Рецензенты кандидат химических наук В. Г. Коробко доктор биологических наук В. А. Гвоздев Патрушев Л. И

• Название: Рецензенты кандидат химических наук В. Г. Коробко доктор биологических наук В. А. Гвоздев Патрушев Л. И
• Анкор: gene_expression.doc
• Дата: 08.05.2018
• Размер: 5.83 Mb.
• Имя файла: gene_expression.doc
• Тип: Документы; #19010
• страница: 23 из 64

3.2.4.Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов

Регуляция тканеспецифической экспрессии генов с использованием энхансеров и сайленсеров, а также некоторых других негативных регуляторных процессов часто происходит по механизмам, принципиально отличающимся от ранее рассмотренных. Речь идет о регуляторных эффектах, реализующихся через изменение структуры хроматина.



Рис. I.33. Модель негативной регуляции активности интронного энхансера гена тяжелой цепи иммуноглобулина мышей

а – структура фрагмента ДНК в окрестностях энхансера. Обозначены сайты связывания фактора NF-NR, а также MAR-последовательности; б – активное состояние энхансера, при котором MAR-последовательности ассоциированы с ядерным матриксом, а сам энхансер взаимодействует с активаторами А; в – неактивное состояние энхансера, при котором тетрамер фактора NF-NR предотвращает взаимодействие MAR-последовательностей с ядерным матриксом и изменяет пространственную структуру энхансера
Интронный энхансер гена тяжелой цепи иммуноглобулина содержит много сайтов связывания для различных тканеспецифических, а также других широко распространенных факторов транскрипции. Максимальная активность энхансера наблюдается в зрелых B-лимфоцитах, где ген претерпевает ряд соматических перестроек. Активность этого энхансера обнаруживается и в некоторых нелимфоидных тканях. Однако в печени или фетальных фибробластах, а также в нескольких других тканях его активность полностью подавлена. Исследования с использованием сайт-специфического мутагенеза показали, что такой энхансер фланкирован негативными регуляторными последовательностями нуклеотидов, которые ингибируют его активность в незрелых B-клетках или клетках других типов, но не обладают аналогичными свойствами в зрелых B-лимфоцитах (рис. I.33,а). Оба этих регуляторных элемента требуются для проявления ингибирующей активности, для которой важно также их положение относительно энхансера. В регуляторных элементах обнаружены сайты связывания транскрипционного фактора NF-NR, содержание которого особенно велико в клетках, где активность энхансера подавлена. Поскольку фактор NF-NR способен образовывать тетрамеры, предполагается, что прямое взаимодействие между этими молекулами, ассоциированными с сайтами связывания, фланкирующими энхансер, может приводить к структурной перестройке сегмента ДНК, заключенного между такими сайтами и содержащего энхансер (см. рис. I.33,б,в). Кроме того, регуляторные последовательности, связывающие NF-NR, содержат MAR-сайты, взаимодействующие с ядерным матриксом, и последовательности, с которыми контактирует ДНК-топоизомераза II, что еще раз указывает на необходимость структурных перестроек ДНК в процессе изменения ее регуляторных функций.

В рассматриваемом случае механизм негативной регуляции активности энхансера можно представить в следующем виде. В клетках, где отсутствует фактор транскрипции NF-NR (зрелые B-лимфоциты), последовательности MAR, которые фланкируют энхансер, ассоциированы с ядерным матриксом, что сопровождается формированием пространственной структуры энхансера, открытой для взаимодействия с активаторами транскрипции (см. рис. I.33,б). Это приводит к эффективной транскрипции всего гена иммуноглобулина. В клетках же, где фактор NF-NR присутствует в больших количествах, фрагмент ДНК с энхансером не ассоциирован с ядерным матриксом, так как MAR-сайты блокированы фактором (см. рис. I.33,в). Энхансер приобретает закрытую для позитивных регуляторных факторов конформацию, что сопровождается подавлением транскрипции регулируемого им гена. Рассмотренный пример иллюстрирует один из частных случаев изменения пространственной структуры ДНК и хроматина, а также уровня транскрибируемости ДНК под действием коротких последовательностей нуклеотидов, фланкирующих регулируемый генетический локус. Подобный принцип широко используется для регуляции экспрессии генов у эукариот. Другие примеры этого впечатляющего явления в обобщенном виде будут рассмотрены ниже.

Эффект положения и концепция пограничных последовательностей: инсуляторы. Давно известно, что перенос гена или группы генов в гетерохроматиновые (неактивные в отношении транскрипции) участки хромосом часто сопровождается ослаблением или прекращением его экспрессии (так называемый эффект положения), и, наоборот, некоторые гены после переноса сохраняют свою активность и в гетерохроматиновом окружении. Подавление экспрессии таких транслоцированных генов может быть полным при стабильном эффекте положения и варьировать в зависимости от типа соматических клеток, в которых находится хромосома с транслокациями. Поскольку в последнем случае в организме образуются клоны соматических клеток, с разной эффективностью экспрессирующих транслоцированные гены (вплоть до полного подавления их транскрипции), такой эффект положения называют эффектом положения мозаичного типа (position effect variegation – PEV). Дальнейшее подтверждение существования эффекта положения получено с развитием методов трансгеноза – введения чужеродных рекомбинантных генов в геном клеток зародышевой линии высших организмов.

Исследование этого явления привело к открытию так называемых пограничных последовательностей нуклеотидов (boundaries), фланкирующих функционально активные домены хроматина. Оказалось, что существуют определенные последовательности нуклеотидов длиной в несколько сотен пар оснований, которые обладают способностью подавлять позитивное и негативное влияние эухроматина и гетерохроматина на экспрессию трансгенов, интегрированных в этот хроматин и фланкированных указанными последовательностями в новом сайте интеграции. Фактически такие участки ДНК как бы изолируют ген, находящийся между ними, способствуя сохранению его обычной пространственной структуры, которая может отличаться от структуры окружающего хроматина. Эти последовательности известны кроме того под названием инсуляторов (англ. insulate – изолировать), а также как регуляторные области локусов (locus control regions – LCR). К таким пограничным последовательностям относятся, например A-элементы, фланкирующие ген лизоцима цыплят, scs-элементы (specialized chromatin structure elements), окружающие ген hsp70 Drosophila melanogaster, а также последовательности нуклеотидов, разделяющие регуляторные элементы iab комплекса Bithorax того же объекта. Введение одного из таких элементов между энхансером и промотором регулируемого гена приводит к функциональной изоляции энхансера и подавлению экспрессии гена, а фланкирование гена пограничными последовательностями предохраняет его от инактивирующего действия окружающего конденсированного гетерохроматина, т.е. снимает эффект положения. При подавлении активности энхансеров инсуляторами ярко проявляется еще одно их свойство – полярность действия. Инсуляторы однонаправленно выключают энхансеры, расположенные дистально (на значительном расстоянии) по отношении к регулируемому промотору, но не рядом с ним (подробнее см. ниже). В дополнение к этим функциональным свойствам инсуляторов показано, что они могут разделять два участка хроматина, резко различающиеся по пространственной структуре. В этом случае по одной стороне от пограничной последовательности располагается сильно компактизованный хроматин, ДНК которого недоступна действию нуклеаз, а по другой – хроматин в открытой конформации, характерной для компетентных в отношении транскрипции генов.

Способность последовательностей нуклеотидов ДНК выполнять функции инсуляторов обычно определяют в функциональных генетических тестах по их способности обеспечивать экспрессию генов, искусственно интегрированных в хромосому (трансгенов), независимо от локализации сайта интеграции. В качестве гена-репортера при определении активности инсуляторов часто используют ген white дрозофилы, поскольку изменение уровня его экспрессии сопровождается легко измеряемым изменением окраски глаз у трансгенных мух, которая может меняться от красного, свойственного организмам дикого типа, до желтого и, наконец, белого, встречающегося у так называемых нуль-мутантов, для которых характерно полное подавление экспрессии мутантного гена. В такого рода исследованиях была обнаружена высокая эволюционная консервативность инсуляторов и регуляторных белков, взаимодействующих с ними. В частности, LCR-последовательности -глобинового гена цыплят эффективно функционируют в этой системе в качестве инсуляторов. Одной из наиболее хорошо изученных последовательностей нуклеотидов, обладающей свойствами инсулятора, является транскрибируемый нетранслируемый участок ДНК ретротранспозона gypsy у дрозофилы, содержащий сайты связывания белка-супрессора Hairy-wing (su(Hw)), свойства которого будут подробнее рассмотрены ниже.

До настоящего времени окончательно не разрешен вопрос о способности MAR/SAR-последовательностей, разделяющих функциональные домены хроматина, выполнять функции пограничных последовательностей. Хотя показано, что некоторые SAR-последовательности не способны подавлять эффект положения, для других аналогичных последовательностей такая способность была продемонстрирована. Например, свойствами инсуляторов обладают соответствующие последовательности уже упомянутого выше гена тяжелой цепи иммуноглобулина, а также генов лизоцима цыплят, -интерферона и аполипопротеина B человека. В последнем случае сайты прикрепления ДНК к ядерным мембранам расположены за 5 т.п.о перед точкой инициации транскрипции и на 43 т.п.о. ниже этой точки, на границах между конденсированной и открытой формами хроматина. Последовательности, располагающиеся в этих участках хроматина, обладают повышенной чувствительностью к ДНКазе I и обеспечивают правильную экспрессию интегрированного в хромосомы гена-репортера в клетках-трансфектантах гепатомы, вызывая 200-кратную стимуляцию его транскрипции, не зависимую от локализации места интеграции. Все это указывает на то, что данные 3’- и 5’-концевые MAR APOB-локуса человека обладают всеми свойствами пограничных последовательностей. Функционирование SAR-последовательностей в качестве инсуляторов в ряде случаев не является конститутивным, но зависит от типа клеток и стадии развития организма. Например, SAR-последовательности гена -интерферона человека, фланкирующие мышиный ген теплового шока HSP70.1, функционируют как инсуляторы в клетках эмбрионов мышей на стадии предимплантации, но не в дифференцирующихся тканях новорожденных и взрослых трансгенных мышей. На такого рода наблюдениях основано заключение, что топологические домены хромосом, выделяемые MAR/SAR-последовательностями, не являются статическими образованиями, но могут изменяться в процессе индивидуального развития организма, что, в свою очередь, сопровождается изменением характера экспрессии больших блоков генов в дифференцирующихся клетках.

Структурно-функциональный анализ инсуляторов в вышеупомянутой системе с геном white показал, что последовательности участков инсуляторов, гиперчувствительных к ДНКазе I, необходимы для их функционирования, тогда как центральная А/T-богатая область, устойчивая к действию нуклеазы, для этого не требуется. Удаление части последовательностей из гиперчувствительных сайтов сопровождается понижением активности инсуляторов, тогда как простое увеличение числа копий последовательностей восстанавливает их активность. На этом основании делается вывод, что активность пограничных последовательностей может обеспечиваться определенным критическим количеством молекул связавшихся с ними белков, неспецифичных в отношении типа инсулятора, которые могут действовать на энхансеры либо непосредственно, либо через изменение структуры хроматина.

Природа белкового компонента, взаимодействующего с пограничными последовательностями, была определена в случае типичного инсулятора: scs’-последовательности гена теплового шока дрозофилы. Из ядер культивируемых клеток был выделен белок BEAF-32 (boundary element associated factor) с молекулярной массой 32 кДа, который взаимодействует с палиндромной последовательностью, фланкирующей два гиперчувствительных к ДНКазе участка в scs’. С помощью иммунохимических методов локализовали множественные высокоспецифические места связывания BEAF-32 на политенных хромосомах с одной из сторон пуффов, образующихся на определенных стадиях развития личинок мух, что подчеркивает двухкомпонентный состав последовательностей нуклеотидов инсуляторов. Хотя белки, связывающиеся с противоположной частью этой пограничной последовательности, еще не идентифицированы, предполагают, что белки двух частей инсулятора взаимодействуют друг с другом. Полагают также, что такого рода связывание белков, ассоциированных с различными инсуляторами, может быть одним из необходимых условий формирования большого числа разнообразных функционально активных доменов хромосом, что, в свою очередь, может обеспечивать специфическую экспрессию заключенных в них генов на разных стадиях онтогенетического развития организма.



Рис. I.34. Структура и функционирование инсулятора ретротранспозона gypsy дрозофилы

а – последовательность инсулятора (ins), представленная 12 копиями сайта связывания белка su(Hw) (su), взаимодействующего с белком mod(mdg4) (mo). Комплекс этих белков, связанных с инсулятором, однонаправленно подавляет активность энхансеров (перечеркнутые заштрихованные эллипсы) гена yellow в соответствующих тканях; б – инактивация белка mod(mdg4) под действием мутации разрушает белковый комплекс su–mo, и подавление транскрипции под действием инсулятора становится неспецифическим (двунаправленным).

Обозначения тканей дрозофилы: wng – крылья, bc – катикула тела, lv – ткани личинки, tc – тарзальные коготки, br – щетинки
Вышеупомянутый инсулятор ретротранспозона gypsy содержит 12 сайтов связывания белка su(Hw). Коровая последовательность этих сайтов гомологична октамерной последовательности, обнаруженной в различных энхансерах и промоторах позвоночных. Эта последовательность фланкирована AT-богатыми участками, которые способствуют изгибанию молекулы ДНК, требуемому для правильных ДНК-белковых взаимодействий в этом участке генома. Полипептидная цепь белка su(Hw) содержит 12 доменов типа "цинковые пальцы", необходимых для его связывания с ДНК и функционирования инсулятора. Кроме того, белок su(Hw) обладает двумя кислыми доменами, локализованными вблизи его С-конца, которые обеспечивают его взаимодействие с энхансерами и нужны для подавления эффекта положения. Абсолютно необходимым для функционирования инсуляторов является и -спиральный участок полипептидной цепи этого белка, гомологичный второму спиральному участку (helix-coiled coil) основных факторов транскрипции группы HLH-bzip, содержащему домен типа "лейциновая застежка". Поскольку такой домен обычно требуется для осуществления белок-белковых взаимодействий, полагают, что для функционирования этого инсулятора кроме белка su(Hw) необходимы и другие белки.

С помощью классического генетического анализа был идентифицирован второй компонент инсулятора su(Hw). Мутации в гене modifier of mdg4 (mod(mdg4)) ингибировали полярное действие инсулятора на энхансеры (рис. I.34,а) и усиливали мозаичный эффект положения для генов, транслоцированных в гетерохроматин. У таких мутантов действие инсулятора на подавление активности энхансеров было двунаправленным и не зависело от расстояния между энхансерами и промотором (см. рис. I.34,б). Ген mod(mdg4) кодирует, по крайней мере, три белка, которые возникают в результате альтернативного сплайсинга и содержат BTB-домен, характерный для многих факторов транскрипции, например уже упоминаемого GAGA-фактора, осуществляющего свое действие через изменение структуры хроматина. Полагают, что двунаправленное подавление функций энхансеров инсулятором gypsy в отсутствие функционально активного белка mod(mdg4) являются следствием гетерохроматизации последовательностей, окружающих инсулятор. В этой связи подавление активности энхансеров у мутантов mod(mdg4) может происходить из-за изменений в нуклеосомной структуре данных участков ДНК. Поскольку для развития эффекта требуется наличие нативных доменов типа "лейциновая застежка" и кислых доменов белка su(Hw), предполагают, что процесс гетерохроматизации ДНК в отсутствие функционального белка mod(mdg4) является следствием взаимодействия белка su(Hw) с другими белками. Ингибирующее действие инсулятора ретротранспозона gypsy может распространяться на энхансеры, находящиеся по отношению к нему в транс-положении, т.е. на гомологичной хромосоме.

Дальнейшим указанием на то, что действие пограничных последовательностей на соответствующие гены осуществляется через изменение структуры хроматина, было получено при исследовании их влияния на дозовую компенсацию у дрозофилы. Для экспрессии генов, расположенных на X-хромосоме самцов и самок этого организма, характерен одинаковый уровень, хотя содержание (доза) таких генов у самок в два раза выше, чем у самцов. Это равновесие достигается за счет механизма, повышающего вдвое скорость транскрипции сцепленных с X-хромосомой генов у самцов и получившего название дозовой компенсации. На X-хромосоме самцов происходит сборка мультимерных белковых комплексов (так называемых летальных комплексов), которые изменяют нуклеосомную структуру хромосомы за счет ацетилирования остатков Lys-16 гистона H4. Способность к дозовой компенсации полностью отсутствует у локусов X-хромосомы, перенесенных на аутосомы, т.е. последние подавляют этот эффект. Однако если трансген фланкирован пограничными последовательностями ретротранспозона gypsy, то у 90% трансгенов, интегрированных в аутосомы, происходит правильная дозовая компенсация. Механизм этого явления пока непонятен. Предполагают, что изменение структуры хроматина в трансгене под действием инсуляторов делает возможным сборку на нем летального комплекса или может препятствовать доступу деацетилаз к гистонам нуклеосом.

Результаты исследований белков BEAF-32, su(Hw) и mod(mdg4) указывают на то, что инсуляторы и пограничные последовательности формируют мультибелковые комплексы, регулирующие экспрессию генов через изменение структуры соседнего с ними хроматина. Такие изменения конформации хроматина могут оказывать влияние на взаимодействия между энхансерами и промоторами генов, не изменяя функциональной активности энхансеров как таковых. При этом изменения структуры хроматина, вызываемые инсуляторами, не препятствуют элонгации РНК РНК-полимеразами.

В настоящее время идентифицированы и другие хромосомные белки, обеспечивающие инактивацию генов через конденсацию хроматина, которые, кроме того, необходимы для поддержания хроматина и целых хромосом в конденсированном неактивном состоянии. К таким белкам, в частности, относится белок гетерохроматина 1 (HP-1) дрозофилы, ассоциированный с -гетерохроматином. Мутации в гене, кодирующем белок HP-1, являются супрессорными, подавляющими мозаичный эффект положения (PEV). В то же время дупликация этого локуса усиливает PEV, что указывает на зависимость упаковки гетерохроматина, инактивирующей гены, от внутриклеточной концентрации белка HP-1. Для такого белка характерна высокая эволюционная консервативность, и его гомологи обнаружены у мышей, человека и растений. Использование переходов конденсации–деконденсации хроматина для регуляции экспрессии как отдельных генов, так и их громадных массивов, по-видимому, является прерогативой эукариот. Еще одним ярким примером такого рода служит инактивация одной из X-хромосом самок млекопитающих в раннем эмбриогенезе.

Инактивация X-хромосом. Поскольку соматические клетки самок млекопитающих содержат две половые X-хромосомы, а самцов – только одну, у самок возникает необходимость в компенсации двойной дозы генов, сцепленных с этими хромосомами. Такая проблема решается путем инактивации одной из X-хромосом, являющейся следствием перевода ее хроматина в высококонденсированное состояние с подавленной транскрипцией. Хотя в большинстве случаев в разных клетках одного и того же животного случайным образом инактивируется или материнская, или отцовская X-хромосома, имеются специальные случаи, когда во всех клетках только отцовская хромосома становится транскрипционно неактивной. Последний случай, получивший название "импринтный тип инактивации X-хромосомы", характерен для сумчатых животных и обнаружен в некоторых клетках эмбрионов мышей. (Более подробно о генетическом импринтинге см. раздел 3.2.5.)

Лучше всего молекулярные механизмы инактивации X-хромосомы изучены у человека, мышей и сумчатых животных. В ранних эмбрионах мышей и человека обе X-хромосомы активны. У мышей инактивация X-хромосомы впервые обнаруживается в ранних эмбрионах на стадии бластоцисты, когда для всех внеэмбриональных клеток характерен импринтный тип инактивации только отцовских X-хромосом. Позднее, через 6 дней эмбрионального развития во всех клетках зародыша материнские и отцовские X-хромосомы инактивируются случайным образом. Неактивное состояние хромосом высокостабильно, и их реактивация (повторная активация) имеет место лишь у самок в клетках зародышевой линии. В клетках зародышевой линии самцов единственная X-хромосома инактивируется в раннем сперматогенезе.

Свойства инактивированных X-хромосом. Все инактивированные X-хромосомы обладают некоторыми общими свойствами. Их ДНК реплицируется в поздней S-фазе клеточного цикла, а в интерфазе они присутствуют в высококонденсированном состоянии в виде так называемых телец полового хроматина (sex chromatin bodies). Все это происходит на фоне низкого уровня ацетилирования гистонов и появления нового гистона macro H2A1, что указывает на возможные изменения структуры нуклеосом. В эмбриональных соматических клетках (но не в клетках зародышевой линии) плацентарных млекопитающих метилированы CpG-островки генов инактивированной X-хромосомы, в отличие от CpG-островков остальной части генома. Неметилированными остаются и CpG-островки инактивированных X-хромосом сумчатых животных. Большая часть вышеперечисленных свойств инактивированных X-хромосом присуща и обычному гетерохроматину. Поэтому процесс инактивации рассматривают как гетерохроматизацию X-хромосом.

У редко встречающихся индивидуумов с ненормальным числом X-хромосом – X0, XX, XXY и т.п. независимо от их числа – по-прежнему инактивированной остается только одна половая хромосома. В отличие от этого, в клетках триплоидных организмов, содержащих по три набора хромосом, инактивируется или одна, или две X-хромосомы, а у тетраплоидов – две. Такого рода данные указывают на существование механизма, поддерживающего в активном состоянии одну X-хромосому на каждые два набора аутосом. Таким образом, перед инактивацией в эмбриональных клетках происходит определение числа наборов аутосом, выбор X-хромосом, остающихся активными, и инициация инактивации остальных X-хромосом.

Инициация инактивации X-хромосом. Процесс инактивации X-хромосом начинается на определенном участке, получившем название центра инактивации X-хромосомы (X-inactivation center). В этом участке был картирован ген Xist (X inactive specific transcript), который впоследствии был клонирован. Сегменты X-хромосомы, у которых центр инактивации удален в результате делеций или транслокаций, не подвергаются инактивации. С помощью генного нокаута Xist было установлено, что для инактивации X-хромосом требуется его транскрипция. Введение гена Xist с помощью трансгеноза в аутосомы было достаточным для инициации инактивации последних.

Ген Xist как основной регулятор инактивации X-хромосом. С помощью генного нокаута удалось показать, что за определение внутриклеточного числа X-хромосом (counting) и инициацию их инактивации отвечают разные участки гена Xist. 5'-Концевая часть гена необходима для инициации инактивации, а его 3'-концевая зона участвует в счете хромосом, в результате которого определяется, какая хромосома остается активной. X-Хромосомы с поврежденной 3'-концевой частью гена Xist всегда инактивируются. В этой серии экспериментов было также установлено, что ген Xist требуется как для случайной инактивации хромосом, так и для инактивации импринтного типа, однако его участие, возможно, не требуется для инактивации X-хромосом в мужских зародышевых клетках. В связи с тем, что на активных X-хромосомах ген Xist сильно метилирован, полагают, что его метилированное состояние сопровождается репрессией гена, препятствующей инактивации X-хромосом.

Удивительным свойством гена Xist является то, что он не кодирует белки. В результате экспрессии гена образуется большая РНК, длина которой составляет 15–17 т.о. После окончания синтеза РНК остается в ядре, а в клетках, где X-хромосома уже инактивирована, эта РНК создает "оболочку" вокруг неактивной хромосомы. В недифференцированных эмбриональных стволовых клетках, где обе X-хромосомы активны, зоны экспрессии гена Xist выявляются с помощью гибридизации in situ в виде отдельной точки на каждой хромосоме на фоне общего низкого содержания Xist-РНК. Во время дифференцировки клеток зона содержания Xist-РНК расширяется вдоль будущей неактивной хромосомы на фоне увеличения ее количества. Одновременно резко уменьшается уровень экспрессии гена Xist на хромосоме, остающейся активной.

Повышение внутриклеточного уровня Xist-РНК происходит не за счет стимуляции транскрипции гена, но вследствие стабилизации самих молекул РНК. При этом стабильная и нестабильная РНК транскрибируются с разных промоторов одного и того же гена. И стабилизация, и хромосомная локализация Xist-РНК являются необходимыми, но не достаточными условиями инактивации X-хромосомы. В ранних эмбрионах мышей на стадии предимплантации отцовские X-хромосомы покрыты оболочкой Xist-РНК, однако остаются в активном состоянии. Это указывает на участие дополнительных факторов в эмбриональной инактивации X-хромосом, которые отсутствуют в клетках ранних эмбрионов.

Установление и поддержание неактивного состояния X-хромосом. Механизм распространения зоны неактивного хроматина вдоль X-хромосом от центра инактивации пока остается непонятным. В аутосомах, содержащих транслоцированный центр инактивации или интегрированный трансген Xist, инактивация распространяется в обе стороны на многие миллионы пар оснований. Однако в этом случае гетерохроматизация хроматина происходит менее эффективно и по-разному на индивидуальных хромосомах. При этом некоторые гены аутосом остаются в активном состоянии. Полагают, что для X-хромосом характерно наличие специфических последовательностей, необходимых для их эффективной гетерохроматизации при инактивации, которые отсутствуют в аутосомах.

Некоторые гены инактивированных X-хромосом продолжают функционировать. Часть из них имеет гомологов на Y-хромосоме и поэтому не требует дозовой компенсации. В ряде случаев их активированное состояние является следствием реактивации предварительно инактивированного хроматина. Однако для большинства таких генов механизм поддержания в активном состоянии на фоне молчащего генетического окружения остается неизвестным.

Ген Xist транскрибируется в клетках всех женских особей в присутствии метилированных CpG-островков генов инактивированных X-хромосом. В культивируемых клетках деметилирующие агенты вызывают частичную реактивацию молчащих генов на этих хромосомах. Не исключено, что кроме этих механизмов инактивированное состояние X-хромосом поддерживает и поздняя репликация их ДНК. У сумчатых животных имеет место поздняя репликация, однако не наблюдается дифференциального метилирования CpG-островков, и у них инактивированное состояние X-хромосом менее стабильно, чем у плацентарных млекопитающих. В последнем случае даже прекращение транскрипции гена Xist не сопровождается реактивацией молчащих X-хромосом, однако на фоне слабого метилирования такая реактивация иногда происходит. Таким образом, поддержание инактивированного состояния X-хромосомы является сложным многоуровневым процессом.

Импринтная инактивация только отцовских X-хромосом рассматривается как эволюционно более примитивная форма дозовой компенсации у животных. Действительно, в этом случае повышается вероятность вредного воздействия на организм мутантных материнских генов, локализованных на X-хромосоме. Такая вероятность должна быть меньше при случайной инактивации в разных клетках отцовских и материнских хромосом. Наличие молекулярных механизмов, регулирующих экспрессию генов через дозовую компенсацию, позволило высказать предположение, что эволюционный обмен генами между аутосомами и половыми хромосомами является вредным для биологического вида, так как может приводить к регуляторному дисбалансу экспрессии транслоцированных генов. Был сформулирован так называемый закон Оно, в соответствии с которым гены, сцепленные с X-хромосомой у одного вида млекопитающих, должны оставаться сцепленными с X-хромосомой и у всех остальных.

Аналогично тому, что было показано на примере X-хромосомы сумчатых млекопитающих, при делении во время митоза дочерние клетки могут наследовать от родительских не только прямую генетическую информацию в виде новой копии всех генов, но и определенный уровень их активности (в данном примере – активное или неактивное состояния). Такой тип наследования генетической информации получил название эпигенетического наследования. Современная эпигенетика изучает наследуемые особенности (паттерны) экспрессии генов, вызываемые потенциально обратимыми изменениями структуры хроматина и(или) метилирования ДНК, не сопровождаемые изменениями ее первичной структуры.

3.2.5.Импринтинг

Другим характерным примером регуляции экспрессии генов, приводящей к эпигенетическому наследованию признаков, является уже упомянутый выше импринтинг, при котором специфический характер дифференциальной активности генов определяется полом организма, от которого эти гены унаследованы. В частности, у некоторых насекомых, например грибных комариков (Sciaridae), весь набор отцовских хромосом элиминируется во время сперматогенеза. У этих организмов отцовские хромосомы маркируются в цитоплазме клеток зародышевой линии, удаляются при созревании гамет и не передают свои гены следующему поколению. У млекопитающих и высших цветковых растений отцовские и материнские гены оказывают разный эффект на развитие эмбриона, но в одинаковой степени представлены в гаметах, образующихся в результате мейоза. В этом случае вклады отцовского и материнского геномов в развитие организмов не эквивалентны и происходит видимое искажение менделевских правил наследования некоторых признаков. Иными словами, характер экспрессии отцовского и материнского аллелей одного и того же гена в организме-потомке может быть различным, так как зависит от их происхождения. Молекулярные механизмы этого явления в настоящее время до конца непонятны. Предполагается, что в развитие феномена импринтинга вносят вклад зависимые от пола модификации ДНК определенных генов, в частности метилирование их регуляторных участков.

3.2.6.Метилирование ДНК в регуляции транскрипции

Единственной известной генетически запрограммированной ковалентной модификацией ДНК у высших эукариот является метилирование остатков цитозина в положении 5 с образованием 5-метилцитозина (5-mC). Эта реакция катализируется ферментом (цитозин-5)-ДНК-метилтрансферазой (Мтазой), который обнаружен у прокариот и эукариот. Каталитический механизм действия этих ферментов был подробно изучен на примере бактериальной метилазы M.HhaI, которая модифицирует соответствующий сайт рестрикции. С помощью рентгеноструктурного анализа было показано, что после взаимодействия Мтазы со специфическим участком ДНК остаток модифицируемого цитозина выпячивается из двойной спирали и образует ковалентную связь с полипептидной цепью фермента в положении С6. В этом промежуточном комплексе активированный атом углерода С5 акцептирует метильную группу S-аденозилметионина, выступающего в качестве кофактора. Полипептидные цепи Мтаз эукариот содержат на своих N-концах большой домен, который обеспечивает ядерную локализацию ферментов, их доставку к репликативным вилкам, ответ ферментов на регуляторные воздействия.

Большинство прокариотических Мтаз способны метилировать ДНК de novo, распознавая неметилированные палиндромные гексануклеотидные последовательности. Они также метилируют последовательности, в которых одна цепь ДНК уже содержит метильные группы. В отличие от этого эукариотические Мтазы относятся к "поддерживающим" ферментам, которые узнают и метилируют только наполовину метилированные последовательности, формирующиеся во время репликации ДНК, когда вновь синтезированная цепь неметилирована. У млекопитающих остатки С метилируются преимущественно в составе динуклеотидов CpG, однако в последнее время описаны случаи метилирования и последовательностей CpNpG. В геноме позвоночных животных метилировано  70% динуклеотидов CpG и 6–7% всех остатков цитозина.

"Поддерживающие" Мтазы животных обладают небольшой способностью осуществлять метилирование ДНК и de novo в полностью неметилированных участках, а также искусственных субстратов (олигонуклеотидов), содержащих ошибочно спаренные основания. Остается непонятным, является ли указанное свойство Мтаз достаточным для осуществления метилирования de novo обширных участков генома в эмбриогенезе или же этот процесс происходит с участием других ферментов. Известно, что гомозиготные делеции в гене Мтазы у мышей вызывают гибель зародышей в раннем эмбриогенезе, что указывает на важную роль метилирования ДНК в онтогенезе млекопитающих. Однако даже у таких мутантных эмбрионов небольшая часть последовательностей ДНК метилирована.

Метилирование остатков цитозина оказывает влияние на структурные характеристики ДНК. Это проявляется в облегчении перехода метилированных участков ДНК из B-формы в Z-форму, увеличении шага спирали ДНК и изменении кинетики образования крестообразных структур. Метильная группа 5-mC выступает на поверхности большой бороздки ДНК, находящейся в B-форме, и увеличивает ее гидрофобность, что в ряде случаев является решающим фактором при взаимодействии белков с соответствующими участками ДНК.

Регуляция экспрессии генов с помощью метилирования ДНК. Метилирование остатков C может оказывать влияние на транскрипцию как непосредственно через изменение эффективности связывания позитивных и негативных факторов транскрипции со своими регуляторными участками на ДНК, так и опосредованно через формирование неактивных в транскрипционном отношении участков хроматина. Поскольку 5-mC структурно подобен тимину, метилирование остатков C может сопровождаться возникновением новых консенсусных последовательностей для некоторых факторов транскрипции. В частности, метилирование превращает низкоаффинный сайт связывания фактора транскрипции AP-1 (CGAGTCA) в высокоаффинный сайт (mCGAGTCA), который соответствует консенсусному сайту для этого фактора (TGAGTCA). Также неоднократно описано ингибирование взаимодействия некоторых белков с ДНК в результате метилирования CpG-последовательностей в сайтах их связывания (табл. I.15).

Таблица I.14

Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов

Фактор транскрипции	Узнаваемая последовательность
AP-2	CCCGCCGGCG
AP-2	CTCCGGGG(C/T)TG
Ah-рецептор	TTGCGTG
CREB/ATF	TGACGTCA
CREB/ATF	CTGCGTCA
E2F	TTTTCGCGC
EBP-80	ATCTGCGCATATGCC
Ets	CGGAAG
MLTF	GGCCACGTGACC
MTF-1	TGCGCCCG
c-Myc, c-Min	CACGTG
GABP	TTCCGGGC
NF-B	GGGACTTTCCG
HiNF-P	CGGTTTTCAATCTGGTCCG
MSPF	ATGCGNNNNCGCCT

В табл. I.15 представлены только консенсусные последовательности, узнаваемые соответствующими факторами транскрипции с подчеркнутыми динуклеотидами CpG, метилирование которых оказывает влияние на взаимодействие факторов с ДНК. Интересно, что фактор Sp1, необходимый для инициации транскрипции на промоторах многих генов домашнего хозяйства, может связываться с метилированными и неметилированными консенсусными последовательностями и, кроме того, предотвращать метилирование соседних последовательностей нуклеотидов. Поскольку Sp1 обнаружен у высших эукариот, ДНК которых содержит 5-mC, предполагают, что данный фактор может играть специфическую роль в регуляции метилирования ДНК у этих организмов.

Известные промоторы, за небольшим исключением (например промотора гена главного комплекса гистосовместимости H-2K), неактивны в метилированном состоянии. Единственная метильная группа, введенная в промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса или в С-промоторы вируса Эпштейна–Барр, может оказывать большое негативное влияние на транскрипцию. Уровень подавления активности других промоторов, в частности промоторов - и -глобиновых генов человека или промотора мышиного гена MyoD1, находится в прямой зависимости от числа введенных в них метильных групп, но не от их положения в промоторах. Ингибирование транскрипции, вызванное частичным метилированием промоторов, может преодолеваться с помощью энхансеров, однако полностью метилированные промоторы не реактивируются энхансерами и сохраняют свое репрессированное состояние, несмотря на присутствие последних. На основании такого рода данных высказывается предположение, что метилирование ДНК регулирует транскрипцию по принципу "все или ничего" и не обеспечивает тонкой регуляции экспрессии генов.

Влияние метилирования ДНК на структуру хроматина. Характер метилирования ДНК может оказывать решающее влияние на структуру хроматина и фазирование (phasing) нуклеосом. Термином "фазирование" обозначают неслучайное расположение нуклеосом относительно конкретной последовательности нуклеотидов ДНК в определенных участках генома. Большинство нуклеосом генома животных располагаются на ДНК случайно. В редких случаях фазирования последовательности нуклеотидов упаковываются в нуклеосомы одним и тем же способом во всех клетках организма, что может оказывать влияние на эффективность транскрипции и репликации ДНК в соответствующих локусах. В настоящее время у млекопитающих описано несколько белков, которые взаимодействуют преимущественно с метилированной ДНК. К ним относятся, например вирусный белок MDBP1 (Major DNA-Binding Protein) и белки человека MeCP1/2 (Methyl-CpG-Binding Protein), а также комплекс белков MDBP2 и гистона H1. Если белок MeCP2 для своего взаимодействия требует присутствия в соответствующем участке ДНК только одного метилированного CpG, то белок MeCP1 связывается с ДНК лишь при наличии нескольких метилированных динуклеотидов. С использованием специфических антител было установлено, что белок MeCP2 локализован преимущественно в G-полосах гетерохроматина метафазных хромосом. Гомозиготные делеции в гене этого белка летальны для мышей, что указывает на важную роль MeCP2 в эмбриогенезе животных. Комплекс MDBP2–гистон H1 может связываться с участком ДНК, содержащим единственный метилированный CpG, и ингибировать транскрипцию. При этом белково-нуклеиновое взаимодействие усиливается после фосфорилирования белков.

Ярким примером подавления экспрессии генов путем формирования хроматина, структурированного специфическим образом, является уже обсуждавшаяся выше инактивация одной из X-хромосом самок млекопитающих. Большинство генов неактивной X-хромосомы прекращает свою экспрессию в раннем эмбриогенезе независимо от наличия в ней CpG-последовательностей. При этом метилирование ДНК и ацетилирование гистона H4 усиливают и стабилизируют репрессированное состояние неактивной X-хромосомы.

Активация генов, входящих в состав неактивного хроматина, требует изменения структуры хроматина и деметилирования ДНК. Обнаружены белковые комплексы, способные реактивировать неактивный хроматин. Деметилирование может происходить пассивно через подавление функционирования поддерживающих Мтаз. В этом случае дочерние цепи ДНК, образующиеся в процессе репликации, остаются неметилированными, что приводит к полному деметилированию ДНК после двух раундов репликации. Активное деметилирование ДНК происходит с участием специфических ферментов – деметилаз.

Гены, входящие в состав неактивного хроматина, в большинстве своем недоступны действию факторов транскрипции. Формирование неактивного хроматина через метилирование специфических последовательностей приводит к уменьшению линейных размеров генома и числа регуляторных последовательностей, доступных факторам транскрипции. Следствием этого является снижение неспецифических взаимодействий регуляторных белков с соответствующими последовательностями генов, что, в свою очередь, уменьшает уровень информационного шума в генетической системе, который может появляться в результате неконтролируемой транскрипции. В этой связи высказывается предположение о важной роли не только генетических, но и видоспецифических эпигенетических изменений в эволюции высших эукариот. Действительно, наследуемый характер паттернов метилирования геномной ДНК способствует стабилизации и распространению в популяциях специфических структур хроматина, а изменение паттернов через эпигенетические мутации может быть одним из путей повышения пластичности генетической информации и ее разнообразия, что может служить материалом для естественного отбора.

CpG-островки. Для генома эукариот характерно наличие изохор (isochores) – протяженных последовательностей, обогащенных GC- или AT-парами. GC-богатые изохоры локализуются в рано реплицирующихся участках хромосом и ассоциированы с R-сегментами (полосами), выявляемыми при их дифференциальной окраске. AT-богатые изохоры реплицируются в поздней S-фазе клеточного цикла и часто обнаруживаются в G-сегментах хромосом. CpG-Островки (CpG islands) представляют собой GC-богатые последовательности (60–70% GC) длиной не менее 200 п.о. с большим числом динуклеотидов CpG. Они локализуются преимущественно в R-сегментах и поддерживаются в неметилированном состоянии в клетках зародышевой линии и нормальных соматических тканей. Исключение составляют островки в генах, подвергнутых импринтингу, в генах инактивированных X-хромосом, а также в повторяющихся элементах генома LINE и SINE (например Alu), где они сильно метилированы. Полагают, что именно неметилированное состояние CpG-островков стабилизирует их структуру в эволюции генома из-за более низкой скорости мутирования по сравнению с 5-mC, который в результате дезаминирования часто превращается в тимин со всеми вытекающими отсюда мутагенными последствиями. В гаплоидном геноме человека обнаруживают  45000 CpG-островков, и считается, что большинство из них ассоциировано с генами. Промоторы многих генов домашнего хозяйства содержат неметилированные CpG-островки.

В настоящее время непонятен механизм поддержания CpG-островков в неметилированном состоянии. Поскольку Мтаза обладает способностью метилировать их in vitro, структурные особенности ДНК сами по себе не способны это обеспечивать. Считается, что в поддержании неметилированного состояния островков участвуют специфические белки хроматина. Хроматин CpG-островков не содержит гистона H1, а гистоны H2A и H2B в этих участках хроматина недоацетилированы. Кроме того, CpG-островки часто содержат сайты связывания фактора транскрипции Sp1, который, взаимодействуя как с метилированными, так и неметилированными сайтами, предотвращает их исходное или дальнейшее метилирование. Полагают, что именно этот фактор может играть ключевую роль в постоянном поддержании генов домашнего хозяйства в неметилированном активном состоянии.

Для соматических клеток, растущих в первичной культуре, характерно быстрое изменение характера метилирования ДНК. Это изменение часто связывают с ограниченным пролиферативным потенциалом культивируемых клеток и их старением как in vivo, так и in vitro. Многие гены культивируемых клеток гиперметилированы, а отдельные CpG-островки аутосом, поддерживаемые in vivo в неметилированном состоянии, переходят в метилированное состояние. Полагают, что гиперметилирование ДНК и инактивация многих генов культивируемых клеток являются следствием отбора, направленного на выключение экспрессии генов, которые не требуются безусловно для выживания клеток в культуре. Кроме того, в культуре происходит отбор клеток на способность к быстрому делению, поскольку быстро делящиеся клетки вытесняют медленно пролиферирующие. Поэтому гены, вызывающие задержку клеточного цикла и терминальную дифференцировку клеток, например p16 или MyoD1, быстро инактивируются у культивируемых клеток под действием мутаций или гиперметилированием.

Роль метилирования ДНК в дифференцировке клеток. Для разных органов и тканей организма характерны специфические наборы (паттерны) метилированных последовательностей ДНК. Такой мозаицизм в метилировании последовательностей генома не является следствием одних только ошибок функционирования системы метилирования, поскольку паттерны метилирования ДНК в гомологичных тканях разных индивидуумов обладают большим сходством. В этой связи можно говорить о тканеспецифическом характере метилирования ДНК, которое обеспечивается координированным функционированием системы метилаз и деметилаз в онтогенезе организма.

В экспериментах на культурах клеток было показано, что изменение паттернов метилирования под действием веществ, вызывающих деметилирование ДНК, например 5-азацитидина, может изменять дифференцированное состояние клеточных линий. В частности, инкубация эмбриональных фибробластов мышей с 5-азацитидином сопровождается их превращением в миобласты, адипоциты и хондроциты. Точно так же дифференцировка клеток эритролейкемии Френд может быть запущена с помощью деметилирующих агентов. Полагают, что в этих случаях в процессе деметилирования ДНК происходит активация генов-регуляторов, детерминирующих дифференцированное состояние клеток, которые, в свою очередь, индуцируют экспрессию всех остальных генов, необходимых для поддержания дифференцированного состояния. Экспрессия конкретных доминантных генов, ответственных за дифференцировку отдельных групп клеток в определенном направлении, должна жестко контролироваться и быть блокированной в клетках других типов. Метилирование ДНК может обеспечивать такое установление неактивного состояния генов дифференцировки и его поддержание в ряду клеточных поколений, т.е. контролировать стабильность дифференцированного состояния соматических клеток организма.

Отцовский импринтинг и аллельное исключение. При отцовском импринтинге, как об этом уже упоминалось выше, экспрессия некоторых генов в дочерних соматических клетках зависит от того, локализованы ли они на отцовских или материнских хромосомах. При этом часто наблюдают различный характер метилирования отцовских и материнских хромосом. У мышей известны 15 областей хромосом, подвергнутых импринтингу. У многих генов с таким эпигенетическим наследованием обнаружены прямые повторы, которые, как полагают, могут быть задействованы в установлении и поддержании импринтинга. Локализация нескольких генов, в регуляции экспрессии которых задействован импринтинг, в одном и том же участке хромосомы 16 указывает на то, что в установление импринтинга могут быть вовлечены целые домены хромосом.

При аллельном исключении происходит инактивация одного из аллелей, приводящая к функциональной гемизиготности соответствующего гена независимо от его происхождения со стороны родителей. Под гемизиготностью диплоидных организмов или отдельных соматических клеток понимают представленность одного или нескольких генов только одним аллелем, что может быть следствием анеуплоидии (потери одной или нескольких хромосом), делеции или функциональной инактивации второго аллеля. Гемизиготное состояние характерно, в частности для генов X-хромосом самок млекопитающих отдельных соматических клеток, где одна из X-хромосом инактивирована случайным образом. Феномен аллельного исключения описан для генов иммуноглобулинов животных, лишь один из аллелей которых претерпевает продуктивную перестройку под действием V-D-J-рекомбиназы в отдельных лимфоцитах развивающегося организма. Метилирование ДНК оказывает влияние на объединение V-D-J-сегментов генов и, возможно, играет ключевую роль в их аллельном исключении.

Обычно аллельное исключение тонко регулируется в онтогенезе. Однако теоретически аналогичный механизм может реализовываться в результате постепенно накапливаемых случайных ошибок метилирования на протяжении жизни организма. Накопление ошибок метилирования сверх определенного уровня должно сопровождаться выключением соответствующего аллеля на фоне нормального функционирования другого аллеля в конкретной соматической клетке. Происхождение часто обнаруживаемых частично метилированных CpG-сайтов в ДНК различных тканей объясняют такими ошибками метилирования, получившими название эпимутаций. На фоне эпимутаций может легко произойти инактивация единственного оставшегося аллеля дикого типа под действием обычных мутаций или в результате гиперметилирования, что приведет к полному подавлению экспрессии соответствующего гена.

Метилирование как механизм инактивации чужеродной и повторяющейся ДНК у эукариот. Т. Бестором (1990 г.) было высказано предположение о том, что метилирование ДНК у эукариот может выполнять защитную функцию, предохраняя организм от чужеродной ДНК и избытка эндогенных повторяющихся последовательностей. Поскольку у эукариот не описано ферментов рестрикции, специфичных в отношении GpC-последовательностей, предполагается, что такие защитные механизмы осуществляют инактивацию чужеродной ДНК, а не ее деградацию, как это имеет место у бактерий. Экспериментально установлено, что ДНК из внешних источников, например вирусная ДНК или ДНК, введенная в клетки с помощью трансфекции, а также эндогенная ДНК ретротранспозонов и повторяющихся последовательностей (в частности LINE и SINE) могут быть объектом метилирования de novo, приводящего к их генетической инактивации. Например, интеграция ДНК аденовирусов в эукариотический геном сопровождается ее постепенным метилированием. То же характерно и для латентного состояния некоторых других вирусов, которое поддерживается через метилирование остатков цитозина в ДНК их геномов Мтазами клетки-хозяина. Другим примером функционирования этого механизма является гиперметилирование трансгенов, интегрированных в геном организма-реципиента в большом числе копий.

Механизмы, которые позволяют высшим эукариотическим организмам избирательно распознавать и инактивировать чужеродную и повторяющуюся ДНК, не совсем понятны. Полагают, что Мтазы преимущественно распознают молекулы ДНК, формирующие необычные пространственные структуры, например петли или ошибочно спаренные нуклеотиды. В случае повторяющихся последовательностей мишенями Мтаз при метилировании de novo могут быть интермедиаты, образующиеся во время их рекомбинации друг с другом. У гриба Ascobulus immersus повторяющиеся последовательности эффективно распознаются и инактивируются в результате метилирования под действием механизма, получившего название премейотически индуцированного метилирования (methylation induced premeiotically – MIP). Аналогичный механизм у гриба Neurospora crassa назван мутагенезом, индуцированным повторяющимися последовательностями (repeat induced point mutations – RIP). В этом случае остатки цитозина в повторах либо метилируются ферментными системами гриба, либо превращаются в мутантные остатки тимина. Вообще, остатки С, которые являются мишенями для Мтаз, мутируют в геноме эукариот по механизму дезаминирования и превращения в остатки тимина гораздо чаще, чем другие остатки цитозина. Это позволяет рассматривать метилирование как постоянно функционирующий механизм эукариот, инактивирующий чужеродные и повторяющиеся последовательности ДНК с помощью таких мутаций.

Все рассмотренные выше регуляторные механизмы, контролирующие экспрессию генов, функционируют на одном из самых важных этапов реализации генетической информации – на уровне транскрипции. Однако и другие этапы передачи генетической информации являются важными объектами многочисленных регуляторных воздействий.