Рецензенты кандидат химических наук В. Г. Коробко доктор биологических наук В. А. Гвоздев Патрушев Л. И

• Название: Рецензенты кандидат химических наук В. Г. Коробко доктор биологических наук В. А. Гвоздев Патрушев Л. И
• Анкор: gene_expression.doc
• Дата: 08.05.2018
• Размер: 5.83 Mb.
• Имя файла: gene_expression.doc
• Тип: Документы; #19010
• страница: 31 из 64

5.1.1.Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности

В основе мутаций на молекулярном уровне лежат две основные причины: ошибки репликации и мутагенные воздействия различной природы. Ошибки репликации возникают из-за того, что точность функционирования ДНК-полимераз не является абсолютной. Поскольку выбор очередного нуклеотида для включения в растущую цепь ДНК определяется в результате взаимодействия белков и ферментов системы репликации и матричной ДНК, изменение свойств этих белков или матрицы как спонтанно, так и под действием различных модифицирующих агентов может приводить к ошибкам в репликации ДНК и мутациям.

Ошибки репликации. Как уже обсуждалось в разделе 4.1, синтез ДНК происходит в результате последовательного ферментативного присоединения дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, комплементарных матричной ДНК, к 3’-концевому нуклеотиду растущей цепи ДНК. Точность этого процесса определяется различиями в свободной энергии у канонических или ошибочных пар азотистых оснований ДНК, образующихся по правилам Уотсона–Крика в водных растворах. Различия составляют 1–3 ккал/моль и обеспечивают точность репликации в пределах не более одного ошибочно включенного нуклеотида на каждые 100 нуклеотидов.

Генетические методы определения частоты ошибок репликации, возникающих в процессе синтеза ДНК in vitro, бывают двух типов. При одном подходе измеряют частоту прямых мутаций, приводящих к инактивации какого-либо гена, изменение которого легко определить фенотипически. Удобной системой, основанной на таком принципе, является репликативная форма ДНК бактериофага M13mp2, содержащая часть гена -галактозидазы в виде одноцепочечной бреши, застраивающейся испытуемой ДНК-полимеразой в бесклеточной системе. Ошибки синтеза ДНК в этом случае выявляют по потере или уменьшению активности -галактозидазы, что не отражается на жизнеспособности бактериофага, который образуется после введения такой ДНК в бактериальные клетки с помощью трансфекции. С применением этого метода обнаруживают до 200 различных замен оснований, а также делеции, мутации со сдвигом рамок считывания и сложные генные перестройки.

При другом подходе к определению точности синтеза ДНК in vitro измеряют частоту обратных мутаций, восстанавливающих (под действием точковой мутации) последовательность нуклеотидов гена, активность белкового продукта которого была нарушена в результате, например амбер-мутации. Этот метод обладает большой чувствительностью, позволяя определять мутации, происходящие с частотами 10^-6–10^-8 на нуклеотид за одну генерацию. Однако он ограничен возможностью определения мутаций лишь одного конкретного типа.

Частота ошибок репликации увеличивается из-за спонтанных повреждений геномной ДНК, возникающих в результате ее депуринизации в физиологических условиях. Депуринизация является следствием разрыва N-гликозидной связи, соединяющей в молекуле ДНК пуриновые основания с остатками дезоксирибозы. По оценкам Линдаля и Ниберга депуринизация ДНК в организме происходит с частотой 310^-11 на нуклеотид в секунду, что в 100 раз выше частоты спонтанной потери пиримидиновых оснований ДНК в тех же условиях. Простой расчет показывает, что при такой частоте этих событий в соматической клетке человека должно происходить 10⁵ депуринизаций/день. Репликативный комплекс на ДНК-матрице взаимодействует с апуринизированным сайтом и включает в синтезируемую цепь ДНК преимущественно остатки дезоксиаденозина.

Многие бактериальные и эукариотические ДНК-полимеразы, осуществляющие репликацию ДНК, обладают 3’5’-экзонуклеазной корректирующей активностью, и поэтому ошибочно включенные нуклеотиды, некомплементарные матрице, удаляются с 3’-конца растущей цепи ДНК перед включением следующего нуклеотида в строящуюся цепь ДНК. Наличие у ДНК-полимеразных комплексов такой активности существенно повышает точность функционирования систем репликации.

Мутагенные воздействия. Усилий систем репликации становится недостаточно в стрессовых ситуациях, когда организм подвергается массированному мутагенному воздействию. Однако даже присутствие незначительного количества мутагенов в окружающей среде вызывает непрерывное накопление мутаций в геноме соматических клеток, хотя и с небольшой скоростью. Процесс накопления мутаций, избежавших коррекции системами репарации, является кумулятивным – к ранее существовавшим мутациям неуклонно добавляются новые, и суммарное количество мутаций в геноме (генетический груз) возрастает. Процесс накопления мутаций – статистический, поэтому в настоящее время можно предсказывать лишь вероятность возникновения конкретной мутации в генетическом локусе или геноме организма. Поскольку мутации часто являются причиной наследственных и приобретенных заболеваний, важно делать статистический прогноз частоты возникновения определенных заболеваний в популяциях, для которых известна мутагенная экологическая обстановка.

Ионизирующее излучение. Ярко выраженным мутагенным действием обладают коротковолновое электромагнитное излучение (УФ-свет, рентгеновские лучи), а также элементарные частицы, образующиеся в процессе радиоактивного распада вещества. С помощью рентгеновского излучения Г. Меллером в 1927 г. впервые были получены мутации у дрозофилы. С тех пор исследования механизмов мутагенеза проводятся все интенсивнее и в широких масштабах.

Электромагнитное излучение, проходящее через вещество, или элементарные частицы передают свою энергию атомам. В результате первичного столкновения с квантами излучения или частицами из атома, который превращается в положительно заряженный ион, выбиваются электроны. Освобожденные электроны вторично вызывают образование пар ионов при перемещении до тех пор, пока их энергия не иссякнет и они не утратят свою ионизирующую способность. Единицей дозы излучения служит рентген (Р) – количество излучения, которое вызывает образование 2·10⁹ пар ионов/см³ воздуха. На практике часто пользуются единицей рад, служащей мерой поглощения энергии; в воздухе 1 Р эквивалентен 0,876 рад. Для объяснения механизмов возникновения мутаций под действием ионизирующего излучения была применена ранее разработанная теория мишени, в соответствии с которой повреждение ДНК наблюдается в том месте, где имеет место первичная ионизация. Реакция происходит внутри дискретного объема, являющегося мишенью. Повреждения ДНК возникают как вследствие прямого попадания кванта излучения или элементарной частицы в молекулу, так и в результате вторичного действия иона, образовавшегося за пределами ДНК в некоем "чувствительном объеме". Установлено, что частота мутаций, возникающих у дрозофилы и других объектов, прямо пропорциональна дозе облучения. Определенная доза облучения вызывает одинаковое число мутаций как при однократном, так и при дробном облучении небольшими порциями.

Химические мутагены экзогенного происхождения. Многие химические соединения, встречающиеся в окружающей среде, обладают способностью взаимодействовать с ДНК или с ее низкомолекулярными предшественниками и вызывать мутации. При этом одни химические соединения изначально являются реакционноспособными мутагенами, непосредственно соединяющимися с ДНК и изменяющими ее химическую структуру, а другие, так называемые промутагены, для превращения в мутагены сначала претерпевают метаболическую активацию под действием ферментативных систем организма.

Одним из наиболее обширных классов химических мутагенов экзогенного происхождения являются алкилирующие агенты, под действием которых происходит спонтанный (без участия ферментативных систем организма) перенос алкильных групп этих химических соединений на биологические макромолекулы, в том числе и ДНК. В табл. I.18 представлены основные классы алкилирующих агентов. В структурах химических соединений, приведенных в таблице, можно выявить различия по двум признакам, роль которых в мутагенной активности алкилирующих агентов была неоднократно подтверждена экспериментально. Один из признаков относится к типу переносимых алкильных групп: метильной, этильной или более сложной. Другой отличительный признак – число алкильных групп, которые отдает одна молекула алкилирующего агента. Это свойство называется функциональностью соединения. Так, среди азотистых ипритов H₂NCH₂CH₂Cl – монофункционален, HN(CH₂CH₂Cl)₂ – бифункционален, а N(CH₂CH₂Cl)₃ – трифункционален.

Главным источником мутаций, возникающих под действием алкилирующих агентов, является алкилирование O-6 в гуанине и O-4 в тимине ДНК. Другими сайтами, алкилирование которых реже приводит к мутациям, могут быть N-3 гуанина, N-1, N-3 и N-7 аденина, N-3 цитозина, а также N-3 и N-4 тимина. При этом спектр мутаций, возникающих под действием любого алкилирующего агента, как правило, специфичен. Следует отметить, что благодаря функционированию репаративных систем клетки к возникновению мутаций приводит лишь небольшая часть алкилирований ДНК. Поэтому частота реакций между алкилирующим агентом и ДНК не связана простой зависимостью с их мутагенной активностью. То же самое относится не только к алкилирующим агентам, но и к другим мутагенам.

Таблица I.18

Основные классы алкилирующих агентов

Класс	Представитель	Структурная формула
Иприты сернистые	Иприт	S(CH2CH2Cl)2
азотистые	Азотистый иприт	HN(CH2CH2Cl)2
Эпоксиды	Этиленоксид
Этиленимины	Этиленимин Триэтиленмеламин
Алкилалкансульфонаты	Этилметансульфонат	C2H5OSO2CH3
	Метилметансульфонат	CH3OSO2CH3
-Лактоны	-Пропиолактон
Диазосоединения	Диазометан	CH2N ═ N
Нитрозосоединения	N-Нитрозо-N-метилуретан Диэтилнитрозамин N-Метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин	CH3N(NO)C(=NH)NHNO2

Алкилирование является одной из возможных химических модификаций нуклеотидов ДНК in vivoпод действием экзогенных мутагенов. Число известных химических веществ, способных вызывать модификации нуклеотидов ДНК по другим механизмам, быстро возрастает с расширением исследований в этой области. Среди таких мутагенов следует упомянуть азотистую кислоту, которая образуется из нитритов (NaNO₂ и KNO₂) в водных растворах при низких значениях pH. Азотистая кислота дезаминирует гуанин до ксантина, аденин до гипоксантина, а цитозин до урацила. В ДНК спаривание урацила с аденином приводит к транзициям GCAT, гипоксантин вызывает обратную транзицию ATGC, ксантин же не спаривается ни с одним из пиримидинов ДНК, и его включение оказывается летальным для клетки. Мутагенным действием обладают различные органические перекиси. Сама перекись водорода не оказывает мутагенного эффекта, но становится сильным мутагеном в сочетании с формальдегидом или ацетоном, у которых индуцирует образование свободных радикалов. Азид натрия – мощный ингибитор дыхания, также в ряде случаев обладает мутагенным действием, что связывают с накоплением в процессе метаболизма мутагенных перекисей. Перекиси индуцируют мутации и разрывы хромосом, имитируя мутагенное действие рентгеновских лучей, которые индуцируют образование различных реакционноспособных радикалов. И, наконец, среди химических мутагенов необходимо упомянуть аналоги нуклеозидов и оснований: 5-бромдезоксиуридин и 2-аминопурин, являющиеся сильными мутагенами.Спаривание с аденином 5-бромдезоксиуридина, обычно включающегося в ДНК вместо цитозина, приводит к образованию транзиций GCAT. Обратные транзиции ATGC возникают под действием 2-аминопурина.

Красители, обладающие способностью интеркалировать между основаниями ДНК, вызывают мутации со сдвигом рамки считывания. К таким красителям, в частности относятся хорошо известные бромистый этидий и производные акридина.

Промутагены, проканцерогены и их метаболическая активация. Рассмотренные выше химические соединения изначально обладают мутагенной активностью и для ее проявления не требуют каких-либо дополнительных модификаций. Однако существует множество химических соединений, которые сами по себе не проявляют мутагенную активность, но приобретают ее после серии биохимических превращений внутри организма под действием его ферментных систем. Такие химические соединения получили название промутагенов, а процесс их ферментативного превращения в мутагены – метаболической активации.

Любой организм в течение жизни подвергается непрерывной атаке экзогенными чужеродными химическими соединениями – ксенобиотиками, для защиты от накопления которых у него имеются эффективные ферментативные механизмы. Процесс метаболизма ксенобиотиков в организме традиционно разделяют на две фазы. Поскольку многие опасные для здоровья ксенобиотики гидрофобны и имеют тенденцию к накоплению в липидах клеточных мембран, обе фазы их внутриклеточного метаболизма связаны, прежде всего, с введением в их молекулы гидрофильных химических групп. Последующее повышение растворимости этих соединений в биологических жидкостях облегчает их выведение из организма. Таким образом, во время первой фазы метаболизма ксенобиотиков происходит ферментативное введение в их молекулы небольших полярных групп (например гидроксильных), что делает молекулы ксенобиотиков более водорастворимыми. С другой стороны, такие реакции подготавливают молекулы ксенобиотиков для вступления во вторую фазу метаболизма, во время которой происходит конъюгация преобразованных в первой фазе молекул ксенобиотиков с еще более полярными химическими группировками, в частности с остатками глюкуроновой кислоты, сульфатов или глицина.

Среди ферментов, принимающих участие в первой фазе метаболизма ксенобиотиков, наиболее хорошо изученными являются цитохромы группы Р-450. Эти ферменты в организме представлены большим числом (>20) изоформ, каждая из которых, как правило, обладает широкой субстратной специфичностью, а все вместе они способны метаболизировать множество экзогенных и эндогенных химических соединений. Обобщенное уравнение химической реакции, осуществляемой цитохромами Р-450, представлено ниже:
S + NAD(P)H + O₂  SO +NAD(P)⁺ + H₂O,
где S – молекула субстрата, а SO – ее окисленная форма. Таким образом, для окисления субстрата цитохром Р-450 чаще всего использует электроны свободного кислорода, поступление которых к ферменту опосредовано NAD(P)H и флавопротеиновой редуктазой. Молекулы цитохрома Р-450 интегрированы в мембраны и при гомогенизации клеток ассоциированы с фракцией микросом. На рис. I.53 представлен механизм метаболической активации 1,2-бензпирена (БП) – одного из наиболее сильных проканцерогенов. БП широко распространен в окружающей среде и в больших количествах образуется при горении нефтепродуктов, табака, а также при других термических воздействиях на органические соединения. Метаболические превращения БП по эпоксид-диольному пути начинаются с его эпоксидирования в положении 7,8 определенной изоформой цитохрома Р-450, ассоциированной с мембранами микросом. Полученный эпоксид гидролизуется эпоксидгидролазой в соответствующий диол БП. Далее под действием другой изоформы цитохрома Р-450 происходит образование предпочтительно двух диастереомеров эпоксида в положении 9,10 и других минорных производных (соединения в фигурных скобках, см. рис. I.53). Оказалось, что изомер (+)-анти-БПДЭ как in vitro, так и in vivo нестабилен и ковалентно связывается преимущественно с N2-атомом дезоксигуанозина ДНК своим С10-атомом с образованием аддуктов БПДЭ-ДНК.



Рис. I.53. Механизм метаболической активации 1,2-бензопирена (БП) микросомами животных

БПДЭ – 9,10-эпоксид-1,2-бензопирен-7,8-дигидродиола, Р-450 – цитохром Р-450, ЭГ – эпоксидгидролаза
Механизм метаболической активации БП подробно рассмотрен здесь для иллюстрации общих принципов химического мутагенеза. Метаболическая активация ксенобиотиков с образованием реакционноспособных метаболитов является одной из основных причин генотоксичности множества химических соединений окружающей среды, с которыми организм контактирует на протяжении всей жизни. Список химических мутагенов экзогенного происхождения далеко не исчерпывается перечисленными химическими соединениями. По мере углубления исследований число известных мутагенов непрерывно растет благодаря созданию высокочувствительных методов оценки мутагенной активности. Известно, что почти все мутагены одновременно являются канцерогенами – веществами, вызывающими возникновение злокачественных опухолей, хотя обратное утверждение не всегда верно. Все это объясняет необходимость сохранения чистоты среды обитания человека, животных и растений.

Эндогенные мутагены.Выше уже упоминалось, что молекулы ДНК часто претерпевают in vivoтепловую депуринизацию, которая может быть спонтанным внутренним источником измененных нуклеотидов. Другим источником эндогенных мутаций служит самопроизвольное дезаминирование цитозина в составе ДНК с образованием урацила. 5-Метилцитозин – одно из модифицированных оснований ДНК, представляет собой "горячую точку" возникновения мутаций путем спонтанного дезаминирования, так как в результате удаления его аминогруппы образуется нормальное основание T, не распознаваемое системами репарации как мутантное.

К сожалению, не только окружающая среда может быть источником генотоксических химических соединений, отравляющих жизнь организма и нарушающих функционирование его генома. Свободные радикалы, которые образуются в организме во время нормального метаболизма, могут быть дополнительной и существенной причиной спонтанных мутаций. В частности, частота повреждений нуклеотидов ДНК, появляющихся под действием свободных радикалов кислорода, приближается к частоте мутаций, возникающих при депуринизации ДНК. В клетках свободные радикалы кислорода возникают в реакциях восстановления, в результате которых появляются чрезвычайно реакционноспособные промежуточные соединения. Наибольшую опасность для ДНК представляют радикалы гидроксила, супероксид и синглетный кислород, которые образуются в процессе дыхания, фагоцитоза и при повреждении клеток. Путем измерения содержания в моче человека 8-гидроксидезоксигуанозина и тимингликоля – основных модифицированных нуклеозидов и оснований, образующихся под действием радикалов кислорода, было установлено, что ежедневно в каждой клетке человека возникает 10000 таких модифицированных нуклеотидов, мутагенный эффект которых в настоящее время доказан.

Другим источником эндогенных мутагенов в организме является метаболизм нормальной микрофлоры. Некоторые промежуточные соединения, возникающие при метаболизме аминокислот, желчных кислот и холестерина под действием бактерий организма человека и обладающие мутагенной и канцерогенной активностью, представлены в табл. I.19. Промоторами в канцерогенезе называют вещества, не имеющие канцерогенной активности, но ускоряющие процесс канцерогенеза под действием химических веществ – истинных канцерогенов. Как видно из таблицы, достаточно широк список веществ, обладающих всеми вышеупомянутыми активностями и образующихся под действием нормальной микрофлоры человека, обитающей, в частности в его кишечнике и на слизистых оболочках. Помимо этого в результате метаболизма в бактериальных клетках происходит активация нитратов с образованием мутагенных и канцерогенных N-нитрозаминов в кишечнике, желудке и ротовой полости человека. Описан также гидролиз обезвреженных ферментами детоксикации конъюгатов истинных канцерогенов.

Таким образом, многочисленные мутагены экзогенного и эндогенного происхождения создают вокруг и внутри любого многоклеточного организма тот мутагенный фон, к которому он вынужден приспосабливаться в процессе эволюции. Мутагенный фон "среды обитания" информационных макромолекул и, прежде всего, ДНК уникален для каждого вида живых организмов в силу особенностей их метаболизма и условий жизни. В соответствии с этим каждый биологический вид для того чтобы выжить, т.е. понизить частоту мутаций в конкретных генах до приемлемого уровня, обладает системами защиты от мутаций определенной эффективности. О механизмах функционирования таких систем защиты генетической информации речь пойдет ниже. А пока рассмотрим некоторые методы определения мутагенной активности химических соединений, применяемые для мониторинга окружающей среды.
Таблица I.19

Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями

Соединение	Метаболит	Тип активности
Метионин	Этионин	К
Тирозин	Фенол p-Крезол 4-Этилфенол	П П П
Триптофан	Индол Индолилуксусная кислота 3-Гидроксикинуренин 3-Гидроксиантраниловая кислота 8-Гидроксихинальдиковая кислота Хинальдиковая кислота Ксантуреновая кислота	П П П, М П, М П П П
Желчные кислоты	Дезоксихолиевая кислота Литохолиевая кислота бис-Нор-5-холеновая кислота Апохолиевая кислота	М, П П К К
Холестерин	Эпоксиды метаболитов: 5-холестерин-3-ола, 5-холестерин-3-она, 4-холестерин-3-она и др.	М, К
Примечание. К – канцероген, П – промотор, М – мутаген.

Методы определения мутагенной активности химических соединений. В результате интенсивного исследования мутагенеза было разработано несколько чувствительных методов, позволяющих с высокой эффективностью выявлять мутагенную активность химических соединений. В основном используются два подхода к определению мутагенов. При одном из них модельные организмы (бактерии или соматические клетки) выращивают в присутствии тестируемых веществ и количественно оценивают интенсивность образования клеток с мутантным фенотипом. Другая группа методов основана на прямом определении аддуктов мутагенов с макромолекулами с помощью высокоэффективной жидкостной или газовой хроматографии, а также масс-спектрометрии. Рассмотрим принципы двух биологических методов, часто используемых для определения мутагенной активности разнообразных веществ.

Тест Эймса. Благодаря своей простоте и высокой эффективности он применяется наиболее широко. Принцип метода основан на том, что мутантные бактериальные клетки, ауксотрофы по какому-либо метаболиту, выращивают в присутствии исследуемого вещества. Ауксотрофными называют мутантные бактериальные или иные клетки, неспособные расти на минимальной питательной среде без добавок метаболита, биосинтез которого нарушен в результате мутации. В классическом тесте Эймса чаще всего используют клетки Salmonella typhimurium, ауксотрофные по аминокислотам (в частности Trp), ауксотрофность которых возникает в результате единственной точковой мутации. Суспензию бактерий инкубируют в присутствии исследуемого вещества и высевают на твердую питательную среду, содержащую минимальное количество вещества, по которому бактерии ауксотрофны. Вещества должно быть достаточно для того, чтобы клетки смогли совершить несколько делений, не образовав видимых колоний. При этом образующиеся мутации фиксируются в геноме бактерий. В том случае, когда возникают реверсии в локусе, определяющем их ауксотрофность, такие бактерии приобретают способность расти без вышеупомянутых добавок на твердых питательных средах, образуя видимые колонии. Таким образом, если испытуемое вещество обладает мутагенным действием, эффективность образования ревертантов в его присутствии будет значительно выше, чем без него, что проявляется в виде множества бактериальных колоний, вырастающих на твердой питательной среде в отсутствие пищевой добавки. Имеется большое количество модификаций теста Эймса. Наиболее важной является использование микросомных фракций печени грызунов для активации промутагенов, которые не обладают мутагенной активностью, но приобретают ее после метаболической активации в организме животных. Микросомные фракции печени содержат все основные ферменты метаболической активации ксенобиотиков, поэтому, если испытуемое вещество обладает промутагенной активностью, оно активируется ферментами микросом in vitro, и такой результат легко выявляется в тесте Эймса.

Сестринские хроматидные обмены (СХО). Генотоксическое действие химических веществ in vivo часто сопровождается дестабилизацией генома и его перестройками. Если контакт с мутагенами приводит к образованию разрывов ДНК, в процессе их репарации наблюдают обмены гомологичными участками сестринских хроматид в интерфазных ядрах, частота которых является мерой мутагенного воздействия на клетки. Разработаны эффективные методы, позволяющие обнаруживать СХО в соматических клетках животных и растений. Эти клетки (обычно лимфоциты периферической крови) инкубируют in vitroв присутствии 5-бромдезоксиуридина, который включается в их ДНК вместо тимидина на протяжении двух клеточных циклов. При этом одна из хроматид в хромосомах включает аналог нуклеозида в обе цепи ДНК, тогда как другая – только в одну. Флуоресцентный краситель по-разному взаимодействует с такими гомологичными хроматидами, что выявляется с помощью обычного микроскопа по различной интенсивности их окраски – одна из гомологичных хроматид выглядит светлее другой. При наличии СХО светлые и темные участки в хроматидах индивидуальных хромосом чередуются, и число таких перемежающихся участков является мерой частоты СХО. Чем выше СХО, тем интенсивнее было предшествующее мутагенное воздействие на соматическую клетку. В отличие от теста Эймса определение СХО может быть использовано для ретроспективной оценки мутагенного воздействия на организм человека и животных, поскольку СХО продолжаются некоторое время после инициирующего действия мутагена уже в его отсутствие, например после устранения источника ионизирующего излучения или полной детоксикации ксенобиотика.