Рецензенты кандидат химических наук В. Г. Коробко доктор биологических наук В. А. Гвоздев Патрушев Л. И

• Название: Рецензенты кандидат химических наук В. Г. Коробко доктор биологических наук В. А. Гвоздев Патрушев Л. И
• Анкор: gene_expression.doc
• Дата: 08.05.2018
• Размер: 5.83 Mb.
• Имя файла: gene_expression.doc
• Тип: Документы; #19010
• страница: 15 из 64

2.5.Трансляция у эукариот

Бактерии обладают единственной универсальной системой трансляции, основные механизмы функционирования которой были кратко рассмотрены выше. В отличие от этого, клетки животных кроме основной системы трансляции, локализованной в цитоплазме, имеют дополнительную систему трансляции митохондрий, которая по ряду свойств приближается к бактериальной. Клетки растений обладают еще одной дополнительной системой биосинтеза белка, функционирующей в хлоропластах. Большинство данных о механизмах биосинтеза белка у эукариот было получено с использованием бесклеточных белоксинтезирующих систем (подробнее о принципах функционирования таких систем см. в разделе 7.4). В последнее время важные результаты о механизмах трансляции у эукариот были получены с использованием стабильно трансформированных клеток животных и растений, выращиваемых в культуре. В ходе этих исследований установлено, что у растений и животных в основном функционируют одни и те же механизмы трансляции. Ниже будут рассмотрены основные молекулярные механизмы, участвующие в трансляции мРНК у эукариот, с привлечением данных, полученных главным образом на дрожжах S. cerevisiae.

2.5.1.Особенности первичной структуры эукариотических мРНК

Зрелая мРНК эукариот наряду с основной последовательностью нуклеотидов, в которой закодирована информация о последовательности аминокислот в соответствующем белке, содержит целый ряд некодирующих последовательностей, присутствие которых исключительно важно для ее эффективной, регулируемой трансляции рибосомами. Одни из этих последовательностей, такие как кэп-группа и 3'-концевая поли(А), не кодируются непосредственно генами, а, как это подробно рассматривалось выше, добавляются ко- и посттранскрипционно. Другие некодирующие последовательности, в том случае, если они не являются продуктами посттранскрипционного редактирования мРНК, имеют генное происхождение. Эти последовательности часто содержат регуляторные сигналы, обеспечивающие определенный уровень трансляции мРНК рибосомами.

Участок мРНК, расположенный между кэп-группой и первым инициирующим кодоном основной открытой рамки считывания (ОРС), которая и несет информацию о последовательности аминокислот в белке, получил название 5'-концевой нетранслируемой области (5'UTR – 5' untranslated region), или лидерной последовательности. Сегмент мРНК, расположенный между последним терминирующим кодоном основной ОРС и началом поли(А)-последовательности, называют 3'-концевой нетранслируемой областью (3'UTR). Первое название не совсем удачно. Последовательности 5'UTR, как правило, способны образовывать сложные вторичные структуры типа "стебель-петля" и содержать короткие ОРС (uORF – upstream open reading frame), которые оказывают сильное влияние на эффективность трансляции мРНК (см. ниже). Помимо этого 5'UTR могут включать в себя регуляторные последовательности, распознаваемые транс-действующими белковыми факторами. Последовательности 5'UTR обеспечивают регулируемую трансляцию мРНК (и координированную экспрессию соответствующих генов) в онтогенезе многоклеточных организмов.

3'UTR и поли(А)-последовательность оказывают влияние на состояние рибосом после терминации синтеза полипептидных цепей. Кроме того, по крайней мере, 3'-концевая поли(А)-последовательность участвует в инициации трансляции.

2.5.2.Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами

Как будет видно из дальнейшего изложения, инициация трансляции эукариотических мРНК может осуществляться, по крайней мере, тремя способами. В соответствии с первым наиболее распространенным механизмом (модель сканирования) рибосомы после взаимодействия с 5'-концевой последовательностью мРНК осуществляют поиск инициирующего AUG-кодона, перемещаясь вдоль 5'UTR. При реализации второго механизма рибосомы инициируют биосинтез белка на внутренних AUG-кодонах, удаленных от 5'-концевой кэп-группы. И, наконец, после освобождения полипептида из транслирующего комплекса рибосомы, не отделяясь от мРНК, способны реинициировать биосинтез белка на следующем инициирующем кодоне.

Факторы инициации трансляции. Большинство молекулярных механизмов, осуществляющих регуляцию экспрессии генов на уровне трансляции, реализуется на стадии инициации биосинтеза белка. По-видимому, этот факт находит свое отражение в большой сложности аппарата инициации трансляции. Помимо субъединиц эукариотических рибосом и белков, обычно ассоциированных с 5'- и 3'-концевыми последовательностями мРНК, в инициации принимают участие по меньшей мере 11 белковых факторов, построенных более чем из 25 полипептидов (табл. I.11).

Таблица I.11

Факторы инициации трансляции дрожжей S. cerevisiae

Фактор	Субъединица	Предполагаемая функция
eIF1		Обеспечивает связывание Met-тРНК и мРНК с 40S субчастицей рибосом и распознавание инициирующего AUG-кодона (у животных)
eIF1A		Обеспечивает диссоциацию 40S–60S субчастиц рибосом, связывание Met-тРНК и распознавание инициирующего кодона (у животных)
eIF2	α, β, γ	Участвует в выборе инициирующего кодона
eIF2B	α, β, γ, δ, ε	Обеспечивает обмен гуанилового нуклеотида на eIF2
eIF3	α, β, γ, δ, ε, ζ, η, θ	Обеспечивает связывание Met-тРНК и мРНК с 40S субчастицей и диссоциацию 40S–60S субчастиц рибосом
eIF4A		АТРаза, РНК-связывающая хеликаза
eIF4B		Хеликаза, облегчающая связывание РНК
eIF4E		Взаимодействует с кэп-группой мРНК
eIF4G	G1(p150), G2(p130)	Взаимодействует с eIF3, eIF4E и Pab 1p
eIF4H		Стимулирует активность eIF4B и компонентов eIF4F
eIF5		Вызывает диссоциацию факторов инициации
eIF5A		Функции неизвестны, мутации изменяют стабильность мРНК
eIF6		Вызывает диссоциацию 40S–60S субчастиц рибосом

Учитывая сложность процесса инициации трансляции у эукариот, последовательность реакций, приводящих к образованию первой пептидной связи в строящемся полипептиде, удобно разбить на ряд последовательных этапов, что является сознательным упрощением единого процесса.

Взаимодействие мРНК с кэп-связывающим комплексом и рибосомами. Возможность вступления эукариотических мРНК в цикл трансляции как правило обеспечивается их 5'-концевыми кэп-структурами, с которыми взаимодействуют белки кэп-связывающего комплекса (CBC). Хотя основными компонентами CBC являются факторы инициации трансляции, его роль далеко не ограничивается участием в инициации синтеза белка рибосомами. Как уже обсуждалось в разделе 2.2.4, полифункциональные белки CBC интегрируют основные реакции метаболизма мРНК и их предшественников в эукариотических клетках, необходимые для осуществления эффективной регулируемой трансляции.

Взаимодействие eIF2 с Met-тРНК. Гетеротримерный фактор eIF2 обеспечивает взаимодействие рибосом с инициаторной Met-тРНК и мРНК in vitro. Гены всех трех субъединиц являются жизненно важными. В связанном с GTP состоянии eIF2 приобретает способность взаимодействовать с Met-тРНК с образованием тройного комплекса Met-тРНК–eIF2–GTP. Имеются данные, указывающие на участие фактора eIF2B в обмене GDP на GTP в комплексе eIF2–GDP. Неизвестна точная последовательность объединения тройного комплекса с рибосомой и мРНК. Большая часть имеющихся данных указывает на то, что взаимодействие тройного комплекса с 40S субчастицей рибосом предшествует образованию комплекса 40S-мРНК. Однако наличие феномена реинициации трансляции, при которой тройной комплекс входит в инициирующий комплекс с предсуществующим комплексом рибосома–мРНК, указывает на возможность осуществления этих событий в другой последовательности.

Формирование кэп-связывающего комплекса на мРНК. Сборка прединициационного комплекса на мРНК начинается со взаимодействия фактора eIF4E с кэп-группой мРНК. Это дает возможность объединения eIF4E и eIF4G с образованием многокомпонентного фактора eIF4F. В настоящее время не исключается возможность того, что объединение eIF4E и eIF4G предшествует взаимодействию первого с кэп-группой. У животных в состав многокомпонентного фактора eIF4F, кроме того, входит eIF4A, причем eIF4G удерживает два других фактора рядом друг с другом. Комплекс факторов eIF4F животных обладает двунаправленной ATP-зависимой РНК-хеликазной активностью, которая стимулируется фактором eIF4B. Недавно (1998 г.) обнаруженный фактор eIF4H усиливает активность eIF4F и eIF4B, однако его истинная роль в инициации трансляции остается невыясненной. Еще два белка дрожжей взаимодействуют с компонентами eIF4F: белок p20, конкурирующий с eIF4G за связывание eIF4E, а также поли(А)-связывающий белок Pab 1p, который контактирует со специфическим сайтом полипептидной цепи фактора eIF4G1. Функциональным аналогом p20 у млекопитающих является белок 4E-BP – ингибитор инициации трансляции.

Полипептидная цепь eIF4G млекопитающих содержит сайты связывания факторов eIF3, eIF4E и eIF4A. На этом основании делается вывод, что eIF4G в обоих системах выполняет функции белка-адаптера, обеспечивающего сборку комплекса eIF4F. Исключительно важная роль фактора eIF4E в регуляции экспрессии генов на уровне трансляции (и в канцерогенезе) будет рассмотрена в разделе 3.4.1.

Таким образом, взаимодействию малой субчастицы рибосом с мРНК предшествует серия высоко специфических белок–белковых и белково–нуклеиновых взаимодействий, приводящих к формированию белкового комплекса вокруг кэп-группы мРНК, в котором полипептидная цепь фактора eIF4G обладает сайтом связывания eIF3. Последний, в свою очередь, специфически взаимодействует с малой субчастицей рибосом, обеспечивая ее вхождение в прединициационный комплекс. При этом 40S субчастица ассоциирована с тройным комплексом Met-тРНК–eIF2–GTP, содержащим аминоацилированную инициаторную тРНК^Met.

В итоге образуется прединициационный комплекс, содержащий мРНК, 40S субчастицу рибосом, связанную с тройным комплексом Met-тРНК–eIF2–GTP и через фактор eIF3 взаимодействующую с фактором eIF4G. Последний, в свою очередь, является частью многокомпонентного фактора eIF4F, в который кроме eIF4G входят eIF4E, взаимодействующий с кэп-группой мРНК, и eIF4A, обладающий РНК-хеликазной активностью. Кроме того, в состав этого комплекса входит фактор eIF1A. В таком виде прединициационный комплекс способен перемещаться вдоль 5'UTR мРНК и осуществлять поиск инициирующего AUG-кодона.

Роль 3'-концевой поли(А)-последовательности мРНК в инициации трансляции. Помимо вышеупомянутых сайтов белок–белковых взаимодействий, N-концевая часть полипептидной цепи дрожжевого eIF4G содержит участок, взаимодействующий с поли(А)-связывающим белком Pab1p. Другим указанием на участие 3'-концевой поли(А)-последовательности мРНК в трансляции является наличие мутаций в генах рибосомных белков 60S субчастицы, супрессирующих мутации в гене pab1. Кроме того, как будет видно из дальнейшего изложения, 3'-концевая поли(А)-последовательность мРНК может обеспечивать кэп-независимую инициацию трансляции. Данные такого рода указывают на возможную ключевую роль этой последовательности в инициации синтеза белка, однако механизм данного явления остается неизвестным.

Выбор точки инициации трансляции и инициация биосинтеза белка. Сформировавшись, прединициационный комплекс должен оказаться на инициирующем AUG-кодоне мРНК, в ряде случаев весьма удаленном от кэп-группы, с которой он первоначально взаимодействует. Рибосомы прокариот локализуют точку инициации биосинтеза белка путем непосредственного взаимодействия регуляторных элементов 5'UTR их мРНК (таких, как SD-последовательность), расположенных в области инициации трансляции TIR (translation initiation region), с 3'-концевой последовательностью 16S рРНК малой субчастицы рибосом. В эукариотической клетке не обнаружено подобных взаимодействий между мРНК и рРНК. Одной из наиболее популярных в настоящее время моделей поиска эукариотической рибосомой точки инициации трансляции является модель сканирования, в соответствии с которой прединициационный комплекс перемещается вдоль 5'UTR до первого специфически распознаваемого им инициирующего кодона.

Модель сканирующей рибосомы. Как следует из модели сканирования, сформированный прединициационный комплекс перемещается от кэп-группы мРНК вдоль 5'UTR, "проверяя" ее последовательность на наличие инициирующего AUG-кодона. В настоящее время отсутствуют твердые доказательства того, что сканирование является строго однонаправленным. Из-за отсутствия в мРНК эукариот SD-подобных последовательностей и соответствующих контактов с рРНК AUG-кодон распознается в результате кодон–антикодонового взаимодействия с участием Met-тРНК, входящей в состав прединициационного комплекса. Перемещение комплекса часто должно происходить на фоне ярко выраженной вторичной структуры лидерной последовательности мРНК. В этой связи предполагается, что происходящее во время сканирования расщепление ATP сопряжено с работой РНК-хеликазы, разрушающей вторичную структуру 5'UTR. Как уже упоминалось, данная активность ассоциирована с фактором eIF4A, входящим в состав прединициационного комплекса, и стимулируется фактором eIF4B. Однако роль этих факторов, по-видимому, не ограничивается разрушением вторичной структуры лидера, поскольку их присутствие требуется и для инициации синтеза белка на мРНК с короткими 5'UTR, не обладающими выраженной вторичной структурой.

В выборе AUG-кодона у эукариот участвует фактор eIF2. На это указывает тот факт, что его мутационные повреждения сопровождаются ослаблением специфичности такого выбора. Неожиданными оказались недавно полученные результаты, подчеркивающие важную роль фактора eIF5 в распознавании инициирующего кодона прединициационным комплексом. Не исключено, что этот фактор определяет точность процесса распознавания AUG и является функциональным аналогом прокариотического фактора IF3. Описаны мутантные формы eIF5, в присутствии которых in vivoв качестве инициирующего узнается кодон UUG. Не исключено, что совместное действие факторов eIF2 и eIF5 в обеспечении точности выбора инициирующего кодона становится возможным благодаря наличию на ß-субъединице eIF2 сайта связывания eIF5.

После локализации инициирующего кодона 40S субчастицей она приобретает способность объединяться с большой 60S субчастицей рибосом при участии фактора eIF5, что в конечном итоге приводит к образованию полноценного инициационного комплекса. В это время происходит отделение от комплекса ряда факторов инициации трансляции, сопряженное с гидролизом GTP. Прежде всего, освобождается комплекс eIF2–GDP, а также большинство остальных факторов инициации, включая eIF1A и eIF3. В таком виде при наличии соответствующей аминоацил-тРНК инициационный комплекс способен образовывать первую пептидную связь в строящейся полипептидной цепи, т.е. инициировать синтез белка.

Контекст и приоритеты инициирующих AUG-кодонов. Последовательности, окружающие инициирующие AUG-кодоны, оказывают сильное влияние на эффективность инициации трансляции у позвоночных и в значительно меньшей степени у дрожжей. В последнем случае наиболее благоприятным для инициации трансляции является нуклеотид A в положении –3 по отношению к AUG (нуклеотид A в AUG-кодоне находится в положении +1), замена которого на любой другой нуклеотид снижает эффективность инициации приблизительно в два раза. Вообще, A-богатые последовательности, предшествующие AUG, характерны для мРНК дрожжей, что отличает их от мРНК позвоночных, соответствующие области мРНК которых сильнее обогащены GC. Это объясняют высокой чувствительностью аппарата трансляции дрожжей к вторичной структуре 5'UTR их мРНК, которая при наличии GC-пар была бы более прочной. В следующих за AUG последовательностях мРНК дрожжей не обнаружено предпочтения в отношении A, и они, как правило, обогащены пиримидиновыми нуклеотидами.

Оптимальный контекст для инициации трансляции в клетках животных и растений, по-видимому, один и тот же: AACAATGGC. Самыми важными для инициации в обоих случаях являются пурин в положении –3 и G в положении +4. В клетках животных на эффективность трансляции мРНК оказывают влияние также нуклеотиды в положениях +5 и +6. Инициирующие кодоны в контексте, отличающемся от оптимального, узнаются рибосомами менее эффективно и допускают их прохождение до следующего инициирующего кодона. Это явление, обнаруженное в клетках животных и растений, получило название ослабленного сканирования (leaky scanning). Некоторые примеры реализации механизма ослабленного сканирования будут рассмотрены в разделе 3.4.1 (см. рис. I.40,а–в) в связи с особенностями инициации трансляции у вирусов растений.

Другим важным фактором, определяющим выбор AUG-кодона в качестве инициирующего, является его положение в 5'UTR. Как правило, ближайший к 5'-концу мРНК AUG предпочтительно используется для инициации трансляции. Это объясняют преимущественным перемещением сканирующей рибосомы в направлении 5'→3'. Многие 5'UTR содержат дополнительные AUG, не принадлежащие к основным ОРС, а также короткие ОРС (uAUG, uORF) перед основным инициирующим кодоном. И те и другие обычно оказывают ингибирующее действие на трансляцию соответствующих мРНК. Ингибирующий эффект является наиболее сильным, если расстояние первого uAUG от 5'-конца мРНК меньше 15–20 нуклеотидов. Наличие двух следующих друг за другом AUG-кодонов может сопровождаться их использованием в качестве альтернативных сайтов инициации трансляции. В этом случае одна и та же мРНК может направлять синтез двух полипептидов, различающихся лидерными пептидами, что, в свою очередь, может определять направление их внутриклеточного транспорта.

Распознавание инициирующих кодонов в процессе инициации трансляции может сопровождаться продолжительными паузами в дальнейшем перемещении рибосом вдоль мРНК при ее сканировании.

Инициирующие кодоны, отличающиеся от AUG. Трансляция в клетках млекопитающих и насекомых может начинаться на кодонах, которые отличаются от канонического AUG. В природных мРНК в качестве альтернативного инициирующего кодона чаще всего встречается CUG и значительно реже – AUC и ACG. В клетках дрожжей любые не-AUG-кодоны распознаются очень неэффективно. Эффективность может быть повышена мутациями в субъединицах фактора eIF2  и . Кодон AUU обычно открывает первую ОРС у некоторых вирусов растений. В этом случае эффективность инициации трансляции составляет  10% от эффективности на каноническом кодоне AUG, который располагается ниже первого. Таким образом, использование вирусами на одной матрице неканонического и канонического кодонов является одним из регуляторных механизмов, контролирующих соотношение синтезирующихся полипептидных цепей на уровне трансляции позволяющих рибосоме достичь в процессе сканирования второго инициирующего кодона и инициировать на нем синтез белка.

У млекопитающих вышерасположенный неканонический инициирующий кодон также, как правило, сопровождается каноническим кодоном. При этом дополнительная инициация трансляции на неканоническом кодоне чаще всего характерна для ОРС, кодирующих регуляторные белки. Образование по такому механизму полипептидных цепей, удлиненных с N-концевой части, приводит к появлению у них новой регуляторной активности, а сам процесс инициации на неканоническом кодоне может контролироваться условиями внутри клетки.

Влияние вторичной структуры мРНК на инициацию трансляции. Вторичные структуры в 5'UTR мешают сканированию мРНК 40S субчастицами рибосом. Уровень ингибирования инициации трансляции зависит от положения таких структур относительно 5'-конца матрицы. Например, в лизатах ретикулоцитов кроликов структура типа стебель–петля со стабильностью –30 ккал/моль ингибирует инициацию трансляции, если расположена в непосредственной близости от кэп-структуры и не замечается рибосомами при удалении от 5'-конца более чем на 52 нуклеотида. В последнем случае у сканирующего прединициационного комплекса хватает энергии для разрушения этой структуры 5'UTR, но он не может быть собран при наличии шпильки, расположенной в непосредственной близости от кэп-структуры. Тем не менее, шпильки, удаленные от 5'-конца мРНК, могут подавлять трансляцию более чем на 85%, если их стабильность превышает –50 ккал/моль.

Интересно отметить, что структуры типа стебель–петля, образованные вслед за инициирующим AUG-кодоном, могут повышать эффективность инициации трансляции. Полагают, что такие структуры вызывают задержку сканирующего комплекса на инициирующем кодоне, что повышает вероятность его правильного распознавания. Например, элемент вторичной структуры, локализованный на 14 нуклеотидов ниже инициирующего кодона, оказывает стимулирующее влияние на распознавание слабых AUG-кодонов, а также инициирующих кодонов, отличающихся от AUG.

Шунтирование при сканировании мРНК. У некоторых вирусов растений, в частности при трансляции 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV), содержащей лидерную последовательность, в процессе инициации имеет место модифицированное сканирование, получившее название рибосомного шунта (см. рис. I.40,г). По этому механизму сканирующие рибосомы могут непосредственно переноситься из донорного в акцепторный сайт на РНК, избегая линейного сканирования расположенной между ними последовательности нуклеотидов. Такое явление было исследовано на искусственных матрицах, содержащих между донорным и акцепторным сайтами последовательности нуклеотидов, образующих интенсивную вторичную структуру. При этом в отсутствие функционирования шунта последовательности обладали ингибирующим действием, точно предсказываемым на основании модели сканирования. Интересно, что шунтирование внутренних последовательностей сканирующими рибосомами может происходить, хотя и с меньшей эффективностью, и in trans, т.е. в условиях, когда донорный и акцепторный сайты располагаются на разных молекулах РНК. Механизмы, лежащие в основе шунтирования, в настоящее время до конца не изучены. Полагают, что ключевую роль в этом могут играть специфические взаимодействия участков РНК, расположенных на больших расстояниях друг от друга. Механизм шунтирования обнаружен при трансляции РНК вируса Сендай, тройной лидерной последовательности аденовирусов, а также у паповавирусов.

Реинициация трансляции. В отличие от прокариотических, мРНК эукариот, как правило, моноцистронны, т.е. содержат только одну основную ОРС. Однако как уже упоминалось выше, часто 5'UTR эукариотических мРНК содержат короткие ОРС. Например, у дрожжей известно несколько сотен видов таких мРНК, и они содержат от одной до шести коротких ОРС, часть из которых может перекрываться. То же самое характерно для мРНК животных. Несмотря на свои малые размеры, короткие ОРС способны обеспечивать инициацию, терминацию и реинициацию трансляции рибосомами эукариот.

Короткие ОРС эукариот играют важную роль в регуляции экспрессии генов на уровне трансляции, о чем подробнее будет говориться в разделе 3.4. Здесь же хочется отметить, что по функциональному признаку короткие ОРС разделяются на две группы: в одних случаях регуляторные функции коротких ОРС не зависят от их кодирующего потенциала, тогда как другие ОРС реализуют свои регуляторные возможности через кодируемые ими пептиды.

В том случае, если короткие ОРС следуют в мРНК друг за другом, рибосомы после завершения трансляции одной из них могут реинициировать синтез белка на следующем инициирующем кодоне. Как и в случае прокариотической трансляции, эффективность реинициации у эукариот в большой степени зависит от расстояния между терминирующим и инициирующим кодоном, а также от нуклеотидного контекста, в котором находится инициирующий кодон.

Инициация на внутренних AUG-кодонах. Третья возможность инициации трансляции у эукариот основана на прямом вхождении рибосом в цикл трансляции независимо от кэп-структур и лидерных последовательностей мРНК при прямом участии их IRES-последовательностей (internal ribosome entry site). В отличие от классической инициации трансляции у прокариот на внутренних AUG-кодонах полицистронных мРНК, обеспечиваемой последовательностями TIR, IRES-опосредованная инициация происходит не на полицистронных мРНК в обычном смысле, т.е. содержащих последовательности нескольких структурных генов. В этой связи полагают, что основная физиологическая роль инициации трансляции на внутренних AUG-кодонах эукариот заключается в предоставлении некоторым ОРС возможности транслироваться, минуя основной кэп-зависимый механизм инициации. Например, во время вирусной инфекции протеиназа пикорнавирусов отщепляет от полипептидной цепи клеточного фактора eIFG N-концевой пептид, содержащий сайт связывания фактора eIF4E – основного кэп-связывающего белка эукариот. При этом C-концевая часть такого модифицированного фактора сохраняет сайты связывания факторов eIF3 и eIF4A. В результате происходит (неполное) переключение с кэп-зависимой трансляции мРНК клетки-хозяина на кэп-независимую трансляцию вирусных мРНК, опосредованную IRES-последовательностями вирусов.

2.5.3.Элонгация полипептидных цепей

Элонгация полипептидных цепей в ходе эукариотической трансляции традиционно пользовалась меньшим вниманием исследователей по сравнению с инициацией, поскольку считалось, что ее механизмы в основных чертах идентичны таковым бактерий. Дальнейшие исследования показали, что данная точка зрения в основном соответствует действительности, хотя эукариотическая система трансляции обладает более сложным набором факторов элонгации.

Факторы и механизмы элонгации. Эукариотические клетки содержат в большом количестве фактор элонгации eEF1A, который является функциональным гомологом бактериального фактора EF1A(EF-Tu). Так же как и у бактерий, этот фактор образует тройной комплекс с GTP и аминоацил-тРНК, обеспечивая вхождение последней в А-участок элонгирующей рибосомы. Два других эукариотических фактора eEF1B и eEF2 резко отличаются от бактериальных функциональных аналогов EF1B(EF-Ts) и EF2(EF-G) по аминокислотным последовательностям. Гетеротримерный фактор eEF1B, как и его бактериальный аналог, катализирует обмен GDP на GTP в комплексе eEF1A–GDP. Фактор eEF2, по аналогии с бактериальными системами, обеспечивает транслокацию пептидил-тРНК в P-участок рибосом и перенос деацилированной тРНК в E-участок. У высших организмов этот фактор служит мишенью регуляторных воздействий через фосфорилирование (см. раздел 3.4). Замечательным свойством факторов eEF1A и eEF2 является способность связываться с компонентами цитоскелета эукариотических клеток. Полагают, что это их свойство может обеспечивать один из механизмов внутриклеточного транспорта мРНК, направляющих ее в полисомы.

Растущий полипептид выводится в цитоплазму через канал, начало которого расположено на поверхности рибосомы, где он взаимодействует с белками, распознающими сигнальную последовательность, или с другими цитоплазматическими факторами, которые обеспечивают его направленный транспорт внутри эукариотической клетки. У бактерий растущая полипептидная цепь может вызывать уменьшение скорости элонгации, а природа предпоследней аминокислоты оказывает сильное влияние на терминацию трансляции. Предполагают, что такого рода эффекты являются следствием взаимодействия между строящимся пептидом и факторами трансляции, рРНК или непосредственно каналом, через который он переносится к поверхности рибосомы. Подобные механизмы, по-видимому, функционируют и у эукариот. У дрожжей, как и у E. coli, скорость элонгации трансляции снижается в присутствии редко встречающихся кодонов в мРНК. Наличие определенного числа таких кодонов вблизи сайта инициации трансляции значительно снижает скорость считывания соответствующих ОРС. На скорость декодирования мРНК рибосомами оказывают влияние и характер фолдинга строящихся полипептидных цепей (см. раздел 3.6.1), а также сигнальные последовательности аминокислот, определяющие направление их посттрансляционного транспорта внутри эукариотических клеток.

Уникальный фактор элонгации eEF-3 дрожжей. Клетки дрожжей и других грибов обладают дополнительным фактором элонгации eEF3, аналог которого пока не обнаружен у животных. Фактор является мономерным белком с молекулярной массой 116 кДа, обладающим ATPазной активностью. Функциональная роль этого фактора заключается в стимуляции вхождения тройного комплекса eEF1A•аа-тРНК•GTP в А-участок элонгирующей рибосомы, что является следствием его стимулирующего влияния на освобождение деацилированной тРНК из Е-участка рибосомы. Освобождение деацилированной тРНК сопряжено с гидролизом ATP, катализируемым этим фактором. Несмотря на то что рибосомы животных обладают АТРазной активностью, гидролиз АТР для трансляции, осуществляемой этими рибосомами, не требуется.

Благодаря своей уникальности, фактор eEF3 активно исследуется фармацевтическими компаниями как потенциальная мишень для противогрибковых препаратов.

2.5.4.Терминация трансляции

В эукариотических белоксинтезирующих системах терминация трансляции, как и у бактерий, контролируется специфическими рилизинг-факторами. Однако у эукариот эти факторы менее разнообразны. В частности, у них отсутствует функциональный аналог бактериального фактора RRF/RF4.

Факторы терминации. По современным представлениям, элонгирующая эукариотическая рибосома распознает стоп-кодоны, находящиеся в одной рамке с основными ОРС, после взаимодействия с гетеродимерным комплексом рилизинг-факторов (RF), в состав которого входят факторы eRF1 и eRF3. Фактор eRF1 необходим для распознавания всех трех терминирующих кодонов (UAA, UAG и UGA) и освобождения синтезированного полипептида. Фактор eRF3 является GTPазой, обладающей гомологией с eEF1A, которая, гидролизуя GTP, стимулирует терминацию независимо от последовательности нуклеотидов в терминирующих кодонах.

Влияние нуклеотидного контекста на эффективность терминации. Два основных фактора оказывают влияние на эффективность терминации трансляции у эукариот. Этими факторами являются последовательности нуклеотидов в окрестностях терминирующих кодонов и структура C-концевой части строящейся полипептидной цепи. Терминирующие кодоны дрожжей по частоте их использования можно расположить в следующий ряд: UAA(53%) > UGA(27%) > UAG(20%). Если анализировать только активно экспрессирующиеся гены, то частота использования UAA оказывается еще большей – 87%. Анализ последовательностей нуклеотидов в окрестностях терминирующих кодонов показал, что и они не являются случайными. Путем исследования способности следующего за стоп-кодоном нуклеотида изменять эффективность его супрессии в гене lacZ было установлено их следующее влияние на усиление терминации трансляции на соответствующих терминирующих кодонах: G>U>A>C (UGA), G>A>U>C (UAA) и A>U>C>G (UAG). Третий от стоп-кодона нижерасположенный нуклеотид оказывает лишь слабое влияние на эффективность терминации. Эти и другие такого рода данные были интерпретированы в пользу участия следующего за стоп-кодоном нуклеотида во взаимодействии eRF-факторов с терминирующей рибосомой.

Результаты исследования возможной роли нуклеотидов, предшествующих терминирующему кодону, в терминации трансляции интерпретировать труднее, так как соответствующие замены могут непосредственно изменять первичную структуру С-концевой последовательности строящихся полипептидов. Такие эффекты были обнаружены у E. coli: по крайней мере, две последние аминокислоты оказывают влияние на эффективность терминации синтеза соответствующего белка. У этой бактерии перед кодоном UGA чаще встречаются кодоны UCC(Ser), а также UUC и UUU(Phe), в то время как перед кодоном UUA – кодон AAG(Lys). Эти особенности объясняют возможным участием пептидил-тРНК, находящейся в P-участке рибосом, или самой С-концевой аминокислоты в функционировании RF-факторов в A-участке. Зависимость терминации от природы аминокислот в С-концевой части строящегося полипептида была прямо продемонстрирована для E. coliи дрожжей.

2.5.5.Трансляция в митохондриях

Митохондрии являются органеллами эукариотических клеток, в которых в результате окислительного фосфорилирования энергия химических связей, освобождающаяся при метаболизме, накапливается в виде энергии макроэргических связей ATP. Эти органеллы обладают собственным геномом – двухцепочечной ковалентно замкнутой митохондриальной ДНК (мтДНК), которая присутствует в каждой митохондрии в виде нескольких идентичных копий. В настоящее время наибольшее распространение получила гипотеза об эндосимбиотическом происхождении митохондрий, в соответствии с которой современные митохондрии животных берут свое начало от α-протеобактерий (к которым принадлежит современная Rickettsia prowazekii), внедрившихся в цитозоль клеток-предшественников. Считается, что за время эндосимбиоза бактерии передали большую часть своих жизненно важных генов хромосомам клетки-хозяина, сохранив в своем геноме (в случае клеток человека) информацию лишь о 13 полипептидах, 22 тРНК и двух рРНК. Все полипептиды входят в состав ферментативных комплексов системы окислительного фосфорилирования митохондрий.

Как уже можно видеть из размера мтДНК (ее длина у человека составляет 16569 п.о.), митохондрии не являются самовоспроизводящимися генетическими системами. Репликация и транскрипция их генома зависят от транс-действующих факторов, кодируемых ядерным геномом. Все митохондриальные тРНК акцептируют аминокислотные остатки при участии аминоацил-тРНК-синтетаз, импортируемых в митохондрии из цитоплазмы. В цитоплазме же клеток позвоночных синтезируются все рибосомные белки митохондрий, мРНК которых транскрибируются с ядерных генов. Даже происхождение белков комплексов системы окислительного фосфорилирования является смешанным – ядерно–митохондриальным. Все полипептиды, кодируемые ядерным геномом, синтезируются рибосомами цитозоля. Как правило, они обладают N-концевой отщепляемой сигнальной последовательностью, которая обеспечивает направленный перенос в митохондрии.

Декодирование генетической информации в митохондриях. Сравнение первичной структуры мтДНК с последовательностями аминокислот митохондриальных белков выявило ряд особенностей генетического кода, используемого митохондриями. Имеются вариации и в частоте использования кодонов митохондриями разных видов. В мтДНК большинства филогенетических групп триплет TGA кодирует Trp, хотя обычно на нем происходит терминация синтеза полипептидных цепей. С другой стороны, кодон AGR (где R=A или G) в мтДНК позвоночных является терминирующим, у иглокожих кодирует Ser, а у дрожжей, как обычно, – Arg.

Другой характерной особенностью генетической системы митохондрий является упрощение самого механизма декодирования информации, заключенной в митохондриальной мРНК. Интересно, что трансляция всех кодонов в митохондриях происходит с участием далеко не всех 32 видов молекул тРНК, которые обычно требуются для осуществления биосинтеза белка в соответствии с гипотезой неоднозначного соответствия Крика. Например, лишь 22 видов молекул тРНК достаточно для трансляции всех мРНК 13 генов мтДНК человека. Это становится возможным благодаря использованию основания U в первом (wobble) положении антикодона тРНК одного вида для распознавания всех четырех кодонов каждого из семейств, кодирующих конкретную аминокислоту.

Миторибосомы. Одним из первых указаний на прокариотическое происхождение митохондрий было отличие набора антибиотиков, подавляющих трансляцию в этих органеллах, от антибиотиков, которые ингибируют биосинтез белка в цитозоле клеток эукариот. Дальнейшие исследования показали, что некоторые компоненты системы трансляции митохондрий гомологичны соответствующим компонентам бактериальных систем.

Рибосомы митохондрий, или миторибосомы, ассоциированы с митохондриальным матриксом. На основании определения стационарного уровня митохондриальных рРНК в гепатоцитах крыс было установлено, что отдельная митохондрия содержит <100 миторибосом. Структурные исследования миторибосом выявили их существенные отличия от цитоплазматических и бактериальных рибосом. Для миторибосом животных характерно очень низкое содержание РНК и, как следствие, более низкий коэффициент седиментации (55S). Коэффициенты седиментации большой и малой субчастиц миторибосом составляют соответственно 39S и 28S, которые содержат в своем составе 16S и 12S рРНК. Небольшая 5S рРНК, характерная для обычных рибосом, в миторибосомах отсутствует. Тем не менее, участок 3'-конца 16S рРНК миторибосом человека длиной в 23 нуклеотида обнаруживает 68% гомологию с 5S рРНК Bacillus subtilis. Полагают, что эта часть 16S рРНК представляет собой укороченный функциональный аналог 5S рРНК бактериальных рибосом.

Низкая массовая доля РНК в миторибосомах компенсируется повышенным содержанием белков. В результате суммарная молекулярная масса миторибосом приближается к таковой рибосом бактерий. Полагают, что часть белков миторибосом могла взять на себя функции недостающих последовательностей рРНК. С помощью двумерного электрофореза удается обнаруживать 85 (быки) или 86 (крысы) миторибосомных белков. Тем не менее, истинное количество белков, составляющих миторибосомы, остается неизвестным, поскольку часть электрофоретически выявляемых полипептидов может представлять собой продукты протеолитической деградации или быть предшественниками их зрелых форм.

Биосинтез белка в митохондриях. Несмотря на то что изолированные митохондрии активно синтезируют белок, до сих пор из них не удается получить эффективные бесклеточные системы трансляции. Это сдерживает исследование молекулярных механизмов трансляции в митохондриях, и имеется мало информации относительно факторов трансляции, участвующих в синтезе митохондриальных белков.

Трансляция в митохондриях уникальна во многих отношениях. Как уже упоминалось, одной из особенностей биосинтеза белка в митохондриях является малое число видов рРНК и тРНК, вовлеченных в этот процесс. Остается непонятным, каким образом миторибосомы распознают инициирующие кодоны. Поскольку митохондриальные мРНК лишены 5'UTR, которые характерны для бактериальных и ядерных мРНК, взаимодействие миторибосом с инициирующими кодонами должно определяться другими принципами, отличающимися от сканирования цитоплазматическими рибосомами эукариот или от взаимодействий TIR-последовательностей мРНК с 16S рРНК у бактерий. Обнаруженная низкая эффективность трансляции митохондриальных мРНК in vitro может быть следствием строения их 5'-концевых последовательностей, и для осуществления биосинтеза митохондриального белка на приемлемом уровне требуется присутствие мРНК в высоких концентрациях, что и имеет место в нативных митохондриях.

В бесклеточных системах было показано, что 28S субчастица миторибосом обладает способностью прочно связываться с мРНК независимо от последовательности нуклеотидов в отсутствие дополнительных факторов и инициаторной тРНК, что отличает ее от субчастиц других про- и эукариотических рибосом. Для ее эффективного взаимодействия с мРНК длина полинуклеотида должна быть 400 нуклеотидов, тогда как сама субчастица защищает от действия РНКазы T₁ участок мРНК длиной в 30–80 нуклеотидов. Возможно, это объясняет, почему самые короткие ОРС мтДНК являются перекрывающимися, так как благодаря такому строению соответствующие мРНК приобретают размеры, необходимые для оптимального взаимодействия с малой субчастицей миторибосом. Полагают, что после взаимодействия с мРНК малая субчастица при участии еще не идентифицированных факторов трансляции перемещается к инициирующему кодону на 5'-конце матрицы.

В настоящее время единственным охарактеризованным митохондриальным фактором инициации трансляции является mtIF2, который обеспечивает GTP-зависимое вхождение инициаторной формилметионил-тРНК (fMet-тРНК) в комплекс, образованный малой субчастицей миторибосом и мРНК. Вероятно, гидролиз GTP сопровождается освобождением mtIF2 из тройного комплекса с последующим соединением малой и большой (39S) субчастиц миторибосом с образованием комплекса, способного к элонгации полипептидных цепей.

Из печени быка были выделены три фактора элонгации трансляции: mtEF-Tu, mtEF-Ts и mtEF-G, которые обладают высокой гомологией с соответствующими прокариотическими факторами. На этом основании полагают, что механизм элонгации строящихся полипептидных цепей в митохондриях в основных чертах соответствует таковому E. coli, уже подробно рассмотренному выше. В отличие от бактериальных факторов EF-Tu и EF-Ts соответствующие факторы митохондрий образуют друг с другом более прочный комплекс, для диссоциации которого недостаточно присутствия только GTP, однако комплекс диссоциирует при наличии в бесклеточных системах GTP и аминоацилированной тРНК.

Патологические последствия мутационных повреждений системы трансляции митохондрий. Точковые мутации, обнаруживаемые в мтДНК, как правило, являются гетероплазматическими, т.е. в одной и той же клетке присутствуют как нормальные, так и мутантные мтДНК. Именно это явление позволяет существовать клеткам с мтДНК, содержащими летальные мутации, которые в обычных условиях были бы элиминированы. Энцефаломиопатии, для которых характерен материнский тип наследования (с цитоплазмой яйцеклетки), часто вызываются точковыми мутациями в генах митохондриальных тРНК. В частности, такими патологическими последствиями сопровождаются транзиции A3243G и A8344G в генах тРНК^Leu(UUR) и тРНК^Lys соответственно. Предполагается, что в первом случае нарушается правильный процессинг первичного полицистронного транскрипта, что приводит к образованию гибридной молекулы с последовательностями 16S рРНК–тРНК^Leu(UUR)–ген ND1, которая, из-за присутствия в ней последовательности 16S рРНК, включается в нефункциональную субчастицу рибосом. Альтернативно, обсуждаемые мутации могут дестабилизировать молекулы тРНК.

2.5.6.Трансляция в хлоропластах.

Хлоропласты являются органеллами клеток растений, осуществляющих процесс фотосинтеза – преобразование энергии квантов света в энергию макроэргических связей ATP. Так же как и митохондрии, хлоропласты обладают собственным геномом, представленным множественными копиями кольцевой ковалентно замкнутой ДНК (хпДНК – ctDNA), длина которой обычно составляет 150 т.п.о. Геном хлоропластов заключает в себе более 100 различных генов. В соответствии с теорией эндосимбиоза хлоропласты произошли от цианобактерии Anacystis nidulans (Synechococcus PCC6301), которая в ходе адаптации к внутриклеточному существованию передала основную часть своих генов хромосомам ядра клетки-хозяина. В результате образовавшийся хлоропласт стал зависимым от ядра в отношении биосинтеза импортируемых хлоропластных белков и генетического контроля экспрессии собственных генов. Как и митохондрии, хлоропласты обладают собственной системой транскрипции и трансляции, а также репликации хпДНК.

В отличие от митохондрий животных, система трансляции хлоропластов высоко гомологична системе бактерий и представлена 70S рибосомами, собственными тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазами, многочисленными факторами трансляции и т.п. Геном хлоропластов содержит гены всех рРНК (16S, 23S и 5S), которые кластеризованы и транскрибируются полицистронно. В большой субчастице рибосом хлоропластов рРНК 23S-типа часто представлена двумя или четырьмя фрагментами. Так, в рибосомах Chlamydomonas eugametosона представлена четырьмя фрагментами длиной 280 (α-фрагмент), 52 (β), 810 (γ) и 1720 (δ) нуклеотидов. Вторичная структура этих фрагментов практически идентична предсказанной структуре соответствующих участков 23S рРНК E. coli. На этом основании делается вывод, что физическая непрерывность молекулы 23S рРНК не существенна для ее функционирования.

70S рибосомы хлоропластов содержат 60 рибосомных белков, что превышает их содержание (55 полипептидов) в рибосомах E. coli. Приблизительно 1/3 рибосомных белков кодируется хпДНК, а 2/3 – ядерным геномом. Рибосомы хлоропластов высших растений содержат, по крайней мере, пять белков, не имеющих гомологов в рибосомах E. coli.

Геномы хлоропластов, для которых определена полная первичная структура, содержат 27–35 потенциальных генов тРНК. При этом в геноме для кодирования полипептидов используются все теоретически возможные кодоны (61). Это приводит к ситуации, характерной и для митохондрий, – у хлоропластов отсутствует полный набор тРНК, необходимых для декодирования этих кодонов. В данном случае проблема, по-видимому, решается так же, как и у митохондрий: индивидуальные тРНК^Pro(UGG), тРНК^Ala(UGC) и тРНК^Arg(ACG) распознают по четыре кодона, которые кодируют каждую из аминокислот, акцептируемых соответствующими молекулами тРНК (в скобках представлены последовательности антикодонов тРНК).

Генетическая информация хпДНК во многих случаях редактируется на уровне мРНК (подробно о механизме см. раздел 2.2.2). В этом случае в результате запрограммированных замен нуклеотидов в мРНК происходит создание новых инициирующих и терминирующих кодонов, а также изменение их смысла. Лишь очень редко редактирование сопровождается синонимическими заменами нуклеотидов (без изменения смысла кодона). Редактирование является критическим событием в экспрессии генов хлоропластов, так как неотредактированные транскрипты не способны правильно транслироваться. Очень эффектным результатом редактирования предшественника мРНК хлоропластов является создание в результате двух замен нуклеотидов инициирующего и терминирующего кодонов с образованием новой открытой рамки считывания, т.е. фактически нового гена, посттранскрипционно. В хлоропластах кукурузы, табака и черной сосны, геномы которых полностью секвенированы, имеется соответственно 26, 32 и 26 сайтов редактирования.

Зрелые и функционально активные мРНК хлоропластов не обладают кэп-группами и не полиаденилированы на 3'-концах. Из 70 генов, кодирующих белки в хлоропластах табака, лишь пять транскрибируются моноцистронно. Полицистронные предшественники мРНК подвергаются эндонуклеазному процессингу с образованием моноцистронных матриц. Более того, искусственные дицистронные мРНК не транслируются в бесклеточных системах. На этом основании делается вывод, что в хлоропластах в синтезе белка участвуют моноцистронные мРНК.

Среди 79 исследованных генов, кодирующих белки в хлоропластах табака, 30 содержат SD-подобные последовательности в 20-нуклеотидном участке перед инициирующим кодоном. Остальные 49 транскриптов также содержат такие последовательности, но их положение не фиксировано на матрице. Мутационные изменения некоторых SD-подобных последовательностей снижают эффективность трансляции мутантных мРНК, что указывает на функциональную значимость этих участков мРНК. Детальное исследование 5'UTR мРНК гена psbA хлоропластов табака позволило идентифицировать цис-действующие регуляторные элементы, существенные для ее трансляции. Два из них – RBS1 (AAG) и RBS2 (UGAU), расположенные между нуклеотидами в положениях –11 и –9, –25 и –22 соответственно комплементарны 3'-концу 16S рРНК хлоропластов. Полагают, что они участвуют во взаимодействии 30S субчастицы рибосом с мРНК. AU-богатая последовательность, расположенная между ними (UAAAUAAA) и получившая название AU-бокса, также критична для трансляции. Возможно, с этой последовательностью взаимодействуют транс-действующие белковые факторы. На наличие таких факторов трансляции указывают многочисленные данные мутационного анализа Chlamydomonas.

Как и у бактерий, AUG является основным инициирующим кодоном мРНК хлоропластов и направляет включение в полипептидную цепь формилметионина. Информация о молекулярных механизмах отдельных этапов трансляции в хлоропластах еще не получена.