген, то в люминесцентном микроскопе такая клетка будет окружена жёлто-зелёным ободком, так как антитела флюоресцирующей сыворотки метятся специальным флюорохромом – флюоресцеинизотиоционатом натрия (ФИТЦ).

33. Антигенная структура бактерий.

Антигенная специфичность и антигенное строение бактерий.

Для характеристики микроорганизмов выделяют родовую, видовую, групповую и типовую специфичность антигенов. Наиболее точная дифференциация осуществляется с использованием моноклональных антител (МКА), распознающих только одну антигенную детерминанту.

Обладая сложным химическим строением, бактериальная клетка представляет целый комплекс антигенов. Антигенными свойствами обладают жгутики, капсула, клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, рибосомы и другие компоненты цитоплазмы, токсины, ферменты.

Основными видами бактериальных антигенов являются:

- соматические или О- антигены (у грамотрицательных бактерий специфичность определяется дезоксисахарами полисахаридов ЛПС);

- жгутиковые или Н- антигены (белковые);

- поверхностные или капсульные К- антигены.

Выделяют протективные антигены, обеспечивающие защиту (протекцию) против соответствующих инфекций, что используется для создания вакцин.

Суперантигены (некоторые экзотоксины, например- стафилококковый) вызывают чрезмерно сильную иммунную реакцию, часто приводят к побочным реакциям, развитию иммунодефицита или аутоиммунных реакций.

Антигены гистосовместимости.

При пересадках органов возникает проблема совместимости тканей, связанная со степенью их генетического родства, реакциями отторжения чужеродных аллогенных и ксеногенных трансплантатов, т.е. проблемами трансплантационного иммунитета. Существует ряд тканевых антигенов. Трансплантационные антигены во многом определяют индивидуальную антигенную специфичность организма. Сопокупность генов, определяющих синтез трансплантационных антигенов, получила название главной системы гистосовместимости. У людей она часто называется системой HLA (Human leucocyte antigens), в связи с четким представительством на лейкоцитах трансплантационных антигенов. Гены этой системы расположены на коротком плече хромосомы С6. Система HLA- это система сильных антигенов. Спектр молекул МНС уникален для организма, что определяет его биологическую индивидуальность и позволяет различать “чужое- несовместимое”.

Семь генетических локусов системы разделены на три класса.

Гены первого класса контролизуют синтез антигенов класса 1, определяют тканевые антигены и контролируют гистосовместимость. Антигены класса 1 определяют индивидуальную антигенную специфичность, они представляют любые чужеродные антигены Т- цитотоксическим лимфоцитам. Антигены класса 1 представлены на поверхности всех ядросодержащих клеток. Молекулы МНС класса 1 взаимодействуют с молекулой CD8, экспрессируемой на мембране предшественников цитотоксических лимфоцитов (CD- claster difference).

Гены МНС класса 2 контролируют антигены класса 2. Они контролируют ответ к тимусзависимым антигенам. Антигены класса 2 экспрессированы преимущественно на мембране иммунокомпетентных клеток (прежде всего макрофагов и В- лимфоцитов, частично- активированных Т- лимфоцитов). К этой же группе генов (точнее- области HLA- D) относятся также гены Ir - силы иммунного ответа и гены Is - супрессии иммунного ответа. Антигены МНС класса 2 обеспечивают взаимодействие между макрофагами и В- лимфоцитами, участвуют во всех стадиях иммунного ответа- представлении антигена макрофагами Т- лимфоцитам, взаимодействии (кооперации) макрофагов, Т- и В- лимфоцитов, дифференцировке иммунокомпетентных клеток. Антигены класса 2 принимают участие в формировании противомикробного, противоопухолевого, трансплантационного и других видов иммунитета.

Структуры, с помощью которых белки МНС классов 1 и 2 связывают антигены (так называемые активные центры) по уровню специфичности уступают только активным центрам антител.

Гены МНС класса 3 кодируют отдельные компоненты системы комплемента.

Процессинг антигенов- это их судьба в организме. Одной из важнейших функций макрофагов является переработка антигена в иммуногенную форму (это собственно и есть процессинг антигена) и представление его иммунокомпетентным клеткам. В процессинге, наряду с макрофагами, участвуют В- лимфоциты, дендритные клетки, Т- лимфоциты. Под процессингом понимают такую переработку антигена, в результате которой пептидные фрагменты антигена (эпитопы), необходимые для передачи (представления), отбираются и связываются с белками МНС класса 2 (или класса 1). В таком комплексном виде антигенная информация передается лимфоцитам. Дендритные клетки имеют значение в фиксации и длительном хранении (депонировании) переработанного антигена.

Экзогенные антигены подвергаются эндоцитозу и расщеплению в антиген- представляющих (презентирующих) клетках. Фрагмент антигена, содержащий антигенную детерминанту, в комплексе с молекулой класса 2 МНС транспортируется к плазматической мембране антиген- представляющей клетки, встраивается в нее и представляется CD4 Т- лимфоцитам.

+Эндогенные антигены - продукты собственных клеток организма. Это могут быть вирусные белки или аномальные белки опухолевых клеток. Их антигенные детерминанты представляются CD8 Т- лимфоцитам в комплексе с молекулой класса 1 МНС.

34. Бактериофаги.

Вирусы бактерий (бактериофаги).

Естественной средой обитания фагов является бактериальная клетка, поэтому фаги распространены повсеместно (например, в сточных водах). Фагам присущи биологические особенности, свойственные и другим вирусам.

Наиболее морфологически распространенный тип фагов характеризуется наличием головки- икосаэдра, отростка (хвоста) со спиральной симметрией (часто имеет полый стержень и сократительный чехол), шипов и отростков (нитей), т.е. внешне несколько напоминают сперматозоид.

Взаимодействие фагов с клеткой (бактерией) строго специфично, т.е. бактериофаги способны инфицировать только определенные виды и фаготипы бактерий.

Основные этапы взаимодействия фагов и бактерий.

1.Адсорбция (взаимодействие специфических рецепторов).

2.Внедрение вирусной ДНК (инъекция фага) осуществляется за счет лизирования веществами типа лизоцима участка клеточной стенки, сокращения чехла, вталкивания стержня хвоста через цитоплазматическую мембрану в клетку, впрыскивание ДНК в цитоплазму.

3.Репродукция фага.

4.Выход дочерних популяций.

Основные свойства фагов.

Различают вирулентные фаги, способные вызвать продуктивную форму процесса, и умеренные фаги, вызывающие редуктивную фаговую инфекцию (редукцию фага). В последнем случае геном фага в клетке не не реплицируется, а внедряется (интегрируется) в хромосому клетки хозяина (ДНК в ДНК), фаг превращается в профаг. Этот процесс получил название лизогении. Если в результате внедрения фага в хромосому бактериальной клетки она приобретает новые наследуемые признаки, такую форму изменчивости бактерий называют лизогенной (фаговой) конверсией. Бактериальную клетку, несущую в своем геноме профаг, называют лизогенной, поскольку профаг при нарушении синтеза особого белка- репрессора может перейти в литический цикл развития, вызвать продуктивную инфекцию с лизисом бактерии.

Умеренные фаги имеют важное значение в обмене генетическим материалом между бактериями- в трансдукции (одна из форм генетического обмена). Например, способностью вырабатывать экзотоксин обладают только возбудитель дифтерии, в хромосому которого интегрирован умеренный профаг, несущий оперон tox, отвечающий за синтез дифтерийного экзотоксина. Умеренный фаг tox вызывает лизогенную конверсию нетоксигенной дифтерийной палочки в токсигенную.

По спектру действия на бактерии фаги разделяют на :

- поливалентные (лизируют близкородственные бактерии, например сальмонеллы);

- моновалентные (лизируют бактерии одного вида);

- типоспецифические (лизируют только определенные фаговары возбудителя).

На плотных средах фаги обнаруживают чаще с помощью спот (spot) - теста (образование негативного пятна при росте колоний) или методом агаровых слоев (титрования по Грациа).

Практическое использование бактериофагов.

1.Для идентификации (определение фаготипа).

2.Для фагопрофилактики (купирование вспышек).

3.Для фаготерапии (лечение дисбактериозов).

+4.Для оценки санитарного состояния окружающей среды и эпидемиологического анализа.

35 Стафилококки. Принципы классификации. Значение в патологии человека. Диагностика стафилококковых инфекций и бактерионосительства

Стафилококки Отдел Firmicutes, семейство Micrococcaceae, род Staphylococcus. 3 вида: S. aureus, S. epidermidis и S. saprophyticus.

Все виды стафилококков представляют собой округлые клетки диаметром 0,5—1 мкм. В мазке располагаются обычно несимметричными гроздьями («гроздья винограда»), но встречаются одиночные клетки, пары клеток. Грамположительны. Спор не образуют, жгутиков не имеют. У некоторых штаммов можно обнаружить капсулу. Могут образовывать L-формы. Клеточная стенка содержит большое количество пептидогликана, связанных с ним тейхоевых кислот, протеин А.

К факторам патогенности стафилококков относятся фер-менты коагулаза, гиалуронидаза, фибринолизин, ДНК-аза, леци-товителлаза и др. Коагулаза -- бактериальная протеиназа, свер-тывающая плазму крови животных. Наличие коагулазы является одним из наиболее важных и постоянных критериев патогенности стафилококков.

Патогенные стафилококки синтезируют и секретируют высокоактивные экзотоксины и ферменты. Среди экзотоксинов выделяют четыре типа гемотоксинов (стафилолизи-нов), лейкоцидин и энтеротоксины.

К гемотоксинам относятся альфа-, бета-, гамма- и дельта-гемо-лизины.

Альфа-гемолизин вызывает лизис эритроцитов овец, свиней, собак, обладает болезни - группа весьма различных заболеваний, обусловленная стафилококками. Основные проявления стафилококковой инфекции - гнойные заболевания кожи и подкожной клетчатки, стафилококковый сепсис, синдром токсического шока, пневмонии, ангины, энтероколит, отравление стафилококковым энтеротоксином и поражение центральной нервной системы.

Иммунитет после перенесенной инфекции нестоек и, в общем-то, несущественен, так как при встрече с новым подвидом стафилококка, производящим другие токсины, все предыдущие иммунные «приобретения» значимой защитной роли не несут.

Эпидемиология. Эпидермальный и другие коагулазоотрицательные стафилококки являются частью нормальной микрофлоры кожных покровов, слизистых оболочек и нижнего отдела кишечника. Здоровое носительство золотистого стафилококка в нижних носовых ходах наблюдается у 70-90% обследованных, у некоторых из них (20%) носительство может продолжаться длительное время. Носительство чаще наблюдается у медицинского персонала. В отдельных случаях стафилококковое заболевание может возникнуть за счет эндогенной инфекции, при ослаблении защитных сил макроорганизма или при дисбактериозе. Так, при лечении антибиотиками широкого спектра действия возможны тяжелые стафилококковые энтероколиты. Возможна передача инфекции с инструментами, перевязочным материалом, предметами ухода, а также пищевыми продуктами.

Лечение стафилококковых инфекций обычно проводят антибиотиками и сульфаниламидными препаратами. В последние годы от больных часто выделяют стафилококки, резистентные к большинству химиотерапевтических препаратов. В таких случаях для лечения используют антитоксическую противостафилококковую плазму или иммуноглобулин, полученные из крови доноров, иммунизированных стафилококковым анатоксином. Для активной иммунизации (плановых хирургических больных, беременных женщин) может быть использован адсорбированный стафилококковый анатоксин.

Микробиологическая диагностика

бактериологическая диагностика, то есть выделение чистой культуры и идентификацияю. Материал от больных и бактерионосителей засевают немедленно или не позднее 3-4 ч после взятия при условии хранения его на холоде. делают посевы на кровяной агар и элективные для стафилококков среды или молочно-желтково-солевой агар. Чашки с посевами инкубируют при 37 ° С в течение 48 часов. На второй день производят высев из сахарного бульона на указанные элективные среды, исследуют массивность роста и характер колоний после посевов других материалов. На кровяном агаре стафилококки образуют непрозрачные, слегка выпуклые колонии средних размеров с гладкой, блестящей, словно полированной поверхностью, четко очерченным краем, маслянистой консистенции.

Бактериоскопический. Из патологического материала готовят мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. Прямая микроскопия позволяет дать только предварительный ответ. Одновременно сеют материал в чашки с кровяным, молочно-солевым и желточно-солевым агаром.

Выявляют летальные свойства культуры на кроликах и проводят дерматонекротическую пробу.

Специфическая профилактика:

1) получен препарат из экзотоксина - анатоксин, его используют для вакцинации беременных женщин, у них возникает антитоксический иммунитет, который передается через плаценту ребенку.

2) стафилококковый ?-глобулин - получают из крови доноров, иммунизированных анатоксином, создают пассивный иммунитет (используют так и для лечения).

3) стафилококковая аутовакцина - получают из штаммов staph, выделенных от больных. Используют при хронических инфекциях для активации иммунитета.

4) лечить носителей и больных.

5) разделение гнойного и чистого отделений в больнице

6) прививают рожениц анатоксином, который трансплацентарно передаётся плоду.

9.Проблема госпитальной стафилококковой инфекции в педиатрии. Значение носительства стафилококков у работников в детских учреждениях. Принципы санации носителей. Методы эпидемиологического анализа госпитальных стафилококковых инфекций.

Особое-проблема – профилактика стафилококковых заболеваний у новорожденных. В профилактику включается иммунизация рожениц анатоксином, а также проведение количественного и качественного анализа обсемененности молока рожениц. Наиболее опасноны насители инфекции, слизистых верхних дыхательных путей, с кожными поражениями.

10.Стрептококки, их классификация (Ленсфильд). Общая характеристика стрептококков, факторы патогенности. Роль стрептококков группы А и В в патологии человека. Микробиологическая диагностика стрептококковых заболеваний.

Стрептококки Отдел Firmicutes, семейство Streptococcaceae, род Streptococcus. В род Streptococcus входят более 20 видов, среди которых есть представители нормальной микрофлоры человеческого тела и возбудители тяжелых инфекционных эпидемических заболеваний человека.

Более совершенной оказалась классификация, предложенная Ленсфильд (1933) и Гриффитсом (1935), основанная на антигенной структуре стрептококков. Согласно этой классификации, все стрептококки были разбиты по групповому С-антигену на 17 групп — от А до S. Данные о распространении отдельных групп приведены в табл. 2.

мелкие (меньше 1 мкм) шаровидные клетки, располагающиеся цепочками или попарно, грамположитель-ны, спор не образуют, неподвижны. Большинство штаммов стрептококков образуют капсулу, состоящую из гиалуроновой кислоты. Клеточная стенка содержит белки (М-, Т- и R-антиге-ны), углеводы (группоспецифические) и пептидогликаны. Легко переходят в L-формы.

Растут на средах, обогащенных углеводами, кровью, сывороткой, асцитической жидкостью. На плотных средах обычно формируют мелкие серые колонии. На жидких средах для стрептококков характерен придонный рост. Стрептококки — факультативные анаэробы. На кровяном агаре вызывают а-гемолиз (зеленящий) и р-гемолиз (полный). Погибают при пастеризации при 56 °С в течение 30 мин.

Факторы патогенности

Патогенные стрептококки продуцируют экзотоксины различного действия.

Гемолизин обусловливает разрушение эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, макрофагов; при внутривенном введении кроликам вызывает гемоглобинемию и гематурию.

Лейкоцидин разрушает лейкоциты или угнетает их фагоцитарные свойства.

Летальный токсин (некротоксин) при внутрикожном введении кролику вызывает некроз. Некротическому действию могут подвергаться паренхиматозные органы и другие ткани.

Кроме экзотоксинов патогенные стрептококки продуцируют ферменты гиалуронидазу, фибринолизин, дезоксирибонуклеазу, рибонуклеазу, нейраминидазу, протеиназу, стрептокиназу, амилазу, липазу, а также эндотоксины, которые характеризуются термостабильностью. Экзотоксины, например, термолабильны: гемолизин инактивируется при температуре 55 °С в течение 30 мин, лейкоцидин -- при 70 °С. Наиболее термоустойчив фибринолизин, не разрушающийся при кипячении до 50 мин.

Группыстрептококков. Современная классификация основывается на определении антигенной структуры стрептококков, позволяющей под-разделить все стрептококки на 17 серологических групп, обозначаемых латинскими буквами в порядке алфавита. Практический интерес представляют серогруппы А, В, С, D, E, F. Группа А -- возбудители большого числа инфекций у человека; группа В -- возбудители мастита у коров; группы В, С, D, Е -- возбудители инфекций у животных разных видов. Антигеном, который позволяет разделить стрептококки на серогруппы, является полисахарид (С-вещество), входящий в состав клеточной стенки стрептококков.

Химическая природа стрептококковых антигенов неодинакова. В группе А ими являются белковые антигены М, R и Т.

Лечение Лечение стрептококковой инфекции проводится с использованием антибиотиков пенициллинового ряда : бензилпенициллин, ампициллин, бициллин-3. Устойчивость против пенициллиновых антибиотиков стрептококки приобрести не способны

Для выведения токсинов из организма необходимо обильное питье до 3-х литров жидкости в сутки.

Иммунитет после перенесенной стрептококковой инфекции нестоек, поэтому человек может неоднократно болеть стрептококковыми заболеваниями (исключение составляет один из компонентов – против токсинов вырабатываемых стрептококком, он остается на всю жизнь, обеспечивая защиту от повторного заболевания скарлатиной).

Лабораторная диагностика.

Бактериологический При подозрении на сепсис сеют у постели больного 10-15 мл крови во флакон, содержащий 100-150 мл сахарного бульона (соотношение крови и среды 1:10). Лучшие и надежные результаты дают посевы крови в среду Китт-Тароцци с полужидким агаром. В нем будут расти и анаэробные стрептококки. Посевы крови инкубируют в термостате при 37 ° С. При росте стрептококков на дне среды появляется осадок. В среде Китт-Тароцци может образовываться и газ. В мазках из осадка обнаруживают грамположительные стрептококки в виде длинных цепочек.

+Бактериоскопический Патологический материал (слизистые истечения из носовых отверстий, гнойный экссудат или пунктат подчелюстных лимфоузлов), направленный в лабораторию, исследуют по общей схеме: микроскопия мазков; посев поступившего материала на питательные среды для выделения чистой культуры стрептококков и их идентификации; биологическая проба -- на белых мышах, кошках, особенно на котятах. Последние гибнут от одной десятимиллионной дозы бульонной культуры при подкожном заражении в течение 3--10 дней.