фарм химия дневник. Программа и дневник практики
 Скачать 5.43 Mb.
|
|
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) Высокоэффективная жидкостная хроматография (жидкостная хроматография высокого давления) является вариантом колоночной жидкостной хроматографии, в которой подвижная фаза – элюент – проходит через заполняющий колонку сорбент с большей скоростью за счет значительного давления на входе в хроматографическую колонку. Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным способом разделения, препаративного выделения и проведения количественного и качественного анализа нелетучих термолабильных соединений как с малой, так и с большой молекулярной массой. Основными узлами современного жидкостного хроматографа являются: насос высокого давления, дозатор, высокоэффективнная колонка, детектор с регистрирующим устройством. Современные жидкостные хроматографы могут быть снабжены микропроцессором и устройствами, с помощью которых можно автоматически производить ввод пробы, поддерживать условие хроматографического процесса по заданной программе, автоматически оптимизировать условия разделения, проводить расчет количественного состава анализируемой смеси по одной или нескольким программам и проводить качественный анализ. Насос высокого давления (до 200–500 атм) обеспечивает подачу элюента в колонку с заданной постоянной скоростью. В некоторых микроколоночных хроматографах применяются насосы сравнительно низкого давления (до 10–20 атм). Хроматографические колонки из нержавеющей стали (или из стекла) длиной 10–25 см с внутренним диаметром 0,3–0,8 см (чаще 0,4–0,5 см) заполняются адсорбентом с диаметром частиц 5–10 мкм сферической или неправильной формы с помощью суспензионного метода, что дает возможность получить более равномерную и плотную упаковку частиц сорбента в колонке. Заполнение колонки проводится при больших давлениях, чем рабочее давление в хроматографе. В микроколоночных хроматографах используются колонки меньшей длины и меньшего внутреннего диаметра (0,1–0,2 см и меньше). Частицы адсорбента не должны разрушаться при заполнении колонки под большим давлением. Плотная упаковка частиц адсорбента малого диаметра (5–10 мкм) в колонке позволяет получить высокоэффективное хроматографическое разделение компонентов смеси. Температура хроматографических колонок может поддерживаться с точностью ±0,1°С в интервале, ограниченном температурой замерзания и кипения элюента. Чаще всего разделение проводят в интервале температур 20–50°С. В качестве детекторов в жидкостной хроматографии обычно используют спектрофотометрический детектор в переменной (190–900 нм) или фиксированной (чаще при 254 нм) длиной волны, рефрактометрический или флуориметрический детекторы. Могут быть использованы и другие детекторы, например ионизационно-пламенный, электрохимические, масс-спектрометрический и т. д. В качестве адсорбентов чаще всего применяют силикагель с гидроксилированной поверхностью и силикагель с привитыми к поверхности различными функциональными группами, реже используются окись алюминия и полимерные адсорбенты. На практике обычно применяют готовые колонки. При работе с колонками, заполненными силикагелем, в качестве элюента используют углеводороды иногда с добавлением небольшого количества спирта или других растворителей. В обращеннофазной хроматографии применяют колонки, заполненные силикагелем с привитыми гидрофобными группами, и в качестве элюента – водные растворы, содержащие низшие спирты или ацетонитрил. Во многих случаях не требуется дополнительная очистка растворителей, но иногда тщательная очистка растворителей необходима. Для разделения органических соединений в виде солей, а также кислот и оснований применяют ион-парную хроматографию. В этом случае применяют адсорбенты с привитыми гидрофобными группами, а в элюент, обычно водно-спиртовой или водно-ацетонитрильный, добавляют ионные соединения, анион или катион которых содержит гидрофобную группу. Для разделения органических катионов или анионов применяют ионнообменную жидкостную хроматографию. В этом случае разделение проводят на адсорбентах с сульфо- или карбоксильными группами и замещенными или незамещенными аминогруппами различной основности, а в качестве элюента – водные буферные растворы с соответствующими рН и ионной силой. Для разделения веществ, способных образовывать комплексы с катионами металлов, в частности для разделения оптических изомеров аминокислот, используют лигандо-обменную хроматографию, в которой разделение основано на различии в способности анализируемых веществ образовывать координационные связи в координационной сфере присутствующего в системе комплексообразующего иона металла. В этом случае применяют адсорбенты, на поверхности которых имеются группы, способные образовывать комплексы с ионами металлов и разделяемым веществом. Для характеристики и разделения высокомолекулярных соединений (молекулярная масса выше 103) применяют эксклюзионную (ситовую) хроматографию, которая обеспечивает разделение веществ в соответствии с размерами их молекул. В качестве адсорбентов используют гидроксилированные силикагели с различным диаметром пор или аналогичные силикагели с привитыми диольными и другими группами, а также различные гели. Степень разделения веществ в колонке определяется расстоянием между максимумами двух соседних пиков и шириной хроматографической полосы. Расстояние между максимумами зависит от селективности адсорбента по отношению к разделяемым веществам, а ширина полосы – от эффективности колонки, которая определяется характером упаковки частиц адсорбента, вязкостью элюента, размыванием в соединительных узлах и детекторе. Высокоэффективная колонка способна разделять вещества и при малой селективности адсорбента. Для определения содержания каждого компонента в смеси необходимо провести количественную оценку хроматограммы с использованием методов абсолютной калибровки или внутреннего стандарта (см. раздел «Газожидкостная хроматография»). Если примеси близки по строению, то качественно их содержание можно оценить по соотношению пиков на хроматограмме. Однако если чувствительность детектора по отношению к примесям разная, то такую оценку делать нельзя. Метод жидкостной хроматографии обеспечивает достоверные данные по содержанию интересующего компонента в смеси. Время выхода компонента из колонки при одних и тех же условиях разделения будет всегда постоянно и может служить характеристикой данного компонента (качественный анализ), а площадь пика – пропорциональна количеству данного компонента в пробе (количественный анализ). Определение рН растворов Водородным показателем (рН) называется отрицательный десятичный логарифм активности ионов водорода.  Измерение рН заключается в сравнении потенциала индикаторного электрода, погруженного в испытуемый раствор, с потенциалом того же электрода в стандартном буферном растворе с известным значением рН. При калибровке рН-метров пользуются шкалой стандартных буферных растворов. В табл. 1 ГФ XI (с.113) приведены растворы веществ, применяемые в качестве стандартных буферных растворов для проверки рН-метров и зависимость их рН от температуры. Для приготовления таких растворов могут быть использованы фиксаналы по ГОСТ 8-135–74 Колориметрический метод Колориметрический метод определения рН основан на свойстве индикаторов изменять свою окраску в зависимости от активности ионов водорода в определенном интервале рН. Колориметрическое определение рН производят при помощи индикаторов (табл. 2 ГФ XI, с.116–118) и стандартных буферных растворов. Сначала определяют приблизительную величину рН испытуемого раствора с помощью универсального индикатора, для чего 2 мл испытуемого раствора смешивают в маленькой фарфоровой чашке с 5 каплями универсального индикатора и полученную окраску сравнивают с цветной шкалой. После приближенного определения рН испытуемого раствора выбирают 5–6 буферных растворов, пригодных для данной области рН и отличающихся друг от друга на 0,2. В одну из пробирок наливают 10 мл испытуемого раствора, в другие – выбранные буферные растворы. Во все пробирки прибавляют по 2–3 капли раствора индикатора и сравнивают окраску испытуемого раствора с окрасками буферных растворов. рН испытуемого раствора равен рН буферного раствора, окраска которого совпадает с окраской испытуемого раствора. Индикатор следует выбирать таким образом, чтобы предполагаемая величина рН попала в центральную часть интервала перехода окраски индикатора. Концентрация индикатора в испытуемом и буферном растворах должна быть одинаковой. Потенциометрический метод (с помощью рН-метра) Потенциометрическое определение рН заключается в измерении ЭДС элемента, состоящего из двух электродов: индикаторного, потенциал которого зависит от активности ионов водорода, и электрода сравнения – стандартного электрода с известной величиной потенциала. В качестве индикаторных электродов для измерения рН на практике применяют стеклянный и хингидронный электроды. В отдельных случаях в качестве индикаторного электрода можно использовать водородный электрод. Для измерения рН применяют высокоомные потенциометры различных систем или рН-метры, шкала которых градуирована в милливольтах или непосредственно в единицах рН. Подготовка рН-метра и электродной системы производится согласно инструкциям, прилагаемым к прибору. Калибровка и проверка рН-метров проводится по стандартным буферным растворам, приведенным в табл.1 (ГФ XI, с.113). Различие между показанием прибора и номинальным значением рН буферного раствора не должно превышать 0,04 единицы рН. Если рН контролируемого раствора отличается менее чем на единицу от рН стандартного буферного раствора, то достаточна проверка прибора по одному буферному раствору, величина рН которого лежит в том же диапазоне измерения, что и значения рН контролируемого раствора. Если рН контролируемых растворов находятся в широких пределах, то проверку рН-метра следует производить по двум стандартным буферным растворам в соответствии с инструкцией. При измерении рН контролируемых растворов отсчет величины рН по шкале прибора производят после того, как показания прибора примут установившееся значение. Время установления показаний определяется буферными свойствами и температурой раствора (обычно время установления показаний не превышает 2 мин). Определение рН проводят при 25±2°С, в противном случае необходимо сделать соответствующие поправки. При измерении рН сильнокислых и сильнощелочных растворов при температурах близких к 0°С или при измерении рН растворов с очень малой буферной емкостью (например, дистиллированной воды) время установления показаний может достигать нескольких минут. При измерении рН в неводных и смешанных растворителях, а также в некоторых коллоидных системах следует иметь в виду, что полученные значения рН являются условными. Потенциометрический метод имеет преимущества по сравнению с колориметрическим, он более точен и имеет меньше ограничений, связанных с присутствием в растворе окислителей или восстановителей, с белковой или солевой ошибками. Потенциометрический метод в отличие от колориметрического может применяться для определения рН в окрашенных, мутных или гелеобразных растворах. Определение температуры плавления веществ Под температурой плавления вещества подразумевают интервал температуры между началом плавления – появлением первой капли жидкости и концом плавления – полным переходом вещества в жидкое состояние. Приведенные в частных статьях фармакопеи интервалы температур плавления указывают на то, что наблюдаемая температура плавления данного препарата должна находиться в указанных пределах, при этом интервал между началом и концом плавления не должен превышать 2°С. Отдельные отклонения от этого интервала должны быть указаны в частных статьях. В случаях нечеткого начала или конца плавления отдельных препаратов вместо интервала температуры плавления можно определять только конец плавления или только начало плавления. Тогда приведенный в частных статьях интервал температуры плавления указывает, что начало плавления (или конец плавления) должно укладываться в этих пределах. Для веществ, неустойчивых при нагревании, определяют температуру разложения. Температурой разложения называют температуру, при которой происходит резкое изменение веществ (вспенивание). В зависимости от физических свойств веществ следует применять один из нижеприведенных методов определения температуры плавления. Методы 1 и 1а – для твердых веществ, легко превращаемых в порошок: устойчивых при нагревании (метод 1) и неустойчивых при нагревании (метод 1а). Методы 2 и 3 – для веществ, не растирающихся в порошок, как жиры, воск, парафин, вазелин, смолы. Для определения температуры плавления по методам 1, 1а и 2 допускаются два прибора. I. «Прибор для определения температуры плавления с диапазоном измерений в пределах от 20 до 360°С» (ПТП) с электрическим обогревом. Прибор состоит из следующих частей: 1) основание со щитком управления и номограммой; 2) стеклянный блок-нагреватель, обогрев которого осуществляется константановой проволокой, навитой бифилярно; 3) оптическое приспособление (ГОСТ 7594–75); 4) приспособление для установки термометров; 5) приспособление для установки капилляров; 6) термометр укороченный с ценой деления 0,5°С; 7) источник нагрева (электрический обогрев); 8) капилляры длиной 20 см. II. Второй прибор состоит из следующих частей: 1) круглодонная колба из термостойкого стекла вместимостью от 100 до 150 мл; длина горла колбы 20 см; диаметр горла от 3 до 4 см; 2) пробирка из термостойкого стекла, вставленная в колбу и отстоящая от дна колбы на расстоянии 1 см; диаметр пробирки от 2 до 2,5 см; 3) термометр ртутный стеклянный укороченный с ценой деления 0,5°С; 4) источник нагрева (газовая горелка, электрический обогрев); 5) капилляры. Колбу наполняют на ¾ объема шара соответствующей жидкостью: 1) вазелиновое масло (ГОСТ 3164–78) или жидкие силиконы; 2) концентрированная серная кислота (ГОСТ 4204—77) – для веществ с температурой плавления от 80 до 260°С; 3) раствор 3 частей калия сульфата (ГОСТ 4145–74) в 7 частях (массовых) концентрированной серной кислоты (ГОСТ 4204–77) – для веществ с температурой плавления выше 260°С; 4) дистиллированная вода – для веществ с температурой плавления ниже 80°С. Примечания. 1. Стеклянные трубки, из которых вытягивают капилляры, должны быть вымыты и высушены. Капилляры сохраняют в эксикаторе. 2. При приготовлении раствора калия сульфата в концентрированной серной кислоте смесь ингредиентов кипятят в течение 5 мин при энергичном перемешивании При недостаточном перемешивании могут образоваться два слоя, в результате чего может произойти закипание смеси, приводящее к взрыву. Во время определения температуры плавления колба и пробирка должны быть открыты. Методика определения Метод 1 и 1а Если в частных статьях нет других указаний, тонко измельченное вещество сушат при температуре от 100 до 105°С в течение 2 часов или в эксикаторе над серной кислотой в течение 24 ч. Любые другие условия должны быть указаны в частных статьях. Высушенное вещество помещают в капилляр, имеющий диаметр от 0,9 до 1 мм и толщину стенки от 0,1 до 0,15 мм, запаянный с одного конца. При плавлении в приборе ПТП длина капилляра должна быть 20 см, в случае второго прибора – от 6 до 8 см. Для уплотнения вещества капилляр многократно бросают в стеклянную трубку высотой не менее 50 см, поставленную вертикально на стекло. Высота слоя вещества в капилляре должна быть около 3 мм. Капилляр с веществом сохраняют до начала определения в эксикаторе. Во внутреннюю пробирку второго прибора помещают термометр так, чтобы конец его отстоял от дна пробирки на 1 см. Нагревание в обоих приборах проводят сначала быстро, а затем регулируют его так, чтобы за 10°С до начала плавления была достигнута необходимая скорость подъема температуры, указанная ниже. За 10°С до ожидаемого начала плавления капилляр с веществом вносят в приборы (первый или второй) таким образом, чтобы запаянный конец его находился на нижней части столика, расположенной на уровне середины ртутного шарика термометра. При плавлении во втором приборе капилляр должен быть расположен таким образом, чтобы запаянный его конец находился на середине ртутного шарика термометра. Продолжают нагревание со скоростью: – для веществ, плавящихся по методу 1, при определении температуры плавления ниже 100°С – со скоростью от 0,5 до 1°С в 1 мин; при определении температуры плавления от 100 до 150°С – от 1 до 1,5°С в 1 мин; при определении температуры плавления выше 150°С – от 1,5 до 2°С в 1 мин; – для веществ, плавящихся по методу 1а, – от 2,5 до 3,5°С в 1 мин. Проводят не менее двух определений; за температуру плавления принимают среднее арифметическое значение нескольких определений, проведенных в одинаковых условиях и отличающихся друг от друга не более чем на 1°С. В случае расхождений при определении температуры плавления на разных приборах в частной статье должна быть приведена температура плавления на каждом приборе. Метод 2 а) Для мягких веществ: капилляр длиной 20 см при применении первого прибора и от 6 до 8 см – при применении второго прибора и внутренним диаметром от 1 до 2мм, открытый с обоих концов, погружают в вещество так, чтобы оно заполнило нижнюю часть капилляра и образовало слой высотой около 10 мм. б) Для твердых веществ: испытуемое вещество расплавляют на бане при возможно более низкой температуре, тщательно перемешивают, набирают его в капилляр, как указано выше (см. метод 2а), и оставляют при температуре 0°С в течение от 1 до 2 ч. С заполненным тем или другим способом капилляром проводят определение температуры плавления по методу 1. За температуру плавления принимают ту температуру, при которой столбик вещества становится жидким, поднимаясь в некоторых случаях по капилляру. Проводят не менее двух определений. За температуру плавления принимают среднее значение. Расхождение между двумя определениями не должно превышать ГС.  Рис. 1. Прибор для определения температуры плавления. Метод 3 При этом методе применяют термометр типа Убеллоде (ГОСТ 400–80 Е). Определение проводят следующим образом. Чашечку 1 (рис. 1) заполняют исследуемым веществом, избегая но возможности попадания пузырьков воздуха, и вставляют ее в нижнюю часть гильзы 2 до упора. Ртутный шарик термометра 3 при этом погружается в вещество, излишек которого выдавливается через боковые отверстия 4 гильзы. Последнюю тщательно протирают и термометр помещают в пробирку 5 длиной от 19 до 21 см и диаметром от 4 до 4,5 см с помощью пробки с прорезом таким образом, чтобы нижняя часть чашечки отстояла от дна пробирки на 2,5 см. Пробирку укрепляют в вертикальном положении в стакане 6 так, чтобы она была погружена на ⅔ в воду и нижний ее конец при этом отстоял от дна стакана на 2,5 см. Начинают нагревать прибор при постоянном перемешивании жидкости с помощью мешалки 7. Когда температура будет на 15–20°С ниже ожидаемой, регулируют нагревание таким образом, чтобы температура поднималась на 1°С в 1 мин. За температуру плавления принимают температуру, при которой из отверстия 8 упадет первая капля расплавленного вещества. Проводят не менее двух определений. За температуру плавления принимают среднее значение. Расхождение между двумя определениями не должно превышать 1°С. |