Рецензенты кандидат химических наук В. Г. Коробко доктор биологических наук В. А. Гвоздев Патрушев Л. И
 Скачать 5.83 Mb.
|
7.7.Стратегия выделения нового генаПосле обсуждения основных экспериментальных приемов, используемых в современной генной инженерии, становится ясно, каким образом можно решить одну из основных методических задач молекулярной генетики, а именно: выделить требуемый ген и заставить его работать в новых для него генетических условиях. Такая задача наиболее просто решается в случае бактериальных и вирусных генов, поскольку геном этих микроорганизмов невелик. Кроме того, бактериальные гены, как правило, не содержат интронов и даже гетерологичные бактериальные гены хорошо экспрессируются в клетках E. coli. Но и клонирование эукариотических генов в настоящее время представляется вполне посильной задачей. Приняв решение о клонировании какого-либо эукариотического гена, прежде всего необходимо ответить на вопрос: нужна ли экспрессия рекомбинантного гена в клетках микроорганизмов или же можно ограничиться исследованием его структуры? Очевидно, что в первом случае нужно думать о создании клонотеки безинтронных кДНК, а во втором – клонотеки геномной ДНК исследуемого объекта, что в ряде случаев технически менее сложно. Задача становится более трудной, если отсутствуют сведения о первичной структуре клонируемого гена. Тогда единственным источником получения частичной информации о последовательности его нуклеотидов может быть кодируемый этим геном белок. Определив последовательность нескольких N-концевых аминокислот белка, можно в соответствии с генетическим кодом синтезировать ряд олигонуклеотидных зондов, которые далее используют для скрининга клонотеки генов. В этом случае удобнее использовать экспрессирующую клонотеку кДНК, так как для получения необходимой информации нужно будет исследовать меньшее количество клонов. Действительно, в клонотеках кДНК отсутствует большинство некодирующих последовательностей нуклеотидов, суммарная длина которых может значительно (на два–три порядка) превышать таковую значимых последовательностей. Однако при использовании таких клонотек особенно остро встает вопрос об их репрезентативности, поскольку внутриклеточное содержание индивидуальных мРНК сильно различается в клетках разных тканей. После выделения рекомбинантной ДНК, гибридизующейся с упомянутыми выше олигонуклеотидными зондами, можно идентифицировать кодируемый кДНК белок после ее экспрессии с использованием специфических антител. Альтернативно: кодирующий потенциал клонированной кДНК определяют после ее гибридизации с суммарной мРНК, выделяя фракцию мРНК, задерживаемой иммобилизованной кДНК на носителе, с последующей трансляцией мРНК в бесклеточной белоксинтезирующей системе. Кроме того, если клонированная кДНК кодирует мРНК исследуемого белка, то они и в растворе образуют специфический ДНК-РНК-гибрид, и мРНК перестает участвовать в трансляции в бесклеточной системе (метод прерванной трансляции). Наличие или отсутствие белкового продукта бесклеточной трансляции легко обнаружить с помощью специфических антител. После проведения таких исследований можно точно идентифицировать клонированную кДНК и использовать ее в качестве зонда для выделения целого гена из клонотеки геномной ДНК. Одновременно возможна экспрессия клонированной кДНК в клетках микроорганизмов или в гомологичных эукариотических клетках. По-прежнему уникальной задачей, которая по плечу лишь большим международным коллективам, остается клонирование неизвестных генов животных и растений, функционирование которых можно заметить по сложным фенотипическим признакам, например симптомам системного наследственного заболевания. При выделении таких генов из генома человека работа начинается с проведения скрупулезного анализа сцепления исследуемого фенотипического признака и какого-либо полиморфного молекулярного маркера, например редкого аллеля HLA или минисателлитного локуса всех членов семьи больного. После обнаружения сцепленных маркеров задача сводится к клонированию крупных фрагментов ДНК, включающих эти маркеры, их секвенированию, выявлению открытых рамок считывания, в которых пытаются обнаружить мутации, отсутствующие у здоровых индивидуумов. В случае удачи дальнейшая работа может проводиться по одной из вышеприведенных схем и должна закончиться идентификацией гена и его белкового продукта. Примерно такой путь исследований в генной инженерии привел за последние 20 лет к клонированию множества генов, в том числе и неизвестных ранее, определению их структуры и особенностей функционирования. Аналогичные подходы легли в основу новых направлений молекулярной генетики. О некоторых из них речь пойдет ниже в других главах книги. Глава 8.НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ И БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯМногие мутации сопровождаются изменениями фенотипа мутантного организма на морфологическом или биохимическом уровне, хорошо различимыми визуально или с помощью биохимических методов. Такие мутационные изменения называют генетическими маркерами мутантного организма, так как они позволяют отличать мутанты от нормальных особей и прослеживать передачу мутантных генов в ряду поколений. Именно эта возможность следить за судьбой мутантных генов в потомстве, получаемом от скрещиваний родительских мутантных организмов, позволила в свое время создать мощное научное направление, называемое формальной генетикой, основанное на генетическом анализе наследования мутантных признаков. До развития генной инженерии гены исследовали преимущественно методами генетического анализа с использованием мутантных признаков организмов в качестве генетических маркеров. Это давало возможность определения границ генов и построения их подробных генетических карт. Именно потребности генетического анализа привели к быстрому развитию классических методов получения мутаций: чем больше имеется мутаций в определенном гене, тем более подробную генетическую карту такого гена можно построить. Классические методы получения мутаций в конкретных генах основаны на отборе мутантных организмов в селектируемых условиях (например по устойчивости к антибиотикам) из большого числа организмов дикого типа и мутантных организмов, несущих мутации в других генах. После получения искомого мутантного организма можно локализовать мутацию на генетической карте и биохимическими методами исследовать ее проявление на молекулярном уровне. Например, с использованием очищенного мутантного фермента можно определить молекулярные изменения, приводящие к формированию мутантного фенотипа. Этот традиционный подход, не забытый окончательно и сегодня, дал очень много для развития классической и молекулярной генетики. Однако из-за низкой эффективности и большой трудоемкости метода его было трудно использовать для исследования высших организмов. |