Рецензенты кандидат химических наук В. Г. Коробко доктор биологических наук В. А. Гвоздев Патрушев Л. И

• Название: Рецензенты кандидат химических наук В. Г. Коробко доктор биологических наук В. А. Гвоздев Патрушев Л. И
• Анкор: gene_expression.doc
• Дата: 08.05.2018
• Размер: 5.83 Mb.
• Имя файла: gene_expression.doc
• Тип: Документы; #19010
• страница: 52 из 64

Глава 9.АНТИСМЫСЛОВЫЕ РНК, РИБОЗИМЫ И ДЕЗОКСИРИБОЗИМЫ

Антисмысловые РНК как ключевые компоненты одной из систем негативной регуляции экспрессии генов были впервые описаны у бактерий. Вскоре тот же тип регуляции был обнаружен и у эукариот. Уже в первых опытах было установлено, что короткие РНК, комплементарные мРНК, образуют с ними гибриды и блокируют трансляцию. Поскольку действие таких РНК направлено против функционирования кодирующих (осмысленных) РНК, они получили название антисмысловых (antisense RNA), или micРНК (mRNA interfering complementary RNA). Это открытие вскоре легло в основу целого направления исследований искусственной регуляции экспрессии генов, неразрывно связанного с методами генной инженерии.

9.1.Антисмысловые РНК и олигонуклеотиды

Главный механизм, лежащий в основе функционирования системы антисмысловых РНК, прост и опирается на известный феномен взаимодействия двух комплементарных друг другу молекул нуклеиновых кислот с образованием двухцепочечных РНК–РНК- или ДНК–РНК-гибридов. Оказалось, что взаимодействие с мРНК комплементарного ей полинуклеотида или олигонуклеотида (которые могут быть транскриптами незначащей цепи ДНК, т.е. противоположной той, с которой произошла транскрипция этой мРНК) может блокировать ее трансляцию рибосомами и нарушать экспрессию всего гена на уровне трансляции.

В середине 1970-х годов синтетические олигонуклеотиды, комплементарные мРНК, были впервые использованы в бесклеточных системах биосинтеза белка для подавления трансляции этих мРНК. С разработкой современных методов генной инженерии получение антисмысловых РНК упростилось, так как достаточно в экспрессирующем векторе поместить кодирующую последовательность гена в обратной ориентации по отношению к промотору, чтобы начала транскрибироваться незначащая цепь ДНК с образованием антисмысловой РНК. В такой системе с использованием современных векторов, в которых клонируемая последовательность фланкирована промоторами T3-, T7- или SP6-РНК-полимераз (например вектор Bluescript, см. рис. II.5), можно синтезировать большое количество антисмысловых РНК и использовать их в высокоочищенном состоянии в опытах in vitro. Однако современные генно-инженерные конструкции позволяют вводить векторные молекулы, экспрессирующие антисмысловые РНК, непосредственно в клетки живых организмов и наблюдать биологические эффекты антисмысловых РНК в результате их эндогенной экспрессии.

9.1.1.Механизм действия антисмысловых РНК

Многочисленные исследования антисмысловых РНК как in vitro, так и in vivo показали, что конечным результатом их действия, как правило, является высокоспецифическое ослабление экспрессии генов, мРНК которых является мишенью действия антисмысловых РНК. При использовании олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных различным частям мРНК, было установлено, что как в бесклеточных экстрактах, так и в эукариотических клетках подавление трансляции мРНК достигалось главным образом за счет ее расщепления РНКазой H в месте образования РНК–ДНК-гибрида. При этом бесклеточные экстракты зародышей пшеницы были особенно богаты РНКазой H, однако процесс специфического расщепления мРНК эффективно происходил и в ооцитах Xenopus, и в культивируемых клетках животных. Интересным следствием такого рода исследований оказалось то, что даже экзогенно добавленные к культивируемым клеткам олигодезоксирибонуклеотиды проникали внутрь клеток и блокировали трансляцию соответствующих мРНК.

Механизм транспорта олигонуклеотидов в клетки обладает чертами сходства с эндоцитозом, опосредованным рецепторами. Эффект подавления трансляции мРНК специфическими комплементарными нуклеотидами достигался, как правило, лишь при большом молярном избытке олигонуклеотидов по отношению к мРНК, что является следствием их относительно медленной реассоциации и быстрой внутриклеточной деградации олигонуклеотидов (время полужизни в ооцитах менее 20 мин). Расщепление гибридов мРНК с олигодезоксирибонуклеотидами – не единственный механизм ингибирующего действия олигонуклеотидов на трансляцию. Использование метилфосфонатных (-P-CH₃) аналогов олигонуклеотидов, гибриды которых с РНК не расщепляются РНКазой H, показало, что их действие может быть следствием изменения пространственной структуры мРНК, а также нарушения ее связывания рибосомами. При этом олигонуклеотиды, в которых чередуются фосфодиэфирные и метилфосфонатные связи, сохраняли способность индуцировать расщепление мРНК РНКазой H в гибридах и в то же время характеризовались повышенной устойчивостью к действию внутриклеточных нуклеаз.

Использование аналогов олигодезоксирибонуклеотидов повышает результативность действия системы ингибирования трансляции. Еще более эффективными являются системы, в которых определенный уровень антисмысловых РНК непрерывно поддерживается за счет их эндогенного синтеза, а с мРНК взаимодействуют более протяженные комплементарные последовательности нуклеотидов.

Механизмы ингибирующего действия антисмысловых РНК. В первых опытах с антисмысловыми РНК, которые с помощью микроинъекции вводили в ооциты X. laevis, было установлено, что они подавляют трансляцию соответствующих мРНК. В том случае, если антисмысловые РНК, комплементарные мРНК креатинкиназы В человека, синтезировались в ядрах клеток лимфомы человека, сплайсинг, 3’-концевой процессинг и экспорт соответствующих мРНК в цитоплазму не были нарушены, хотя антисмысловые РНК синтезировалась в эквимолярных количествах по отношению к мРНК-мишени, а сама антисмысловая РНК была комплементарна последовательностям нуклеотидов части последнего кодирующего экзона, соседнего интрона и 3’-фланкирующей последовательности. Экспорт антисмысловой РНК из ядра в цитоплазму был несколько снижен по сравнению с соответствующей мРНК, хотя при этом происходило уменьшение внутриклеточной активности креатинкиназы на 40%. Образование дуплекса между антисмысловой РНК и мРНК, по-видимому, сопровождалось ингибированием связывания мРНК рибосомами, а также транслокации рибосом в процессе трансляции. Взаимодействие антисмысловых РНК с 5’-концевыми нетранслируемыми последовательностями мРНК может изменять пространственную структуру мРНК таким образом, что инициирующий AUG-кодон становится недоступным рибосомам. Не исключено, что в ряде случаев антисмысловые РНК могут блокировать экспорт мРНК из ядра в цитоплазму, особенно когда они присутствуют в молярном избытке. Это также может быть одной из причин подавления синтеза соответствующих белков.

Наилучшие результаты по блокированию экспрессии генов были получены в том случае, когда гены антисмысловых РНК находились в клетках в виде множественных экспрессируемых копий, встроенных в геном, или под контролем сильных промоторов. Дуплексы антисмысловых РНК и мРНК, образующиеся в клетках, которые экспрессируют антисмысловые РНК, являются субстратом для расплетающего фермента (unwindase), который присутствует в клетках всех типов тканей животных. Расплетающий фермент производит дезаминирование 25–40% остатков аденина в обеих цепях дуплекса с образованием инозина. Остатки инозина образуют комплементарные пары с остатками гуанина, поэтому в процессе такой модификации происходит изменение кодирующих свойств мРНК и ее трансляция может приводить к образованию нефункциональных белков. Таким образом, и в данном случае антисмысловые РНК опосредуют инактивацию комплементарных им мРНК, что является еще одним механизмом их ингибирующего действия на экспрессию генов.

9.1.2.Использование антисмысловых РНК

Получение фенокопий. Клетки или организмы, обладающие фенотипом мутантных клеток или организмов, сформировавшимся не вследствие мутаций, называют фенокопиями. Развитие техники антисмысловых РНК позволило исследовать функции отдельных клонированных генов, дифференциально экспрессирующихся в процессе онтогенеза животных. Экспрессия антисмысловых РНК в клетках организма на определенных стадиях его развития может сопровождаться понижением внутриклеточного уровня соответствующих белков или ферментов, что имитирует процесс мутационной инактивации их генов. Одним из примеров использования антисмысловых РНК для получения фенокопий у мышей были исследования роли гена основного белка миелина (ОБМ) в онтогенезе.

Получение трансгенных мышей, экспрессирующих антисмысловые РНК гена ОБМ, который содержался в количестве десяти копий на геном, сопровождалось понижением на 80% внутриклеточного содержания этого белка. Примерно половина потомства мышей приобретала фенотип shiverer через две недели после рождения. Такой фенотип, для которого характерна непрерывная дрожь конечностей, был впервые описан у мышей, гомозиготных по рецессивной мутации в гене ОБМ. Однако для мутантных фенотипов подобных фенокопий была характерна значительная вариабельность, а также имели место мозаицизм в распределении в мозге клеток, содержащих ОБМ (т.е. лишь часть клеток содержала ОБМ), и гетерогенность в отношении уровня экспрессии этого гена. В табл. II.3 суммированы результаты экспериментов по получению фенокопий у мышей, проведенных к 1996 г.

Антисмысловые РНК могут быть использованы и для получения мутантных фенотипов, не описанных ранее из-за отсутствия соответствующих генетических мутантов. Например, введение посредством трансгеноза самкам дрозофилы антисмыслового гена рибосомного белка RpA1, находящегося под контролем промотора теплового шока, сопровождалось нарушением оогенеза при повышенной температуре (37^о). При 18^o, когда экспрессия антисмысловых РНК резко снижена, уменьшалось и образование дефектных яиц. Проявление мутантного фенотипа в этом случае зависело от времени индукции антисмысловых РНК, дозы (количества) антисмыслового гена и уровня его транскрипции. Таким образом, в данной работе было подтверждено известное наблюдение, что для проявления мутантного фенотипа в некоторых случаях нет необходимости в полной инактивации функции соответствующего гена.

Таблица II.3

Влияние экспрессии антисмысловых РНК на фенотип трансгенных мышей

Гены-мишени	Длина micРНК, п.о.	Мишень в гене	Фенотип
Основной белок миелина	1200	Экзоны	Понижение уровня мРНК на 80%; мыши shiverer
ГФРТ	1390	5'-НТ, экзон 1 и интрон 1	Понижение уровня мРНК на 20–50%; активность фермента не изменилась
»	550	То же	Эффект отсутствовал
-Последовательность мышиного вируса лейкемии Молони	540	-Область	Снижение числа лейкозов у зараженных мышей с 31% до 0%
Рецептор глюкокортикоидов типа II	1815	3'-НТ	Понижение уровня мРНК в мозге на 50–70%; уменьшение содержания рецептора
-Цепь иммуноглобулина А	100	5'-НТ и инициирую-щий кодон	Понижение уровня мРНК на 50%; задержка созревания В-клеток
Фактор роста нервов	1300	Экзоны	Изменение базального уровня фактора роста нервов в коже
wnt-1	4700	Экзоны	Понижение уровня мРНК на 98%
Gi2	39	5'-НТ и инициирую-щий кодон	Понижение уровня белка в печени и жировой ткани на 95%, уменьшение скорости роста тела

Таблица II.3 (окончание)

Гены-мишени	Длина micРНК (п.о.)	Мишень в гене	Фенотип
Белок нуклеокапсида вируса гепатита мышей	1800	Экзоны	Повышение устойчивости к вирусной инфекции
GLUT-2	1489	»	Понижение уровня белка GLUT-2 на 80%
Интерлейкин 3	990	»	Понижение уровня IL-3, приводящее к развитию лимфопролиферативных заболеваний -клеток
Миниген COLIA1	1200	»	Понижение уровня белка COLIA1 на 50%, приводящее к летальной ломкости костей
Ангиотензиноген	1900	»	До индукции промотора – повышение уровня мРНК в печени; после индукции – понижение уровней мРНК в печени и почках и повышение в мозге на 20 дней, после чего уровни нормализуются; понижение уровня ангиотензиногена в плазме через 30 дней после индукции
Глюкокиназа -клеток	1900	»	Понижение уровня мРНК в -клетках, сопровождаемое 50%-ным снижением активности глюкокиназы, повышение уровня глюкозы в крови

Использование антисмысловых РНК для исследования онтогенеза животных выявило высокую чувствительность определенных его стадий к изменению уровня экспрессии генов, а также неспецифическую токсичность антисмысловых транскриптов, проявляющуюся за счет взаимного влияния различных частей ранних эмбрионов друг на друга и гетерогенности экспрессии самих антисмысловых РНК в развивающихся зародышах. Это затрудняет интерпретацию результатов, полученных при экспрессии антисмысловых РНК в раннем эмбриогенезе. Поэтому более удобными объектами для получения фенокопий являются культивируемые соматические клетки животных и растений.

Исследование клеточного цикла. Антисмысловые РНК оказались полезными в исследованиях роли протоонкогенов и факторов роста в пролиферации клеток. С использованием такого подхода были изучены протоонкогены c-fos, c-myc, c-src, антионкоген p53. В норме уровень экспрессии c-myc выше в пролиферирующих клетках, чем в дифференцирующихся. В присутствии антисмысловых олигонуклеотидов наблюдали понижение внутриклеточного уровня белка c-Myc в клетках линии HL60, что сопровождалось понижением скорости роста клеток и усилением миелоидной дифференцировки. Природные антисмысловые c-myc-РНК были обнаружены среди транскриптов клеток мышей. Антисмысловые c-fos-РНК предотвращали повторное вхождение покоящихся клеток 3Т3 (фаза G_o) в клеточный цикл.

Противовирусная терапия. Внутриклеточная экспрессия антисмысловых РНК, направленных против мРНК некоторых ключевых вирусных белков, может эффективно подавлять вирусную инфекцию. Этот результат был впервые получен с клетками E. coli, содержащими плазмиды, которые экспрессировали антисмысловые РНК, комплементарные различным участкам генов бактериофага SP. Бактериальные клетки приобретали иммунитет к фагу в наибольшей степени в том случае, если антисмысловые РНК были комплементарны 5’-концевым последовательностям мРНК (включая последовательности Шайна–Дальгарно) гена белка созревания. Менее эффективными оказались антисмысловые РНК, комплементарные мРНК белков оболочки бактериофага или его репликазы. 15-Нуклеотидная антисмысловая последовательность, комплементарная сайту связывания рибосом мРНК, на 94% подавляла выход фага SP и оказывала значительный ингибирующий эффект на развитие родственных фагов Q и GA. Эти опыты показали принципиальную возможность использования антисмысловых РНК для борьбы с вирусными инфекциями. Кроме того, высокая специфичность антисмысловых РНК по отношению к вирусным последовательностям нуклеотидов сводит к минимуму возможные цитотоксические и другие побочные действия. Современные методы генной инженерии позволяют вводить гены антисмысловых РНК в клетки зародышевой линии животных и растений, что может обеспечивать наследование этих генов в ряду поколений.

Обнадеживающие результаты были получены в опытах по ингибированию развития вируса саркомы Рауса (ВСР) в клетках перепелов. Антисмысловые РНК, комплементарные мРНК белка оболочки ВСР, на 70–80% предотвращали внутриклеточное развитие ВСР, дефектного по белку оболочки, в присутствии плазмиды, экспрессирующей этот белок, которая без антисмысловой РНК комплементировала развитие дефектного вируса.

Были получены трансгенные растения табака, которые содержали экспрессирующий вектор, направляющий синтез антисмысловой РНК, комплементарной мРНК белка оболочки вируса мозаики огурцов (ВМО). Такие растения оказались устойчивыми к ВМО только при низкой множественности инфекции, а иммунитет к ВМО мог быть преодолен с помощью высоких концентраций инокулируемого вируса. Аналогичные результаты были получены с трансгенными растениями табака, экспрессирующими антисмысловые РНК, комплементарные транскрипту гена белка оболочки X. В этих опытах уровень экспрессии антисмысловых РНК оказался недостаточным для того, чтобы обеспечить полную устойчивость растений к вирусной инфекции, что требует дальнейшей оптимизации условий экспрессии генов антисмысловых РНК в клетках растений.

9.1.3.Природные антисмысловые РНК

За то время, которое прошло с момента открытия в середине 1970-х годов антисмысловых РНК и их успешного использования для искусственной регуляции экспрессии генов, стало ясно, что этот эффектный генно-инженерный прием уже давно и широко используется самой природой для тех же целей – модуляции экспрессии генов на молекулярном уровне. В прокариотических системах антисмысловые РНК участвуют в регуляции репликации и поддержании плазмид. Так, в случае плазмиды ColEI инициация ее репликации негативно регулируется с помощью короткой, нетранслируемой антисмысловой РНК. Антисмысловая РНК I плазмиды ColEI также играет ключевую роль в обеспечении несовместимости плазмид, принадлежащих к одной группе совместимости, внутри одной бактериальной клетки (подробнее см. раздел 4.2.2). Похожие механизмы с участием антисмысловых РНК используются и для регуляции репликации плазмид группы IncF1 (NR1, R1 и R6) и IncQ (R1162), а также для регулирования числа копий плазмиды pT181 Staphylococcus aureus. Антисмысловые РНК служат у бактерий для регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции (например гена белка-рецептора циклического АМР) и трансляции. В последнем случае антисмысловая РНК micF участвует в подавлении экспрессии белка OmpF внешней мембраны E. coli.

Экспрессия гена sulA E. coli, кодирующего SOS-индуцируемый ингибитор деления бактериальных клеток, регулируется нетранслируемой РНК, комплементарной на протяжении 250 нуклеотидов 3’-концевой части sulA-РНК. Регуляция на уровне трансляции антисмысловыми РНК имеет место у колицинового (E1) оперона плазмиды ColEI, а также оперона gvpABC цианобактерии Calotrix 7601, которые обеспечивают образование газовых везикул, придающих плавучесть бактериальным клеткам.

Антисмысловые РНК участвуют и в регуляции жизненного цикла бактериофагов. Например, у бактериофага  обнаружена короткая антисмысловая РНК, комплементарная мРНК гена Q и ингибирующая ее трансляцию. Это приводит к понижению уровня экспрессии поздних генов бактериофага и ингибированию его литического развития. Другой антисмысловой РНК фага , участвующей в регуляции экспрессии гена сII-репрессора, является oopРНК. Эта РНК комплементарна 3’-концевой части транскрипта гена cII и после образования гибрида ингибирует ее трансляцию, вероятно, вследствие расщепления дуплекса РНКазой III клетки-хозяина. Небольшая антисмысловая РНК (sarРНК) участвует в регуляции синтеза антирепрессора фага P22. Та же система регуляции антисмысловых РНК характерна и для некоторых транспозонов. Антисмысловые РНК природного происхождения были обнаружены и в клетках эукариот. Так, наличие небольших ядерных поли(A^-)-РНК, комплементарных гену дигидрофолатредуктазы, характерно для ядер клеток мышей. Геномные локусы с генами, транскрибируемыми в двух противоположных направлениях, имеются у мышей, крыс и дрозофилы. Образование антисмысловых РНК отмечено во время латентной инфекции вирусом простого герпеса, а также в семенах ячменя. В последнем случае были идентифицированы антисмысловые РНК, комплементарные мРНК изозимов -амилазы типов A и B.

Антисмысловые РНК, по-видимому, играют важную роль и в экспрессии ранних генов вируса полиомы. Геном вируса полиомы представляет собой небольшую кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК, на которой транскрипция ранних и поздних генов происходит в противоположных направлениях с промоторов, расположенных в межгенной регуляторной области. Соответственно, в результате экспрессии ранних и поздних генов транскрибируются разные цепи ДНК. Терминация транскрипции поздних генов происходит неэффективно на поздних стадиях инфекции, что приводит к образованию в ядрах зараженных клеток гигантских РНК, заключающих в себе многократно повторяющуюся последовательность всего генома. При этом последовательности нуклеотидов таких РНК, соответствующие ранним генам вируса, являются антисмысловыми по отношению к нормальным ранним РНК вируса как продуктам транскрипции противоположной цепи вирусной ДНК. Накопление таких антисмысловых РНК приводит к резкому снижению внутриклеточного уровня ранних РНК, а экспериментальная дестабилизация антисмысловых РНК с помощью мутаций сопровождается значительным его повышением in vivo.

Приведенных примеров достаточно, чтобы сделать вывод о широком распространении антисмысловых РНК в природных условиях, хотя в случае эукариотических организмов физиологическое значение антисмысловых РНК непонятно. Расширение исследований в этой области молекулярной генетики несомненно приведет к открытию новых регуляторных механизмов с участием антисмысловых РНК. В том случае, если регуляторные функции антисмысловых РНК, реализуемые через РНК–РНК-гибриды, будут подтверждены у эукариот, это еще раз укажет на перспективность направления поисков путей искусственной регуляции экспрессии эукариотических генов с использованием антисмысловых РНК у животных и растений. Правильность такого направления уже сейчас подтверждается возможностью получения фенокопий у высших организмов с помощью антисмысловых РНК, а для повышения эффективности их действия необходимо просто оптимизировать условия их биосинтеза в эукариотических клетках. Использование техники антисмысловых РНК позволяет осуществлять высокоспецифическую инактивацию функционирования определенных генов in vivo и становится особенно полезным в тех случаях, когда инактивация соответствующих генов генетическими методами (с помощью мутаций) невозможна. Тем не менее значительная вариабельность в уровнях экспрессии антисмысловых РНК в клетках, содержащих эндогенные антисмысловые гены, а также некаталитический характер действия антисмысловых РНК, требующий их высокой внутриклеточной концентрации, накладывают серьезные ограничения на их применение. В этой связи перспективным направлением представляется использование рибозимов, фланкированных последовательностями антисмысловых РНК. Внутриклеточная стабильность таких макромолекул может быть существенно повышена путем конструирования антисмысловых РНК с оптимально подобранной пространственной структурой, а также использованием аналогов нуклеотидов для модификации этих макромолекул.

9.1.4.Антисмысловые РНК и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций

Вся совокупность полученных к настоящему времени данных позволяет предполагать, что антисмысловые РНК могут образовываться не только в результате реализации нормальных регуляторных механизмов, но и во время различных патологических состояний организма, выступая одной из причин их возникновения. Действительно, для того чтобы в клетке начали образовываться антисмысловые РНК, достаточно возникновения инверсии кодирующей части экспрессируемого гена, расположенной за промотором, направляющим транскрипцию этого гена. В таком случае может осуществляться инактивация самого гена, в котором произошла инверсия, и будет образовываться антисмысловая РНК, комплементарная нормальной мРНК мутировавшего гена. К аналогичным результатам будут приводить и транслокации кодирующих частей генов (с одновременной инверсией) под контроль промоторов других активно экспрессирующихся генов. По своей природе такого рода мутации, приводящие к образованию антисмысловой РНК, должны сопровождаться подавлением экспрессии аллельного гена, расположенного на гомологичной хромосоме, и даже целого семейства гомологичных генов. Следствием этого должно быть резкое снижение уровня и даже полное отсутствие в мутантной клетке белкового продукта мутантного гена с образованием фенокопий. К каким же последствиям для клетки могут приводить такие мутации?

В качестве одного из примеров, демонстрирующих потенциальную важность этих мутаций в развитии патологических состояний организма, рассмотрим возможные последствия инактивации с помощью вышеупомянутого механизма генов-супрессоров опухолевого роста, называемых также рецессивными онкогенами или антионкогенами. В настоящее время можно считать доказанным, что различные формы такого онкологического заболевания, как ретинобластома, возникают вследствие инактивации в единственной клетке-предшественнице обеих копий одного гена – RB1. В случае наследуемых форм ретинобластомы один мутантный аллель гена RB1 наследуется от одного из родителей больного, тогда как другой образуется в результате соматической мутации в малигнизирующейся клетке-предшественнице опухоли. При спорадической ретинобластоме инактивация обоих аллелей гена должна произойти в одной клетке, что является редким событием. Предлагаемая модель с участием антисмысловых РНК объясняет, каким образом инактивация обоих аллельных генов RB1 может происходить в результате одного мутационного события: инверсии части кодирующей последовательности гена RB1 или одновременной инверсии и транслокации части гена в новый хромосомный локус под контроль сильного промотора другого гена. В настоящее время у млекопитающих известны не менее 12 хромосомных локусов, утрата которых в результате делеций сопровождается малигнизацией клеток и которые содержат другие гены-супрессоры опухолей. Каждый из этих локусов потенциально может быть инактивирован с помощью эндогенных антисмысловых РНК. Следовательно, концепция антисмысловых РНК дает простое объяснение молекулярных механизмов одновременной инактивации аллельных рецессивных онкогенов в живом организме с последующей малигнизацией клеток и развитием опухолей.