7.3.Клонотеки генов
Любой индивидуальный ген занимает лишь небольшую часть генома живого организма. В то же время размер генома даже наиболее просто организованных бактерий в среднем составляет 2•106 п.о., а суммарный размер молекул ДНК, составляющих гаплоидный геном человека, по крайней мере, на три порядка больше. Из этого следует, что уникальные гены, представленные в гаплоидном геноме только одной копией, затеряны среди других последовательностей генома, и для работы с индивидуальными рекомбинантными ДНК требуется очистка от ненужного генетического материала. Такая задача в генной инженерии решается через создание репрезентативных (представительных) клонотек последовательностей нуклеотидов ДНК или, иначе говоря, клонотек генов.
7.3.1.Получение клонотек генов
Клонотека генов представляет собой набор разных последовательностей нуклеотидов ДНК, клонированных в составе векторных молекул, которые в сумме составляют весь геном исследуемого организма или какую-либо известную его часть. При этом репрезентативная клонотека должна заключать в себе с высокой долей вероятности любую последовательность нуклеотидов изучаемого генома. Как уже подробно обсуждалось выше, для большинства генов эукариот характерна интрон-экзонная структура, а интроны, присутствующие в первичных транскриптах таких генов, вырезаются в процессе сплайсинга с образованием зрелых молекул мРНК. Для получения экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот, а также изучения тканеспецифической экспрессии генов возникает необходимость в получении кодирующих последовательностей эукариотических генов без интронов. В этом случае задача решается через создание репрезентативных клонотек кДНК, в которых с высокой вероятностью представлены последовательности нуклеотидов мРНК, синтезирующихся в тканях, культурах тканей или отдельных соматических клетках.
На рис. II.8 представлена схема конструирования клонотеки геномной ДНК с использованием космидного вектора. Следует иметь в виду, что общие принципы получения клонотек генов приложимы и к любым другим векторам. На первом этапе конструирования осуществляют подготовку вектора и клонируемой ДНК. Космидный вектор расщепляют рестриктазами BamHI и SmaI, причем рестриктаза SmaI расщепляет ДНК с образованием "тупых" концов. В результате образуются два "плеча" космидного вектора, содержащих область начала репликации ori, используемую системой репликации бактериальных клеток, и два селектируемых маркера, которые представляют собой гены устойчивости к антибиотикам – ампициллину (Ampr) и канамицину (Kanr), а также два cos-сайта хромосомы бактериофага . Параллельно со всеми необходимыми предосторожностями получают препараты высокомолекулярной ДНК, которую необходимо клонировать.
Геномную ДНК подвергают частичному гидролизу мелкощепящей рестриктазой MboI (узнает последовательность из четырех нуклеотидов GATC, которые комплементарны "липким" концам, образуемым рестриктазой BamHI). Время рестрикции и концентрацию фермента подбирают таким образом, чтобы средняя длина образующихся фрагментов ДНК составляла 35–45 т.п.о. Обогащенную фракцию фрагментов ДНК подобного размера далее получают центрифугированием смеси рестрикционных фрагментов в градиенте концентрации сахарозы и лигируют с приготовленными "плечами" вектора в условиях, при которых образование сшивок по "тупым" концам минимально. При этом, помимо требуемых молекул рекомбинантных ДНК, могут образовываться и артефактные молекулы, которые не будут упаковываться в фаговые частицы либо из-за их неоптимального размера, либо вследствие неправильной ориентации cos-сайтов.
Полученную после лигирования сложную смесь молекул рекомбинантных ДНК упаковывают в фаговые частицы стандартным способом, и образовавшимися фаговыми частицами заражают подходящие бактериальные клетки. В итоге колонии бактериальных клеток, которые выросли в присутствии антибиотиков, должны заключать в себе различные последовательности нуклеотидов клонируемой ДНК приблизительно одинаковой длины.
На этом частном примере был рассмотрен один из подходов к конструированию клонотеки геномной ДНК с использованием космидного вектора, который иллюстрирует все основные этапы получения клонотек генов с применением и других векторов, плазмидных или фаговых. Во всех случаях для получения репрезентативных клонотек генов следует помнить о необходимости случайной фрагментации клонируемой высокомолекулярной ДНК, с тем чтобы все участки генома в образующейся смеси фрагментов были представлены равновероятно. Кроме того, размеры образуемых фрагментов ДНК должны соответствовать емкости вектора, используемого для их клонирования. Так, для клонирования в космидах необходимо получать фрагменты ДНК длиной 35–45 т.п.о., тогда как для клонирования в фаговых векторах типа Charon и плазмидах эти размеры должны составлять соответственно 20–24 и 1,5–3,0 т.п.о.
Чем короче фрагменты, используемые для получения библиотек генов, и чем сложнее исследуемый геном, тем большее число клонов необходимо получить, чтобы клонотека была полной. Например, для того чтобы создать геномную клонотеку бактерий из фрагментов ДНК длиной в 20 т.п.о., в которой любая последовательность была бы представлена с вероятностью 99%, в ней необходимо иметь 460 клонов, тогда как для млекопитающих это число возрастает до 600000, а для покрытосеменных растений оно еще в
10 раз больше. Отсюда следует, что в случае получения репрезентативных клонотек генов бактерий для решения такой задачи вполне достаточно плазмидных векторов, несмотря на их небольшую емкость. В то же время использование плазмид для создания полных клонотек генов млекопитающих или растений совершенно бесперспективно, так как потребовало бы поддержания в клонотеке огромного количества клонов, многие из которых с большой вероятностью могут быть утрачены.
Выше были обсуждены условия, которые необходимо соблюдать для получения репрезентативных клонотек геномной ДНК. Однако во многих случаях не возникает необходимости работать с полными клонотеками генов, и исследователи ограничиваются неполными клонотеками, обогащенными отдельными участками генома. Так, клонотеки кДНК заключают в себе последовательности нуклеотидов, которые в виде зрелых мРНК специфически экспрессируются в различных клетках или тканях. То же можно сказать и о клонотеках повторяющихся последовательностей нуклеотидов, отобранных из препарата суммарной ДНК на основании кинетики их реассоциации.
После завершения лигирования векторных молекул с клонируемыми фрагментами ДНК реакционную смесь с продуктами реакции уже можно рассматривать как библиотеку генов. Полученные таким образом рекомбинантные молекулы ДНК хранятся длительное время в замороженном состоянии, и по мере необходимости из них отбирают аликвоты реакционной смеси, содержащие требуемое количество рекомбинантных молекул, и вводят в клетки микроорганизмов для клонирования и дальнейшей работы.
Процесс поглощения экзогенной ДНК бактериальными клетками, сопровождающийся приобретением ими новых генетических маркеров, называют генетической трансформацией. В том случае, если бактериальные клетки поглощают ДНК бактериофагов и в результате происходит образование зрелых фаговых частиц, говорят о трансфекции фаговой ДНК. Поглощение экзогенной ДНК в процессе трансформации и трансфекции может осуществляться лишь компетентными клетками. Под компетентностью понимается такое состояние бактериальных клеток, при котором они способны сорбировать экзогенную ДНК на своей поверхности и поглощать ее, после чего экзогенная ДНК может быть интегрирована в бактериальную хромосому или существовать в виде внехромосомного элемента (эписомы, плазмиды).
Для многих грамположительных бактерий компетентность является естественным свойством, которое становится максимально выраженным на определенных этапах роста культуры. В то же время у наиболее важных для генной инженерии грамотрицательных клеток E. coli естественная компетентность вообще отсутствует и клетки приобретают ее лишь в искусственных условиях. В настоящее время установлено, что при низких температурах и в присутствии двухвалентных катионов клетки E. coli и экзогенная ДНК продуктивно взаимодействуют друг с другом и экзогенная ДНК может с высокой эффективностью проникать внутрь бактериальных клеток. Частоту трансформации и трансфекции клеток E. coli можно повысить разными способами. Среди них наиболее популярными являются тепловой шок, введение в инкубационную смесь одновалентных катионов (Rb+), хлорида гексаминкобальта(III) или выращивание бактериальных клеток на среде с повышенным содержанием ионов Mg2+ (10–20 мМ).
Современные методики трансформации бактериальных клеток позволяют получать до 107–108 трансформантов или трансфектантов на 1 мкг суперскрученной плазмидной ДНК. Поскольку трансформация и трансфекция проводятся при низких концентрациях экзогенной ДНК, а для появления у трансформированной бактерии устойчивости к антибиотикам или развития фаговой бляшки достаточно проникновения внутрь бактериальной клетки одной молекулы рекомбинантной ДНК, образовавшиеся колонии или бляшки трансформантов и трансфектантов содержат, как правило, только один тип рекомбинантных молекул ДНК с идентичными вставками клонируемых последовательностей нуклеотидов.
Еще более высокой эффективности трансформации (до 109–1010 трансформантов на 1 мкг ДНК) достигают при использовании электропорации. В этом случае клетки вместе с плазмидной или фаговой ДНК помещают в небольшую ячейку между двумя электродами и подвергают кратковременному (10–100 мкс) воздействию электрического поля высокой напряженности. Быстрая поляризация клеточных мембран приводит к их обратимому повреждению (образованию пор), сопровождаемому повышением их проводимости и проницаемости для макромолекул. В это время происходит эффективный перенос экзогенных молекул ДНК внутрь клеток, подвергнутых электрическому шоку. После того как рекомбинантные молекулы ДНК введены в бактериальные клетки и получены бактериальные колонии или фаговые бляшки, каждая из которых содержит рекомбинантные ДНК только одного типа, возникает важная задача отбора тех колоний или бляшек, которые заключают в себе искомые последовательности нуклеотидов рекомбинантных ДНК.
7.3.3.Методы скрининга клонотек генов
Все методы получения из клонотек генов требуемых последовательностей нуклеотидов можно разделить на две группы. При использовании первой группы методов рекомбинантные бактерии или фаговые частицы исследуют на наличие в них искомых последовательностей нуклеотидов. Во втором случае присутствие этих последовательностей обнаруживают косвенно, по появлению в бактериальных клетках или фаговых лизатах продуктов экспрессии искомых генов – РНК, белков или ферментативной активности.
Для выявления конкретных последовательностей нуклеотидов в клонотеках генов рекомбинантные бактерии или фаги рассевают на чашках Петри и образовавшиеся колонии или бляшки переносят на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры. Для этого стерильные фильтры накладывают на поверхность чашек, в результате чего часть бактериальных клеток или фаговых частиц прочно связывается с поверхностью фильтров. Расположение их на фильтрах и поверхности чашек Петри точно совпадает. Бактериальные клетки или фаговые частицы, сорбированные на фильтрах, лизируют щелочью, что сопровождается одновременной денатурацией заключенной в них ДНК. Освободившуюся ДНК фиксируют на фильтрах и гибридизуют с меченым олигонуклеотидным зондом, последовательность нуклеотидов которого точно соответствует последовательности нуклеотидов искомой ДНК. В результате гибридизации происходит специфическое прочное связывание зонда с идентичными и/или гомологичными последовательностями нуклеотидов в ДНК, содержащейся в отдельных бактериальных колониях или бляшках.
После отмывки фильтров от несвязавшегося радиоактивного зонда их высушивают и прикладывают к рентгеновской пленке. Образование специфических гибридов обнаруживают после проявления рентгеновской пленки по появлению на ней четких гибридизационных сигналов в виде темных пятен, положение которых точно соответствует таковому определенных колоний или бляшек на исходной чашке Петри. В результате проведения такого исследования точно идентифицируются бактериальные колонии или фаговые бляшки, содержащие искомые рекомбинантные ДНК. С этого момента с помощью обычных микробиологических и биохимических методов можно получать неограниченное количество идентичных копий клонированной последовательности нуклеотидов ДНК для дальнейших исследований. В ряде случаев, когда нет необходимости в скрининге большого числа клонов, гибридизацию с зондами можно заменить ПЦР. При таком подходе в качестве источника матричной ДНК используют суспензию бактериальных клеток или фаговых частиц отдельных клонов без специальной очистки матричных нуклеиновых кислот.
Часто бывает, что первичная структура искомого гена неизвестна. Тогда применяют один из следующих способов. Во-первых, можно очистить небольшое количество белка, кодируемого клонируемым геном, и определить последовательность его нескольких N-концевых аминокислот. На основании этих данных с учетом вырожденности генетического кода и частоты встречаемости аминокислотных остатков у исследуемого организма синтезируют олигонуклеотидные зонды, которые также используют для гибридизации in situ, аналогично тому как было описано выше. Во-вторых, клонотеку генов или кДНК получают с использованием экспрессирующих векторов. В этом случае если 5'-концевая часть клонируемого гена будет находиться близко от промотора вектора или его кодирующая часть будет соединена в одной рамке считывания с инициирующим ATG-кодоном, то в бактериальных клетках или фаговых лизатах можно обнаружить появление специфического белкового продукта или ферментативной активности. Если рекомбинантный белок неактивен и представляет собой лишь часть полипептидной цепи нативного фермента, его обнаруживают иммунохимическими методами. В ряде случаев отбор нужных клонов может проводиться с помощью генетических методов с использованием специально сконструированных векторных плазмид.
Рассмотренные способы не исчерпывают всех методических подходов, используемых для идентификации определенных последовательностей нуклеотидов в клонотеках генов. Но и эти часто применяемые методы дают представление о том, каким путем сегодня можно выделить индивидуальный ген и добиться его экспрессии в новом генетическом окружении.
|
Скачать 5.83 Mb.