Регуляция экспрессии генов на уровне уже синтезированной РНК играет исключительно важную роль в онтогенезе многоклеточных и особенно высших организмов. Среди различных способов посттранскрипционной регуляции наибольшее значение имеют механизмы внутриклеточной локализации и депонирования РНК с последующим специфическим вовлечением ее в трансляцию, а также разные формы процессинга предшественников мРНК, избирательной деградации мРНК и ее ковалентных посттранскрипционных модификаций.
3.3.1.Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРНК
По завершении регулируемого синтеза РНК в процессе транскрипции она должна быть доставлена к месту трансляции, где сценарий координированной экспрессии генов получает свое дальнейшее развитие. При этом многие виды мРНК оказываются асимметрично распределенными в цитоплазме родительских клеток, пролиферация которых сопровождается избирательным попаданием (доставкой) мРНК в дочерние клетки. В итоге на ранних стадиях эмбриогенеза в зиготе и дочерних клетках происходит образование набора белков без соответствующей транскрипции их собственных генов, что обеспечивает их дальнейшую дифференцировку. Такой тип регуляции экспрессии генов через асимметричное распределение их РНК в цитоплазме играет исключительно важную роль в оогенезе животных, завершаемом образованием зрелых яйцеклеток.
Структура и образование комплекса ооцит–питающие клетки у дрозофилы. Каждый из двух симметрично расположенных яичников дрозофилы содержит 16 овариол, в передней части каждой из которых находится гермарий. В гермарии происходит асимметричное деление стволовых клеток, сопровождаемое воспроизводством стволовых и образованием коммитированных клеток, называемых цистобластами. Каждый цистобласт делится четыре раза с образованием 16 цистоцитов – группы клеток, связанных друг с другом цитоплазматическими мостиками, которые проходят через специализированные, связанные с цитоскелетом структуры, называемые кольцевыми каналами (ring canals). Лишь один из 16 цистоцитов становится ооцитом, остальные 15 – питающими клетками (nurse cells). Каждая из 16-клеточных зародышевых цист окружена соматическими фолликулярными клетками, что образует яйцевую камеру (1-я стадия развития). Задние части овариол составлены серией яйцевых камер, возраст которых уменьшается по мере удаления от оси тела насекомого. Наиболее удаленные от оси яйцевые камеры находятся в стадии развития 1, а ближайшие к оси – на конечной, 14-й, стадии развития. Для созревания яйцеклетки в яйцевой камере требуется три дня. В это время питающие клетки синтезируют большое количество РНК и белков, которые переносятся в созревающий ооцит. Большинство этих молекул бывают необходимы в первые два часа эмбрионального развития дрозофилы, до начала транскрипции в зиготе.
Выбор клетки, которая становится ооцитом среди 16 цистоцитов, не происходит случайно. Лишь две из 16 клеток связаны кольцевыми каналами с четырьмя другими, и одна из этих двух клеток всегда дифференцируется в ооцит. Большая цитоплазматическая структура, названная фьюсомой (fusome), в формировании которой участвует несколько белков цитоскелета, проходит через кольцевые каналы, объединяющие цистоциты, и участвует в детерминации ооцита. Единственный в 16-клеточном комплексе центр, организующий микротрубочки (microtubule organizing center – MTOC), расположен в проооците. MTOC объединяет нити микротрубочек, исходящих из всех 15 питающих клеток, которые проходят через кольцевые каналы. Поскольку в MTOC сходятся минус-концы микротрубочек, основанный на микротрубочках цитоскелет 16-клеточной конструкции структурно поляризован. Такая направленность микротрубочек играет ключевую роль в упорядоченном транспорте РНК из питающих клеток в созревающий ооцит и специфическом распределении РНК в самом ооците, а следовательно, лежит в основе регулируемой экспрессии генов развивающегося организма.
Этот краткий экскурс в дифференцировку клеток зародышевой линии насекомого был предпринят, в частности для того, чтобы продемонстрировать, насколько самонадеянными являются попытки объяснения живого организма исключительно на молекулярном уровне. Если на заре молекулярной генетики (а именно эта часть дня сейчас за окнами лабораторий) такой подход оказывается плодотворным при изучении механизмов регуляции экспрессии генов у бактериофагов, то он явно не срабатывает в случае многоклеточных организмов. Смещение интересов современных генетиков от индивидуальных генов к организации целых геномов и геномике в силу большой сложности проблемы пока еще лишь намечается. И дело разворачивается медленно не только из-за сложности объекта, но скорее из-за очевидности альтернативного пути. Новых неизвестных генов, так же, как и новых видов насекомых, хватит еще не на одно поколение биологов. Однако для понимания организма как целого неизбежен переход к исследованию функционирования больших надмолекулярных комплексов, клеток и клеточных ансамблей.
Упорядоченное распределение РНК в ооцитах и ранних эмбрионах дрозофилы. Большинство РНК, которые позднее локализуются в растущем ооците, первоначально синтезируются во всех 16 клетках зародышевой линии. При этом временные различия аккумуляции РНК в ооцитах коррелируют с различиями в начале их синтеза, но не с различиями механизмов внутриклеточного и межклеточного транспорта.
Правильную локализацию РНК в ооците во многом обеспечивают микротрубочки его цитоскелета. Например, мутация в гене homeless, сопровождающаяся образованием ооцитов с двумя передними полюсами, приводит на стадии 7 к перемещению минус-концов микротрубочек к обоим полюсам, а их плюс-концов – в центр клетки. Это имеет следствием перераспределение РНК внутри мутантных ооцитов. РНК bicoid накапливается на обоих полюсах ооцитов, а РНК oskar – в центре клетки.
По мере созревания ооцита (стадии 7–8) могут происходить упорядоченные внутриклеточные перемещения импортированной РНК, например между его полюсами. На заключительных стадиях созревания (10–14) питающие клетки усиливают синтез РНК и их перенос в ооциты на фоне перетекания ооплазмы, что сопровождается их специфическим внутриклеточным распределением.
Активация ооцитов после оплодотворения сопряжена с упорядоченными перестройками цитоскелета. Ядра зиготы дрозофилы претерпевают 13 синхронных делений без цитокинеза, образуя зародыш с несколькими тысячами ядер, окруженными общей цитоплазмой. Такой синцитий существует до конца 14-го клеточного цикла, в котором
6000 ядер локализованы вблизи оболочки – кортекса. Затем впячивания мембраны формируют индивидуальные клетки бластодермы, в которой переднезадняя и дорсовентральная полярность положения клеток уже определена, и они содержат требуемые для дальнейшего развития материнские РНК. На стадии синцития и клеточной бластодермы начинается основной зиготный синтез РНК.
Механизмы регулируемой локализации РНК в клетках животных. Механизмы, обеспечивающие специфическую локализацию РНК в клетках многоклеточных организмов, весьма разнообразны. Прежде всего, после завершения синтеза РНК имеет место ее направленная доставка из ядра в цитоплазму к месту хранения или трансляции. Однако часть внутриклеточных РНК не синтезируется в ядрах этих клеток, а экспортируется в цитоплазму из митохондрий или соседних клеток другой специализации. Кроме того, специальные механизмы контролируют направленное перемещение РНК в цитоплазме и ее избирательную деградацию.
Направленный ядерно-цитоплазматический транспорт РНК. Одним из самых ранних посттранскрипционных событий, связанных с их направленной доставкой к месту внутриклеточной локализации и трансляции, является векторизованный экспорт РНК из ядра в цитоплазму. Несмотря на то что наличие механизма направленного переноса синтезированной РНК из одной части ядра к другой с последующим упорядоченным выходом в цитоплазму кажется очевидным, имеется мало экспериментальных свидетельств этому явлению. Большинство экспериментальных данных такого рода относится к ранним эмбрионам дрозофилы. В частности, направленный перенос продемонстрирован для транскриптов генов hairy и fushi tarazu в эмбрионах на стадии бластодермы, а также для мРНК гена gurken, которая на стадии 8 ооцитов в их цитоплазме располагается по отношению к ядру строго упорядоченно. Помимо всего прочего, результаты этих экспериментов позволили предположить, что ядра как таковые обладают собственной полярностью, независимой от цитоплазматического цитоскелета.
Перенос РНК из клеток одного типа в клетки другого типа. Второй класс механизмов направленной доставки мРНК впервые обнаружен во время оогенеза дрозофилы. В этом случае РНК, синтезированная в питающих клетках, переносится в ооциты по кольцевым каналам. Питающие клетки связаны только с передними полюсами ооцитов, и часть поступающих из них РНК (например bicoid) специфически удерживается после их вхождения и остается в этой зоне ооцитов. У мутантов дрозофилы, для которых характерно взаимодействие питающих клеток с передним и задним полюсами ооцита, транскрипты гена bicoid локализованы на обоих полюсах ооцитов. В отличие от РНК, которые удерживаются на переднем полюсе ооцитов, другие РНК, преимущественно располагающиеся на заднем полюсе, активно переносятся внутри клетки к месту своей локализации. Такой перенос и внутриклеточная локализация транскриптов тесно связаны с цитоскелетом или обеспечиваются другими механизмами, например посредством их избирательной защиты от распада и деградации (подробнее см. ниже).
Импорт РНК из митохондрий. Цитоплазма заднего полюса ооцитов дрозофилы содержит большие, не связанные с клеточными мембранами органеллы – полярные гранулы, которые участвуют в образовании и дифференцировке клеток зародышевой линии. С полярными гранулами тесно ассоциированы митохондрии, осуществляющие экспорт в эти органеллы большой митохондриальной 16S рРНК, которая кодируется митохондриальным геномом. Функции этой РНК в ооците не ясны. Полагают, что она требуется для образования клеток переднего полюса.
Массовая деградация РНК, сопряженная с ее локальной защитой. Гетерогенное внутриклеточное распределение и депонирование РНК могут достигаться за счет ее избирательной защиты от деградации. Например, материнские транскрипты генов nanos, cyclin B и Hsp83 концентрируются в плазме переднего полюса ранних эмбрионов дрозофилы, однако часть РНК остается нелокализованной. РНК переднего полюса переходит в отпочковывающиеся клетки во время дробления ооцита, тогда как остающаяся РНК деградирует. Избирательную защиту РНК в плазме переднего полюса ооцитов обеспечивают вышеупомянутые полярные гранулы.
Другим примером избирательной дестабилизации и защиты мРНК является метаболизм материнской РНК гена PCNA в ооцитах асцидий. В цитоплазме этих ооцитов различают три основные зоны: центральную эктоплазму и периферийные участки, прилегающие к кортексу, между которыми находится миоплазма. Во время оогенеза не кодирующая белок РНК гена YC локализована вокруг ядра в перинуклеарном пространстве и постепенно переносится к кортексу. После оплодотворения эта РНК переходит в миоплазму и ассоциирует с цитоскелетом. 3'-Концевая последовательность YC-РНК комплементарна 3'UTR PCNA-РНК, а также 5'UTR РНК рибосомного белка L5. Вначале синтезируемая PCNA-РНК распределена равномерно в цитоплазме, однако постепенно миоплазма становится свободной от нее. Предполагают, что дестабилизация происходит в результате образования в миоплазме двухцепочечных YC-PCNA РНК-РНК-гибридов. В отличие от этого L5-РНК, несмотря на значительную гомологию с YC-РНК, не дестабилизируется, а накапливается в миоплазме. Истинные механизмы, лежащие в основе различий поведения этих двух транскриптов, остаются неизвестными.
Направленный транспорт РНК в цитоплазме. Многочисленные данные указывают на то, что направленный перенос РНК к специфическим внутриклеточным микрокомпартментам осуществляется при участии и микротрубочек, и микрофиламентов цитоскелета эукариотических клеток. Такие выводы основаны, прежде всего, на результатах, полученных с использованием агентов, специфически нарушающих нормальное формирование частей цитоскелета, построенных из микротрубочек (колхицин, нокодазол, таксол) или микрофиламентов (цитохолазины). Информативными оказались и мутанты дрозофилы, и Sacharomyces с измененными компонентами цитоскелета.
Наиболее изученными в отношении механизмов транспорта являются транскрипты генов bicoid и oskar дрозофилы, первый из которых кодирует фактор транскрипции, а точные функции второго белка неизвестны. В процессе переноса от питающих клеток к месту своей окончательной локализации – переднему полюсу ооцита – РНК bicoid претерпевает несколько стадий ассоциации–диссоциации с компонентами цитоскелета. Внутриклеточный перенос РНК в питающих клетках к кольцевым каналам осуществляется с участием минус-концевого мотора микротрубочек, так как подавляется их деполимеризующими агентами (колхицин, тубулозол С, нокодазол). Перемещение РНК через кольцевые каналы в ооцит не зависит от цитоскелета, поскольку не подавляется ингибиторами образования микротрубочек и микрофиламентов актина. Во время ранних этапов накопления транскриптов гена bicoid в ооцитах они снова ассоциируют с цитоскелетом, переходя в детергент-нерастворимую фракцию. На стадиях 8–11 развития ооцита РНК локализуются у его передней границы в неассоциированном с цитоскелетом состоянии, однако на стадии 14 транскрипты bicoid сильно компактизуются в передней части ооцита, находясь в связанном с микротрубочками состоянии. Наконец, в ранних эмбрионах эта РНК больше не ассоциирована с кортексом и цитоскелетом.
Зависимый от цитоскелета направленный перенос РНК происходит не только в оогенезе. Внутриклеточная локализация многих РНК в нейронах млекопитающих также происходит при участии микротрубочек. Функционирование того же механизма с участием микрофиламентов актина было обнаружено и при специфическом переносе ASH1-РНК в почкующиеся клетки дрожжей S. cerevisiae, а также при мембранной локализации мРНК β-актина в различных соматических клетках животных (фибробластах, миобластах и т.п.).
Захват и фиксация РНК в сайтах внутриклеточной локализации. На стадии 10B оогенеза дрозофилы происходит перестройка микротрубочек цитоскелета ооцита, которые формируют параллельные ряды вблизи его поверхности в субкортикальной зоне. Это индуцирует начало упорядоченного движения ооплазмы (ooplasmic streaming), в которое вовлекаются и многочисленные молекулы мРНК, поступающие в ооцит из питающих клеток. В данном случае РНК, которые специфически накапливаются в задней части ооцита, как бы отфильтровываются из потока ооплазмы путем захвата расположенными там специализированными структурами. Как следует из результатов генетического анализа, по крайней мере два белка Egalitarian и Bicaudal-D вовлечены в этот процесс. В опытах с РНК oskar было установлено, что если первый белок требуется для первоначального захвата РНК oskar , то Bicaudal-D не участвует в начальных этапах этого процесса, но необходим для последующего удержания в задней части ооцита. Полагают, что в норме оба белка взаимодействуют друг с другом.
В захвате и удержании РНК на заднем полюсе ооцита дрозофилы также участвуют полярные гранулы – уже упоминавшиеся большие рибонуклеопротеиновые органеллы, не ассоциированные с клеточными мембранами. Доставляемая к ним в потоке ооплазмы РНК часто находится в составе больших транспортных частиц в комплексе с белками. В частности, РНК bicoid, накапливающаяся на переднем полюсе ооцита, в составе транспортных частиц находится в комплексе с белком Exuperantia, тогда как РНК oskar переносится к заднему полюсу связанной с белком Staufen.
Локализующие последовательности РНК и транс-действующие факторы, участвующие в направленной доставке РНК к местам ее внутриклеточной локализации. Использование гибридных РНК, содержащих в своем составе изучаемые и маркерные последовательности, является основным подходом к исследованию механизмов направленной доставки РНК к местам ее внутриклеточной локализации. В качестве маркерной последовательности часто применяют 5'-концевой фрагмент мРНК β-галактозидазы E. coli, которую обнаруживают в клетках in situ с помощью соответствующих антисмысловых гибридизационных зондов. Делеции, которые приводят к делокализации изучаемых РНК, также позволяют находить последовательности, направляющие РНК в определенные зоны цитоплазмы. В случае дрозофилы внутриклеточное поведение гибридных и мутантных РНК чаще всего исследуют у трансгенных мух. Для введения РНК в клетки также используют прямые инъекции и трансфекцию плазмид, экспрессирующих соответствующие гены.
Для идентификации транс-действующих факторов и их генов в настоящее время применяют три подхода. Первый из них, основанный на получении мутаций, нарушающих внутриклеточную локализацию РНК, используют для дрозофилы и S. cerevisiae. После создания мутантов осуществляют поиск и клонирование мутантных генов. При втором подходе исследуют факторы, специфически взаимодействующие с изучаемыми РНК. Наконец, обнаружение белков или РНК со специфической внутриклеточной локализацией также открывает путь к исследованию их генов.
Цис-действующие локализующие последовательности РНК. Все цис-действующие локализующие последовательности, обнаруженные до настоящего времени, расположены в 3'UTR их РНК. По аналогии с сигнальными аминокислотными последовательностями белков, наличие таких нуклеотидных последовательностей часто оказывается достаточным для направленной внутриклеточной доставки соответствующих РНК.
Создание одиночных локализующих последовательностей может обеспечиваться альтернативным сплайсингом, механизм которого будет подробно рассмотрен в следующем разделе. Например, транскрипты гена Cyclin B дрозофилы процессируются по такому механизму. Короткая форма мРНК синтезируется преимущественно в раннем оогенезе. Она равномерно распределена в проооците до стадий 7–8. В отличие от этого более длинный транскрипт, содержащий дополнительную 3'-концевую последовательность длиной в 393 нуклеотида, в конце концов концентрируется в задней части ооцита и синтезируется в питающих клетках в позднем оогенезе (стадии 9–11). Эта же изоформа мРНК накапливается в перинуклеарном пространстве зародышей на стадии синцития.
В ряде случаев направленный транспорт мРНК (например bicoid) обеспечивается несколькими дискретными последовательностями, расположенными в 3'UTR. У этой мРНК локализующий элемент BLE1 (bicoid localization element) длиной в 50 нуклеотидов является необходимым и достаточным для направленного транспорта мРНК, если он присутствует в виде двух копий. С такой двойной последовательностью взаимодействует белок Staufen, специфичный в отношении двухцепочечных РНК, который фиксирует РНК bicoid в передней зоне ооцита на поздних стадиях оогенеза. Этому способствуют и межмолекулярные взаимодействия РНК через их 3'UTR.
Кажущаяся функциональная избыточность характерна для регуляторных элементов ряда других РНК, содержащих несколько таких последовательностей, каждая из которых способна обеспечивать внутриклеточный транспорт РНК независимо от других. Примером такой РНК является транскрипт гена orb дрозофилы, который кодирует РНК-связывающий белок. Эта РНК начинает поступать в клетку на ранней стадии (1) развития ооцита и концентрируется сначала (стадии 2–7) на его переднем полюсе, а затем (стадии 8–10) на заднем. Такую направленную внутриклеточную доставку обеспечивает локализующий регуляторный элемент длиной в 280 нуклеотидов. Однако искусственное разделение данного элемента на два не инактивировало последовательность, хотя и снижало специфичность распределения РНК в цитоплазме.
Действие некоторых множественных локализующих элементов мРНК оказывается аддитивным. Иными словами, разные сочетания таких последовательностей 3'UTR обеспечивают различную специфичность накопления РНК в цитоплазме. Примерами таких транскриптов являются уже рассматриваемая выше мРНК bicoid, а также мРНК Add-hts (изоформа N4), кодирующая белковый компонент цитоскелета дрозофилы. В последнем случае 3'UTR мРНК содержит центральную локализующую последовательность ALE1 (Add-hts localization element 1) длиной 100–150 нуклеотидов, обеспечивающую накопление РНК вблизи поверхности ооцита на стадиях его созревания 7–8, и другую, необходимую для ее перемещения к передней части созревающего яйца на стадии 9, которая функционирует только в присутствии последовательности ALE1.
В ооцитах многие мРНК не транслируются до тех пор, пока они не доставлены к месту постоянной локализации. В частности, синтез белка, направляемый уже упоминавшейся мРНК oskar, регулируется по такому механизму. В норме трансляция этой мРНК начинается лишь после перемещения к заднему полюсу ооцита. Трансляция нелокализованной мРНК oskar сопровождается многочисленными дефектами развития зародыша насекомого. Контроль трансляции и локализация мРНК обеспечиваются разными последовательностями, расположенными в ее 3'UTR. В подавлении трансляции участвуют регуляторные элементы BRE (Bruno response elements), состоящие из трех дискретных сегментов A, B и C, взаимодействующих с белком-репрессором Bruno (молекулярная масса 80 кДа). Все эти сегменты обладают консервативной последовательностью длиной в 7–9 нуклеотидов: U(G/A)U(A/G)U(G/A)U, которые присутствуют в виде одной копии в сегментах A и B и представлены двумя копиями в сегменте C. Мутационные изменения этой последовательности нарушают взаимодействие с ними репрессора, а следовательно, и подавление трансляции мРНК oskar до завершения ее цитоплазматической локализации.
Транс-действующие белковые факторы. Уже упоминавшийся белок Staufen был обнаружен у мутантов дрозофилы с материнским типом наследования дефектов локализации мРНК bicoid и oskar в цитоплазме ранних эмбрионов. Этот белок связывает двухцепочечную РНК, а также взаимодействует с одноцепочечным участком структуры типа "стебель–петля" в 3'UTR мРНК bicoid, обеспечивая ее правильную локализацию в ооплазме. Те же функции белок Staufen выполняет и в нейробластах, взаимодействуя в позднем эмбриогенезе с 3'UTR мРНК prospero, что необходимо для ее адекватной локализации в нейронах.
Белок Xsl дрозофилы с молекулярной массой 115 кДа взаимодействует с уже обсуждавшимися локализующими элементами BLE1, обеспечивая транспорт мРНК bicoid из питающих клеток и ее накопление в переднем полюсе ооцита. Этот белок выполняет свои функции как непосредственно связываясь с 3'UTR, так и обеспечивая роль посредника во взаимодействии белка Exuperantia с 3'UTR мРНК bicoid в локализующих РНП-частицах. Аллель exuperantia был получен вместе с аллелем staufen. Одновременное присутствие этих аллелей в геноме мутантных мух вначале обнаруживается по нарушению распределения РНК в питающих клетках. Белок Exuperantia накапливается в большом количестве вблизи оболочки передней части ооцита между стадиями 8 и 10. Его мутационные повреждения приводят к нарушению внутриклеточной локализации РНК bicoid в передней части ооцита и к прекращению ассоциации с микротрубочками цитоскелета. Поскольку в норме белок Exuperantia отсутствует на поздних стадиях оогенеза или в ранних эмбрионах, полагают, что он необходим для установления локализованного состояния РНК bicoid, но не для его последующего поддержания. Этот белок переносится в ооциты из питающих клеток в составе больших РНП-частиц через кольцевые каналы.
В настоящее время с помощью генетических и молекулярных методов обнаружено более десяти других транс-действующих белковых факторов, участвующих во внутриклеточной локализации мРНК дрозофилы, и несколько факторов, функционирующих в других организмах. Хотя многие из них оказались гомологичны известным РНК-связывающим белкам, прямое взаимодействие с локализуемыми РНК было продемонстрировано лишь для небольшой их части. Большинство РНК, обладающих такими свойствами, содержат несколько дискретных цис-действующих локализующих последовательностей, с которыми, как полагают, взаимодействуют специфические транс-действующие факторы. Возможно, обнаруженные РНП-частицы, локализующие РНК, содержат в своем составе такие факторы, а также ряд других белков, обеспечивающих взаимодействие РНК с системами ее цитоплазматического транспорта и фиксации в местах постоянной локализации. Большую роль в этих процессах отводят и комплементарным РНК-РНК-взаимодействиям.
Функции локализованных РНК. Направленная доставка и накопление РНК в определенных частях эукариотических клеток являются мощным механизмом, регулирующим экспрессию соответствующих генов в онтогенетическом развитии организмов. Прежде всего, локализованные РНК обеспечивают высокий уровень синтеза кодируемых ими белков в определенных частях клеток. Одновременно с этим предотвращается трансляция этих мРНК в других внутриклеточных компартментах как путем их избирательной деградации, так и с участием белковых репрессоров трансляции. Локализуемые изоформы мРНК с разной специфичностью внутриклеточной доставки, которые могут образовываться в результате альтернативного сплайсинга, обеспечивают синтез соответствующих изоформ белков в разных клетках или цитоплазматических доменах одной и той же клетки. При этом асимметричное внутриклеточное распределение мРНК, в свою очередь, может приводить к неравномерному их распределению в дочерних клетках, получающих специфические наборы мРНК. Это может быть одним из ключевых моментов последующей дифференцировки клеток-потомков. Ряд РНК, локализующихся в цитоплазматических компартментах, не кодируют белки. Во многих случаях их роль не ясна. Полагают, что они могут выполнять структурные функции в локализующих РНП-частицах или органеллах, например зародышевых гранулах ооцитов. Кроме того эти РНК могут участвовать в фиксации локализуемых РНК в местах их накопления в цитоплазме.
От молекул ооцита дрозофилы к зародышу. Не все мРНК ооцита имеют своим источником питающие клетки. В частности, ген gurken, играющий ключевую роль в становлении переднезадней и дорсовентральной осей ооцита, транскрибируется в его ядре. Для этой РНК характерна строго выраженная внутриклеточная локализация. На стадии 7 она ассоциирована только с задним полюсом ооцита, на стадии 8 – с обоими полюсами, а на стадиях 8–10 – с переднеспинной зоной. Белок Gurken является секретируемым TGFα-подобным фактором роста, который передает ключевой сигнал к окружающим ооцит фолликулярным клеткам, которые обеспечивают становление осей ооцита. Сначала сигнал в виде секретируемого фактора поступает к фолликулярным клеткам, окружающим заднюю часть ооцита, что обеспечивается соответствующей локализацией мРНК gurken. Это приводит к становлению переднезадней оси ооцита и поляризации его цитоскелета, построенного из микротрубочек, что является важнейшим условием дальнейшей локализации РНК. Сигнал в виде вышеупомянутого фактора роста, поступающий из переднеспинной части ооцита к питающим клеткам, приводит к становлению дорсовентральной оси яйцевой камеры. Локализация мРНК gurken в переднеспинной части ооцита, в свою очередь, является следствием зависимого от цитоскелета перемещения ядра ооцита в эту зону цитоплазмы.
мРНК bicoid начинает транслироваться в месте ее локализации на переднем полюсе раннего зародыша вскоре после оплодотворения. Поскольку на этой стадии зародыш представляет собой бесклеточный синцитий с многими ядрами, образующийся белок диффундирует к заднему полюсу зародыша, образуя градиент концентрации вдоль его переднезадней оси, которая максимальна в его передней части. Белок Bicoid является гомеодоменным фактором транскрипции. Он активирует синтез РНК соответствующих генов только в ядрах, расположенных в передней половине зародыша. При этом активация генов зависит от концентрации фактора. Например, ген hunchback содержит высоко аффинный сайт связывания белка Bicoid и активируется как в местах высокой, так и низкой концентраций фактора. В отличие от этого, такие гены как orthodenticle и emptyspiracles обладают низкоаффинными сайтами связывания фактора и начинают транскрибироваться лишь в ядрах, расположенных ближе к переднему концу зародыша. По такому механизму формируются островки дифференцирующихся клеток передней части зародыша с разными группами экспрессирующихся генов. Однако это не все. Белок Bicoid обладает способностью функционировать не только как фактор транскрипции, но и как репрессор трансляции определенных РНК (например caudal), с 3'UTR которых он прямо взаимодействует. В результате передняя локализация мРНК bicoid приводит к образованию обратного градиента концентрации белка Caudal, РНК которого исходно не локализована. В итоге пик концентрации этого белка имеет место в задней части зародыша, где он также определяет наборы транскрибирующихся генов.
Приведенные примеры охватывают далеко не все механизмы, детерминирующие дифференцировку клеток в развивающемся зародыше, и служат для иллюстрации ключевой роли посттранскрипционной внутриклеточной локализации мРНК в контроле экспрессии генов, транскриптами которых они являются. Как можно видеть уже из этих примеров, посттранскрипционное перемещение и метаболизм РНК являются важными элементами регуляции экспрессии генов в онтогенезе. Ниже некоторые другие аспекты метаболизма РНК как регулятора экспрессии генов будут рассмотрены более подробно.
|
Скачать 5.83 Mb.