|
|
Рецензенты кандидат химических наук В. Г. Коробко доктор биологических наук В. А. Гвоздев Патрушев Л. И
9.3.Аптамеры
Аптамерами называют небольшие молекулы нуклеиновых кислот, которые могут выполнять функции высокоспецифичных рецепторов низкомолекулярных органических соединений. Олигонуклеотидные аптамеры с требуемыми свойствами выделяют из библиотек случайных последовательностей методами селекции in vitro, используя их способность специфически взаимодействовать с соответствующими иммобилизованными лигандами. Такие соединения находят применение в фундаментальных исследованиях молекулярных механизмов взаимодействия нуклеиновых кислот с лигандами, и их начинают использовать для обнаружения повреждений в ДНК, для воздействия на экспрессию генов, а также в качестве модулей при конструировании рибозимов, обладающих аллостерическими свойствами. В настоящее время получены аптамеры как рибо-, так и дезоксирибонуклеотидной природы, которые образуют специфические комплексы с разнообразными химическими соединениями, включая большинство аминокислот, нуклеотиды и их производные, антибиотики, биологически активные пептиды, органические красители, дофамин, теофиллин, и многие другие органические соединения, имеющие биологическое значение. Приведем несколько примеров, иллюстрирующих последние достижения в этой области исследований.
Аптамеры, взаимодействующие с красителями. Недавно была реализована идея использования аптамеров для введения флуоресцентной метки в молекулы РНК, синтезируемые in vivo, для наблюдения за экспрессией соответствующих генов. Из пула случайных последовательностей были выделены
60-звенные олигорибонуклеотиды, специфически взаимодействующие с сульфородамином B. После введения в аптамеры мутаций и повторной селекции удалось получить олигонуклеотиды, взаимодействующие с флуоресцеином. В иммобилизованном состоянии эти аптамеры специфически связывали флуоресцентные красители и не давали перекрестных реакций.
В другой серии исследований были идентифицированы аптамеры, взаимодействующие с красителем Hoechst H33258, которые функционировали как in vitro, так и in vivo. Последовательности аптамеров в форме кДНК встраивали в виде тандемных повторов в нетранслируемую область гена ß-галактозидазы, находящегося в составе экспрессирующего вектора. Вектор вводили с помощью трансфекции в клетки линии CHO, которые далее выращивали в присутствии красителя. При определении активности ß-галактозидазы через 24 ч после трансфекции установили, что ее синтез не происходил если Hoechst H33258 присутствовал в питательной среде в концентрации 5–10 мM.
Аптамеры, взаимодействующие с небольшими молекулами биологического происхождения. В качестве первого этапа серии исследований по созданию аптамеров, которые бы специфически распознавали олигосахариды поверхности клеток, недавно (1998 г.) были получены олигодезоксирибонуклеотиды, специфичные в отношении дисахарида целлобиозы. Для скрининга аптамеров использовали простую и эффективную методику. Библиотеку олигонуклеотидов инкубировали с целлюлозой, цепи молекул которой построены из целлобиозы, и несвязавшиеся олигонуклеотиды отмывали буферным раствором, а оставшиеся в комплексе – элюировали раствором целлобиозы. Оказалось, что полученные аптамеры специфически распознают целлобиозу как в растворе, так и в составе целлюлозы (Kd = 10–0,1 мкM) и не взаимодействуют с родственными дисахаридами: мальтозой, лактозой и гентиобиозой. Такие результаты создают предпосылки для получения полного набора олигонуклеотидных рецепторов, который можно было бы использовать в технологии микроматриц ДНК для идентификации антигенов поверхности клеток, что весьма актуально, в частности для осуществления пересадки органов и тканей.
Другим впечатляющим результатом этого направления исследований было недавнее получение аптамеров, которые обладали в 1000 раз большим сродством к N-7-метилгуанозину (основному компоненту кэп-групп мРНК эукариот), чем к его неметилированному аналогу. Такие аптамеры специфически ингибировали трансляцию мРНК, содержащих кэп-группы, в бесклеточных системах, полученных из клеток HeLa или дрожжей. Полагают, что такие аптамеры найдут применение в исследовании кэп-зависимых процессов метаболизма эукариотических мРНК, например сплайсинга пре-мРНК или их транспорта из ядра в цитоплазму.
С помощью аптамеров, специфичных в отношении 7,8-дигидро-8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина, который возникает при повреждении ДНК радикалами кислорода, удавалось обнаруживать в ДНК одну такую молекулу среди 104 обычных остатков дезоксигуанозина. Аналогичные аптамеры могут быть потенциально использованы для мониторинга мутагенных последствий окислительного стресса в эукариотических клетках.
Перспективы использования аптамеров. Новейшие результаты, полученные с использованием аптамеров, указывают на возможность их применения в ближайшем будущем в биотехнологии для регулируемой экспрессии генов, а также для диагностики и терапии. Одним из наиболее интересных достижений в этой области исследований является создание рибозимов с аллостерическими свойствами. В таких конструкциях каталитический домен рибозима соединяют с последовательностями аптамеров-рецепторов, взаимодействующих с регуляторными молекулами. В присутствии низкомолекулярных регуляторов может происходить специфическая активация или ингибирование ферментативной активности рибозима. Такие гибридные конструкции получили название аптазимов. Недавно полученный аптазим, обладающий РНК-лигазной активностью, активировался в 105 раз в присутствии специфических низкомолекулярных эффекторов. При аналогичном подходе были сконструированы ATP-зависимые рибозимы.
Исключительно важные результаты могут быть получены при скрининге in vitro аптамеров среди пула фрагментов природных РНК. В этом случае библиотеки природных последовательностей могут быть использованы для поиска доменов нуклеиновых кислот, специфически взаимодействующих с известными молекулами биогенного происхождения, например белками ретровирусов, для которых неизвестны РНК-мишени клетки-хозяина. Не исключено, что в ходе такого рода исследований у РНК или их фрагментов будут обнаружены новые внутриклеточные функции, связанные с метаболизмом важных биологических кофакторов, включая ATP, GTP, FAD и NAD+.
9.4.Молекулы РНК у истоков жизни
Большинство современных теорий происхождения жизни рассматривает молекулы РНК, обладающие активностями рибозимов, в качестве первичных самореплицирующихся молекул, давших начало развитию жизни на Земле. Результаты исследования двух гипотетических групп рибозимов лежат в основе современных представлений о происхождении жизни. Прежде всего, это РНК-репликазы, построенные исключительно из рибонуклеотидов, т.е. молекулы РНК, способные самореплицироваться. Такое предположение кажется особенно привлекательным, поскольку древние молекулы РНК, с одной стороны, могли бы хранить генетическую информацию, а с другой – обладать ферментативной активностью, необходимой для воспроизведения этой информации. Подобное сочетание свойств в молекуле РНК позволяет объяснить, каким образом каталитические функции, выполняемые современными белковыми молекулами, а также функции хранения и передачи генетической информации возникли одновременно и могли присутствовать в одной молекуле-предшественнике прародителей современных клеток. При переходе от первоначального мира самореплицирующихся молекул РНК к современному живому миру, повсеместно использующему белковый катализ, предполагают возникновение молекул рибозимов, способных осуществлять синтез белка из абиотически возникших его предшественников – аминокислот.
Теории происхождения жизни, основанные на первоначальном участии молекул РНК в создании самореплицирующихся и самоусложняющихся систем, нашли прочную поддержку в связи с открытием аутосплайсинга и рибозимов. Как будет видно из дальнейшего изложения, механизм аутосплайсинга не сильно отличается от комплекса химических реакций, необходимых для репликации нуклеиновых кислот. Кроме того, в настоящее время все больше утверждается точка зрения, в соответствии с которой именно современные рибосомные РНК составляют каталитическую сердцевину рибосомы и могут быть потомками рибозимов, самостоятельно осуществлявших синтез полипептидов. В этой связи представляют интерес некоторые гипотетические схемы молекулярных механизмов экспрессии предшественников современных генов.
Для первоначального появления рибозимов необходим абиотический синтез олигорибонуклеотидов длиной 30–70 оснований. Долгое время это требование было камнем преткновения в разработке теории происхождения жизни, основанной на РНК. Недавно было показано, что после спонтанной иммобилизации на твердой поверхности коротких олигонуклеотидов в присутствии свежих порций активированных мономеров их длина может самопроизвольно удлиняться до 55 остатков. Значительным осложнением для обоснования теории было также то, что мономеры в спонтанно образующихся олигонуклеотидах соединены друг с другом смешанными 2’–5’- и 3’–5’-связями. Такая гетерогенность олигонуклеотидов должна затруднять их последующую матричную активность. Оказалось, однако, что олигоцитидилаты, содержащие смешанные связи, могут служить матрицами для спонтанной полимеризации мономеров, активированных имидазолом, с образованием олигогуанилатов. Таким образом, вышеупомянутые возражения в настоящее время едва ли существенны для обсуждаемой теории.
Для того чтобы репликация РНК самими молекулами РНК имела место, необходимо одновременное присутствие в одном микрообъеме, по крайней мере, двух молекул рибозима-репликазы или же репликазы и комплементарной ей цепи РНК, которая служила бы матрицей для репликазы. В таком случае цикл воспроизводства молекулы репликазы можно представить следующим образом. После разделения цепей синтезированной репликазы и матрицы с последней соединяется олигонуклеотидный праймер, который последовательно удлиняется рибозимом-репликазой, образовавшейся в результате фолдинга второй цепи. Предполагается, что неорганические поверхности, обладающие большим сродством к одноцепочечным РНК, способствуют разделению цепей после завершения акта репликации. При этом должна существовать определенная компартментализация таких молекул (например обеспечиваемая силами адсорбции), препятствующая слишком далекому расхождению разделившихся цепей РНК. И, наконец, синтез РНК, осуществляемый древней репликазой, должен характеризоваться определенным уровнем точности.
Выше уже были рассмотрены механизмы реакций аутосплайсинга и транс-сплайсинга, осуществляемые рибозимами интронов группы I Tetrahymena. В основе этих процессов лежит основанная на переэтерификации аутокаталитическая реакция объединения (лигирования) двух полирибонуклеотидных последовательностей (экзонов), сопровождающаяся удлинением акцепторной последовательности, которое можно рассматривать как прототип реакции полимеризации. В настоящее время экспериментально подтверждена возможность участия в таких реакциях более коротких олигонуклеотидов. В частности, благодаря этим реакциям пентамеры цитидиловой кислоты (С5) превращались в гетерогенную популяцию олиго(С), содержащую даже 30-членные олигонуклеотиды. Вскоре было показано, что и динуклеотиды GpC могут выступать в качестве доноров мононуклеотидов при элонгации С5 с образованием С10 в реакции удлинения праймера (C5 + 5GpC C10 + 5G). Частота ошибок в такой реакции в условиях насыщения GpC-субстратами составляла
35% и была слишком большой для того чтобы обеспечивать саморепликацию молекул РНК.
Альтернативой реакции удлинения праймера на один нуклеотид за цикл может быть зависимая от матрицы реакция элонгации праймера олигонуклеотидами, которая также была продемонстрирована экспериментально. Здесь донорами выступали триплеты олигорибонуклеотидов и, как уже упоминалось выше, крайним известным случаем такой реакции является объединение экзонов. При этом рибозимы Tetrahymena в качестве матриц для сборки олигонуклеотидов могут использовать различные внутренние последовательности нуклеотидов. Так, олигонуклеотиды длиной 8–12 остатков недавно были применены для сборки полной цепи, комплементарной последовательности самого рибозима.
Низкий выход продуктов полной длины в экспериментах, упомянутых выше, позволял предполагать, что с этой задачей успешнее могли бы справиться более короткие и активные рибозимы, которые пока еще в природе неизвестны. В связи с этим была разработана система отбора in vitro, позволившая повысить эффективность реакции лигирования путем получения более коротких производных известного рибозима sunY. Приблизительно 21013 вариантов нуклеотидных последовательностей рибозима в виде единого пула были подвергнуты нескольким циклам все более строгого отбора вариантов рибозима на повышенную способность к лигированию с последующей амплификацией последовательностей в конце каждого цикла отбора. Такие варианты рибозимов с более короткой полинуклеотидной цепью вскоре были получены. Они обладали способностью эффективно осуществлять из 18 олигонуклеотидов полную сборку цепи РНК, комплементарной своей собственной полинуклеотидной цепи. Наиболее интересной находкой в ходе такого рода экспериментов по отбору из пула случайных последовательностей оказался рибозим длиной в 100 нуклеотидов, получивший название лигазы класса I. Этот рибозим осуществлял образование 3’–5’-фосфодиэфирных связей, и его эффективность была сопоставима с таковой фермента – природной ДНК-лигазы (kкат >1 с-1). Недавно было продемонстрировано, что лигаза класса I может выполнять функции РНК-полимеразы, осуществляя элонгацию праймера путем использования рибонуклеозидтрифосфатов в качестве субстратов. Основным ограничением этой реакции является то, что поскольку комплекс рибозим–матрица удерживается комплементарными взаимодействиями, элонгация праймера прекращается, как только 3’-конец образующегося продукта достигает конца матрицы. В реакции не только используются все четыре рибонуклеозидтрифосфата, но и достигается большая точность синтеза РНК (92%). Дальнейшее ее повышение хотя бы в 10 раз позволило бы этой искусственной РНК-полимеразе воспроизводить свою собственную последовательность нуклеотидов. Полагают, что полное превращение рибозима в РНК-полимеразу произойдет после того, как матрица будет связываться с ним некомплементарными взаимодействиями.
Условия отбора, использованные для получения эволюционирующих in vitro молекул лигазы класса I, были отработаны на современных субстратах (рибонуклеозидтрифосфатах). Не исключено, что изменение этих условий позволит получить рибозимы с новыми активностями. Недавно был описан рибозим, осуществляющий реакцию, аналогичную кэпированию акцепторного олигонуклеотида, которая завершалась присоединением к его 5’-концу молекулы аденозинмонофосфата посредством 5’–5’-фосфодиэфирной связи. Полагают, что, используя в качестве субстратов высокоактивированные рибонуклеозидмонофосфаты, можно будет получить рибозимы, непосредственно полимеризующие мононуклеотиды.
9.4.2.Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами РНК
Вскоре после открытия рибозимов в литературе стала активно обсуждаться гипотеза о каталитической (а не только структурной) функции рРНК в рибосомах. Первые экспериментальные данные в пользу возможной каталитической функции рРНК были получены с ингибиторами биосинтеза белка. Оказалось, что устойчивость к некоторым из них вызывается мутациями в генах рРНК, но не рибосомных белков. Х.Ф. Ноллером и соавторами (1992 г.) было установлено, что удаление из рибосомы большого числа рибосомных белков не инактивирует ее пептидилтрансферазную функцию. Подобного рода данные указывают на то, что именно 23S рРНК является пептидилтрансферазой, однако окончательный вывод мешают сделать оставшиеся рибосомные белки, присутствие которых необходимо для проявления пептидилтрансферазной активности такой ослабленной в структурном отношении рибосомы.
Функциональная связь между рРНК и интронами группы I недавно открылась с неожиданной стороны, когда установили, что аминогликозидные антибиотики, блокирующие биосинтез белка, ингибируют и аутосплайсинг интронов группы I. Это открытие нашло дальнейшее развитие в связи с обнаружением у интронов группы I слабой аминоацилэстеразной активности. Было сделано предположение, что интроны группы I и рибосомная РНК могут обладать общими структурными (и функциональными) доменами. Кроме того, мутантные рибозимы, полученные путем отбора in vitro по критерию ускоренного переноса фосфодиэфирных связей, оказались способными, хотя и в слабой степени, расщеплять амидные связи. На основании такого рода данных Ноллер и соавторы сделали предположение о том, что первые примитивные рибосомы образовались из молекул РНК, родственных интронам группы I, которые были в состоянии осуществлять перенос ацильных групп, необходимый для образования пептидных связей. Таким образом, все эти данные в совокупности позволяли предполагать, что функция рРНК в биосинтезе белка является каталитической, а некоторые РНК сегодняшнего дня, имеющие отношение к обсуждаемым процессам – это "молекулярные ископаемые".
При наличии активированных аминокислот синтез пептидов не представляется трудной задачей. Активированные аминокислоты конденсируются даже в водных растворах с образованием коротких пептидов, а цепи длиной до 50 аминокислот образуются на минеральных поверхностях. Абстрактная схема биосинтеза белка в примитивных системах с участием каталитических РНК представлялась следующим образом. Примитивные РНК, аминоацилирующие сами себя активированными аминокислотами по аутокаталитическому механизму, могут выступать донорами и акцепторами аминокислот в реакциях переноса ацильных групп, катализируемых рибозимами. Для признания РНК в качестве молекул, осуществлявших в примитивных системах синтез белков, необходимо показать возможность выполнения ими следующих функций: узнавание аминокислот, аминоацилирование тРНК, перенос ацильных групп, активация аминокислот и синтез пептидов. Рассмотрим реальность каждого из этих предположений.
Молекулы РНК могут распознавать аминокислоты. По крайней мере, у двух природных РНК (как и у обсуждавшихся выше искусственных аптамеров) обнаружены структурные элементы, способные связывать аминокислоты. Интроны группы I связывают аргинин в области спирали Р7 (см. рис. I.15,а). Вторым примером является трансактивируемый район (trans-activating region – TAR) ВИЧ, который специфически взаимодействует с белком-трансактиватором tat во время вирусной инфекции. Этот участок ВИЧ-РНК также обладает способностью взаимодействовать с аргинином. Кроме того, известно, что редактирующая функция аминоацил-тРНК-синтетаз (разрушение связи между ошибочно соединенными аминокислотой и тРНК) включает опосредованное РНК распознавание аминокислот. Предполагается, что в процессе редактирования имеют место непосредственные контакты РНК с аминокислотами. Более того, в системах с искусственным отбором РНК из пула молекул со случайными последовательностями удалось получить четыре различных аргининсвязывающих структурных элемента (аптамера) с разным уровнем специфичности. С помощью того же подхода были выделены акцептирующие цитруллин аптамеры, а также другие молекулы РНК, взаимодействующие с более гидрофобными аминокислотами – валином и триптофаном.
Спонтанное аминоацилирование РНК. Процесс аминоацилирования тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами in vivo происходит в два этапа: вначале фермент активирует соответствующую аминокислоту с образованием 5’-аминоациладенилата, который затем атакуется 2’(3’)-концом тРНК, что сопровождается возникновением соответствующей ковалентной связи между аминокислотой и тРНК. Нагруженные таким образом молекулы тРНК далее используются рибосомами в качестве субстратов при образовании пептидных связей. Недавно тем же методом селекции из пула случайных РНК, представленного 1,7·1014 молекулами, были получены рибозимы, способные при наличии активированных аминокислот спонтанно аминоацилироваться. Пул РНК инкубировали при 0о с химически синтезированным фенилаланил-5’-аденилатом в присутствии ионов Mg2+ и Ca2+. Аминоцилированные РНК обнаруживали по появлению свободной -аминогруппы фенилаланина. Молекулы РНК, меченные такими гидрофобными группами, очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращенной фазе. После 11 циклов отбора были получены спонтанно аминоацилирующиеся РНК со скоростью, в 105 раз превышающей скорость реакции в контроле. Распознавание аминокислоты рибозимом было слабым, поскольку образование специфических комплексов рибозима с субстратом обнаружить не удалось.
Перенос ацильных групп, катализируемый РНК. Повсеместное использование аминоациладенилатов и аминоацилированных тРНК при трансляции в природных условиях указывает на возможную роль РНК в ранних системах трансляции. Действительно, способность рибозимов к спонтанному аминоацилированию позволяет предполагать и возможность их участия в следующем этапе биосинтеза белка – переносе аминоацильной группы с донорной молекулы на свою собственную акцепторную, т.е. в осуществлении аминоацилтрансферазных реакций. Такая активность была обнаружена среди 1015 молекул РНК случайной структуры, подвергнутых искусственному отбору на протяжении нескольких циклов. В этой системе отбора в качестве донора аминоацильной группы был использован гексануклеотидный фрагмент РНК, содержащий на 2’(3’)-конце активированный остаток N-биотинилированного метионина. С помощью стрептавидин-агарозы отбирали молекулы РНК, способные переносить ацильную группу на свою собственную 5’-гидроксильную группу. Подобные рибозимы, среди которых доминировали однотипные молекулы, были получены после 11 циклов отбора.
Анализ первичной структуры таких рибозимов обнаружил вблизи 3’-концов наличие высококонсервативной внутренней матрицы, которая обладала способностью связывать и приводить в контакт друг с другом 2’(3’)-конец донорной молекулы и акцепторный 5’-конец своей собственной полинуклеотидной цепи. Рибозимы оказались не просто матрицей. Они действительно катализировали перенос ацильных групп, ускоряя этот процесс в 103 раз (kкат = 9,4·10-2 мин-1) по сравнению с системами, в которых была задействована только матрица. Интересно, что два неправильно спаренных основания G–U в месте стыковки дуплексов донор–матрица и акцептор–матрица оказались необходимыми для функционирования рибозимов, стимулируя реакцию переноса ацильной группы в 10 раз.
Образование амидных связей, опосредованное рибозимами. Рибозимы, конструирование которых было описано выше, катализировали реакцию трансэтерификации карбоксиэфиров. Для проверки возможности образования этими рибозимами амидных связей их 5’-концевые гидроксильные группы заменяли на аминогруппы. Оказалось, что такие рибозимы с высокой эффективностью осуществляют перенос биотинилированного метионина с 2’(3’)-конца гексануклеотида-субстрата на свою собственную 5’-концевую аминогруппу. Константа скорости первого порядка реакции образования амидной связи (0,58 мин-1) была лишь в 15 раз ниже таковой (8 мин-1), осуществляемой природной пептидилтрансферазой рибосом с использованием фрагмента аминоацилированной тРНК.
РНК-центрический взгляд на происхождение трансляции и самой жизни. Получение аптамеров, способных специфически распознавать аминокислоты, и рибозимов, аминоацилирующих самих себя, явилось серьезным аргументом в пользу ключевой роли РНК в происхождении трансляции. Если предположить, что РНК могут мобилизовать энергию макроэргических связей ATP, то в скором времени будут обнаружены и рибозимы, активирующие аминокислоты путем синтеза соответствующих аминоациладенилатов. Следуя тем же аргументам, можно надеяться на скорое получение рибозимов, способных синтезировать пептиды. Если все основные стадии синтеза белка будут осуществляться рибозимами, то, по мнению А. Хагер и соавторов (1996 г.), можно предположить следующие этапы эволюционирования системы трансляции. Вначале синтез пептидов выполняется рибозимами, не обладающими высокой специфичностью по отношению к своим субстратам – донорам и акцепторам аминоацильных групп. Некоторые пептиды могли начать синтезироваться после приобретения рибозимами специфичности в отношении выбора субстратов. Хотя этот громоздкий механизм для образования каждой пептидной связи в синтезируемом пептиде требует собственного рибозима, однако он не кажется абсурдным, так как до сих пор бактерии используют такой принцип для синтеза некоторых своих пептидов (например молекулы грамицидина) с помощью специфического набора ферментов. Активность рибозимов могла быть повышена с помощью коротких РНК, объединяющих субстраты друг с другом. После эволюционного возникновения таких кофакторных РНК требования к специфичности рибозимов, синтезирующих пептиды, будут снижаться, и в конце концов появится истинная пептидилтрансфераза в виде 23S рРНК. Как известно, рРНК функционирует в тесной связи с матрицей мРНК, которая специфически сближает донорные и акцепторные аминоацил-тРНК.
Все рассмотренные аргументы подчеркивают важную, если не исключительную, роль РНК в происхождении жизни на Земле. Большинство современных ферментов являются белками, а все известные рибозимы действуют на РНК-субстраты. Уже одно это показывает, что цепь событий, приведшая к такому повороту развития эволюционных преобразований живых систем, остается до конца не понятой. Лабораторные методы, позволяющие моделировать эволюционирование рибозимов in vitro, дают возможность продолжить экспериментальное исследование глобального вопроса о происхождении жизни.
|
|
|
Скачать 5.83 Mb.