Рецензенты кандидат химических наук В. Г. Коробко доктор биологических наук В. А. Гвоздев Патрушев Л. И

• Название: Рецензенты кандидат химических наук В. Г. Коробко доктор биологических наук В. А. Гвоздев Патрушев Л. И
• Анкор: gene_expression.doc
• Дата: 08.05.2018
• Размер: 5.83 Mb.
• Имя файла: gene_expression.doc
• Тип: Документы; #19010
• страница: 57 из 64

10.4.Трансгенные растения

Способность к вегетативному размножению отличает организм растений от организма высших животных, что заметно облегчает осуществление трансгеноза. Многие клетки растений, например клетки зародыша на ранних стадиях его развития, покоящиеся клетки меристем кончиков побегов и корней, а также сосудистых тканей камбия, находятся в недетерминированном состоянии и, попадая под влияние внешних воздействий, могут дифференцироваться с образованием клеток любых типов, а также давать начало новым растениям. В частности, перенос в питательную среду таких недетерминированных клеток может приводить к их полной дедифференцировке и формированию в культуре недифференцированной ткани каллуса. Такие клетки могут стабилизироваться в жидких суспензионных культурах и расти неограниченно долго. Из недифференцированных тканей многих видов растений можно легко регенерировать целые растения.

Процесс получения трансгенных растений в этом случае начинается с введения требуемых генов в недифференцированные клетки таким образом, чтобы они интегрировались в хромосомы. Введение чужеродных генов в клетки растений облегчается, если их клеточные стенки удаляют с помощью гидролитических ферментов - пектиназы и(или) целлюлазы, что приводит к образованию протопластов. Чужеродные гены, находящиеся в составе векторных плазмид, вводят в протопласты одним из стандартных способов с использованием эндоцитоза, стимулированного полиэтиленгликолем, электропорации, микроинъекций или бомбардировки микрочастицами, нагруженными векторной ДНК. После этого протопласты в течение нескольких дней культивируют на питательной среде для восстановления клеточных стенок и образующиеся клетки-трансфектанты используют для регенерации целых растений.

Основным направлением применения трансгеноза для генетической модификации культурных растений является повышение их устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, в частности вирусам и гербицидам. Один из таких подходов, в котором антисмысловые РНК были направлены на подавление экспрессии жизненно важных генов вирусов, уже был рассмотрен в разделе 9.1.2.

Другой метод защиты растений от вирусов с помощью трансгенов, предложенный В. Шибальским в 1988 г., успешно используется в настоящее время. Сущность метода заключается во введении в геном растений транс-действующих доминантных летальных генов или, по терминологии Шибальского, "анти-генов", которые кодируют измененные мутациями белки вирусов, существенные для их воспроизводства, и путем конкурентного замещения соответствующих белков вируса дикого типа прерывают его размножение. В частности, с использованием такого подхода удалось получить очень высокую устойчивость растений к вирусу Х картофеля (PVX). В этом случае в ген репликазы PVX с помощью направленного мутагенеза вводили мутации, сопровождающиеся заменой аминокислот в консервативном участке полипептидной цепи репликазы, ассоциированном с ее каталитическим сайтом. Для экспрессии мутантного трансгена в растениях табака были характерны внутриклеточное накопление инактивированной репликазы и появление высокой устойчивости растений к заражению вирусом PVX.

Еще один современный подход к получению трансгенных растений, устойчивых к вирусам, основан на введении в них трансгенов, экспрессирующих в клетках моноклональные антитела, направленные против вирусных белков. В одной из работ с использованием такого метода создали эффективную систему защиты растений от вируса морщинистой мозаики артишока (AMCV). Для этого сначала получили панель моноклональных антител к вирусу AMCV и отобрали гибридомы, продуцирующие антитела, которые взаимодействуют с консервативными участками белка оболочки вируса. Клетки гибридомы использовали для конструирования библиотеки кДНК, из которой выделили последовательности нуклеотидов, кодирующие полноразмерные тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов G класса 2b. С помощью ПЦР и универсальных праймеров амплифицировали вариабельные участки этих последовательностей (V_H и V_L), которые далее клонировали в экспрессирующем векторе E. coli, что сопровождалось образованием полипептидов V_H и V_L, соединенных линкерным пептидом (антитела scFV). После отбора клонов, продуцирующих высокоаффинные антитела к вирусному антигену (scFV), объединенные таким образом гены V_H-V_L помещали в экспрессирующий вектор и использовали для получения трансгенных растений табака Nicotiana bentamiana. Трансгенные растения содержали в своих клетках до 0,1% антител от суммарного белка и оказались устойчивыми к AMCV-инфекции, но не к вирусу мозаики цветной капусты (CMV), что указывало на специфический характер их резистентности.

В заключение следует упомянуть о работе, в которой трансгенные растения сорго, устойчивые к гербицидам, получали бомбардировкой незрелых эмбрионов на стадии зиготы микрочастицами золота (диаметр частиц – 1,5–3,0 мкм). В таком случае микрочастицы погружали в раствор экспрессирующего вектора, высушивали и "выстреливали" в клетки-мишени, добиваясь при этом высоких результатов трансфекции.

10.5.Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний

Современные методы лечения наследственных и приобретенных заболеваний связаны с введением в организм больного недостающих продуктов метаболизма или с ограничением поступления их предшественников с пищей, как это происходит, например, в случае диабета и т.п. Практикуется введение в организм и самих продуктов экспрессии поврежденного гена, а именно: ферментов или пептидных гормонов. Естественно, что подобная терапия лишь временно снимает симптомы заболевания и не устраняет его причины. Радикальным способом лечения таких заболеваний было бы исправление генетического дефекта, приводящего к развитию заболевания, путем введения в геном организма функционально активного гена. Современный уровень развития генной инженерии в принципе позволяет разрабатывать подходы к решению возникающих в связи с этим проблем, поскольку основные методы получения трансгенных животных и растений могут быть использованы и для манипулирования генами человека.

Теоретически возможны два типа генно-инженерных воздействий на геном человека с целью генотерапии. Во-первых, это вмешательство на уровне соматических клеток, приводящее к созданию клона клеток с измененным генотипом, которые могут повлиять на фенотип организма в целом. Во-вторых, воздействие на клетки зародышевой линии. В этом случае все клетки организма следующего поколения будут генетически изменены и такие изменения будут передаваться из поколения в поколение. Объектами генно-инженерных воздействий служат как половые клетки до оплодотворения, так и эмбриональные клетки на ранних стадиях развития зародыша до его имплантации. При работе с соматическими клетками достаточно введения дополнительной копии нормального гена, который может существовать в геноме наряду с его поврежденным гомологом. В отличие от этого в случае генотерапии на уровне клеток зародышевой линии необходимо производить замещение мутантного гена нормальным, так как современный уровень знаний не позволяет предсказать фенотипические последствия одновременного присутствия в геноме нормального и мутантного аллелей гена и их влияние на процессы роста и развития организма.

В настоящее время генотерапия рассматривается как многообещающее направление в развитии способов лечения широкого круга заболеваний человека как моногенной, так и полигенной (многофакторной) этиологии. При этом обработку клеток-мишеней трансгенами можно осуществлять как в организме человека, так и ex vivo, т.е. за его пределами. В последнем случае соматические клетки (чаще всего крови) больного подвергают генно-инженерному воздействию вне организма, после чего вводят их обратно. При всех этих генно-инженерных манипуляциях с трансгенами в первую очередь обращают внимание на генетическую безопасность подобных операций т.е. предотвращение нежелательных побочных эффектов трансгенов. Кроме того, после направленной доставки трансгенов к клеткам-реципиентам необходимо обеспечивать контроль за уровнем их экспрессии, а также, в идеальном случае, возможность изменения этого уровня, т.е. регулировать экспрессию трансгенов. Рассмотрим подробнее современную технику введения трансгенов при генотерапии, чаще всего используемую в клиниках, а также методы, обеспечивающие контроль их экспрессии в организме больного.

10.5.1.Способы доставки новых генов в геном человека

Ретровирусные векторы. Для доставки трансгенов в организм человека в целях генотерапии ретровирусные векторы используются наиболее широко и являются одним из наиболее эффективных средств доставки генетического материала в геном человека. Специфичность взаимодействия ретровирусов с поверхностью клеток-мишеней в момент заражения обеспечивается белком оболочки их вириона, кодируемого геном env, продукт которого контактирует с белком-рецептором заражаемых клеток. Это создает предпосылки для направленного изменения круга хозяев вируса, т.е. клеток, которые он может заражать, путем изменений белка вирусной оболочки. Многие ретровирусы обладают ограниченным кругом хозяев вследствие функционирования вышеупомянутого механизма. Классическим примером такого рода является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), который способен заражать лишь субпопуляцию лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности рецептор CD4.

Наиболее пристальное внимание как к средству доставки трансгенов при генотерапии уделяется вирусу лейкоза мышей Молони (MoMLV). Вирусы группы MoMLV-E обладают способностью заражать практически все исследованные клетки грызунов (вирусы с кругом хозяев, который не выходит за рамки организмов, обычно заражаемых такими вирусами, получили название экотропных). В отличие от этого вирусы группы MoMLV-А способны заражать большое число клеток млекопитающих, включая клетки человека (вирусы с широким кругом хозяев получили название амфотропных). В настоящее время разрабатываются три основные стратегии искусственного изменения тропизма (круга хозяев) вирусов этих групп, что необходимо для доставки трансгенов в клетки человека: прямое изменение последовательности нуклеотидов гена белка оболочки ретровирусов, соединение белка оболочки с новыми лигандами и псевдотипирование.

Модификации гена белка оболочки. Последовательности нуклеотидов гена env, отвечающие за взаимодействие с клеточными рецепторами, определены и могут быть непосредственно замещены последовательностями, кодирующими лиганды невирусной природы. С использованием этого подхода удалось получить химерные белки оболочки, содержащие последовательности аминокислот, изменяющие тропизм вируса. В частности, слияние эпидермального фактора роста (ЭФР) с белком оболочки амфотропного ретровируса через расщепляемую протеиназой фактора Xa линкерную последовательность аминокислот приводило к взаимодействию вирусов преимущественно с ближайшими клетками, содержащими на своей поверхности рецепторы фактора. После отщепления ЭФР протеиназой вирусные частицы начинали заражать клетки, экспрессирующие гомологичные вирусные рецепторы. Однако необходимо иметь в виду, что специфическое взаимодействие ретровирусов с рецепторами на поверхности клеток-хозяев требует образования контактов между несколькими частями полипептидной цепи белка оболочки и рецептора. Кроме того, белок оболочки ретровирусов не только обеспечивает контакт с рецепторами на поверхности клеток-мишеней, но и участвует в последующих этапах проникновения вируса внутрь клеток – интернализации в составе комплекса с рецептором. Все это затрудняет практическое использование подхода с использованием прямого замещения последовательностей аминокислот белка оболочки новыми последовательностями для эффективного изменения тропизма ретровирусов.

Соединение белка оболочки с новыми лигандами. Первые успехи на этом пути были достигнуты путем создания конъюгатов антител с белком оболочки ретровирусов с последующим соединением таких антител с антителами, специфичными в отношении антигенов поверхности клеток посредством стрептавидина. При данном подходе изменение тропизма ретровирусов было достигнуто при использовании антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости, ЭФР или рецепторам трансферрина, экспрессирующимся на поверхности клеток гепатомы. Однако после интернализации вирусных частиц интеграция вирусного генома в геном зараженных клеток проходила крайне неэффективно. Предполагают, что рецептор в комплексе со связанным с ним агентом после проникновения в клеточный компартмент блокирует доступ вирусного генома к клеточному ядру, поскольку при обычной инфекции он задерживается и деградирует на поверхности клеток.

Второй подход в этой группе методов использует химическое присоединение лактозы к белкам оболочки или десиалирование гликопротеинов оболочки вируса. Оба типа модификации дают возможность модифицированным вирусным частицам специфически взаимодействовать с асиалогликопротеиновыми рецепторами, присутствующими, например на поверхности гепатоцитов. Модифицированные таким способом экотропные вирусы приобретают способность с высокой эффективностью заражать гепатоциты человека.

Псевдотипирование. При использовании этой группы методов упаковка геномной РНК ретровирусов проходит в культивируемых клетках, которые экспрессируют гетерологичный белок оболочки, замещающий обычный вирусный белок в процессе внутриклеточного формирования ретровирусных частиц. Наиболее легко замещение белка вирусной оболочки происходит при использовании гомологичных белков близкородственных вирусов. Например, геном MoMLV может быть упакован в вирусные частицы с участием белков оболочки ретровирусов C-, но не D-типа. Неэффективным в этом процессе оказывается и белок оболочки ретровируса HTLV-1. В последнем случае он включается в оболочку только в присутствии всех остальных белков дикого типа вируса MoMLV. В практических целях широкое распространение получили клеточные линии, в которых геном рекомбинантного ретровируса упаковывается в оболочку амфотропного ретровируса (с широким кругом хозяев), например MoMLV-А. В другой популярной линии клеток происходит экспрессия белка оболочки вируса лейкоза гиббонов, а также гомологичных генов gag-pol вируса MoMLV. Подобное сочетание вирусных белков позволяет получать рекомбинантный вирус, пригодный для генотерапии, в высоком титре.

Эффективный перенос ретровирусных векторов происходит только в активно делящиеся клетки, экспрессирующие на своей поверхности соответствующие рецепторы. Стабильная интеграция ретровирусных векторов в геномную ДНК клеток-хозяев создает условия для длительной и эффективной экспрессии рекомбинантных генов, замещающих поврежденные аналоги. Вероятность того, что интеграция вектора в геном приведет к активации какого-либо онкогена, мала, и до сих пор это не наблюдалось в эксперименте. Размножение таких вирусов внутри клеток исключается самой процедурой их конструирования, так как они дефицитны по репликации. Ретровирусные векторы пригодны как для терапии ex vivo, так и для прямого переноса рекомбинантных генов в клетки реципиентов in vivo.

Аденовирусные векторы. В отличие от ретровирусов аденовирусы, в капсид которых упакованы рекомбинантные ДНК, способны заражать и неделящиеся клетки. Кроме того, этот тип векторов не интегрируется в геном клеток-реципиентов, в связи с чем их экспрессия внутри клеток носит временный характер. Векторы на основе аденовирусов используются в генотерапии реже.

Капсид аденовирусов представляет собой икосаэдр (правильный 20-гранник), каждая грань которого (гексон) составлена из шести идентичных белковых субъединиц, с его вершинами соединены пентоны (пентасубъединичные белки), к которым нековалентно N-концевой частью присоединены гомотримерные стержни (knobs) с глобулярными доменами на C-концах. Пять идентичных субъединиц, составляющих пентоны, содержат по одному мотиву из трех аминокислот Arg–Gly–Asp (RGD – в однобуквенном обозначении), специфически взаимодействующих с рецепторами (интегринами). Это дает возможность аденовирусам осуществлять контакт с интегринами _V₃ и _V₅ на поверхности клеток. Взаимодействие аденовирусов с клетками-мишенями происходит в два этапа. Вначале глобулярные домены стержней связываются с первичными (пока не охарактеризованными) рецепторами на поверхности клеток-мишеней, затем после взаимодействия пентонов с интегриновыми рецепторами происходит интернализация вирусных частиц. Одна из проблем специфичности доставки трансгенов с помощью аденовирусов заключается в том, что многие клетки обладают вышеупомянутыми первичными рецепторами для глобулярных доменов стержней аденовирусов. В связи с этим проводятся работы по изменению специфичности связывания глобулярных доменов стержней генно-инженерными методами. При таком подходе делаются попытки получения гибридных белков, объединяющих части полипептидных цепей белка стержней аденовирусов и белков-лигандов, например пептидных гормонов, в частности с гастрин-рилизинг-пептидом. Исследуется возможность подобного изменения белков пентона с тем, чтобы они взаимодействовали с альтернативными тканеспецифическими интегринами. Получены первые результаты, которые указывают на возможность прямой доставки трансгенов с помощью измененных аденовирусов к клеткам эндотелия и некоторым клеткам опухолей (в частности меланомы), которые экспрессируют интегрины _V₃. При этом исключалась возможность взаимодействия аденовирусов с клетками других типов, например эпителия, экспрессирующими интегрины _V₅.

Молекулярные конъюгаты векторной ДНК с лигандами. При таком подходе, используя поликатионы (например полилизин), создают комплексы очищенной векторной ДНК с лигандами. Получены молекулярные конъюгаты векторов с асиалогликопротеинами или IgA в качестве лигандов для доставки конъюгатов к гепатоцитам или клеткам эпителия дыхательных путей соответственно. Основная проблема, с которой приходится сталкиваться на этом пути, заключается в том, что конъюгаты после интернализации попадают в эндосомы, что ограничивает последующую экспрессию трансгенов. Для преодоления затруднений такого рода в состав конъюгатов пытаются включать компоненты аденовирусов, которые обладают эндосомолитической активностью. Нестабильность комплексов конъюгатов ограничивает их широкое применение в настоящее время.

Использование липосом для направленной доставки трансгенов. Направленная доставка трансгенов с использованием липосом уже испытана в различных клинических ситуациях. Основным подходом в данном направлении исследований является создание конъюгатов липосом с антителами или лигандами. Например, липосомы, объединенные с антителами к антигенам главного комплекса гистосовместимости мышей, обладают значительно большей эффективностью доставки ДНК к соответствующим клеткам-мишеням, чем липосомы сами по себе. Пептидный лиганд трансферрин был использован для направленной доставки ДНК к клеткам эритроидного ряда костного мозга, экспрессирующим на своей поверхности рецепторы трансферрина. Поскольку одним из основных требований к адресной доставке ДНК в ядра является отсутствие деградации трансгенов, часто используют объединение липосом с вирусными частицами (например вирусом Сендай или его компонентами, в частности F-частицами), которые облегчают доставку и делают ее более безопасной для транспортируемых молекул ДНК. Считают, что конечным результатом этого направления исследований должно быть создание "суперлипосом", которые в комплексе с соответствующими антителами будут специфически сливаться с мембранами клеток-мишеней, обеспечивая проникновение рекомбинантных ДНК в клетки с помощью соответствующих вирусных белков с последующим транспортом их в ядра, направляемым сигнальными пептидами ядерного транспорта. Следует упомянуть и об использовании липосом для создания так называемых виросом – вирусных частиц, содержащих векторные молекулы нуклеиновых кислот, целиком заключенных в липосомы разнообразной структуры. Такой подход используется для изменения тропизма вирусов с целью направленной доставки векторных молекул при генотерапии.

10.5.2.Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях

Для того чтобы терапевтическое действие трансгенов реализовывалось в полной мере, часто бывает необходимо обеспечивать их тканеспецифическую экспрессию в клетках-мишенях на протяжении всей жизни индивидуума. Из-за ограниченной емкости современных векторов, используемых для адресной доставки трансгенов, не представляется возможным применение для регуляции экспрессии энхансеров и сайленсеров, которые в норме чаще всего создают условия для тканеспецифического характера экспрессии генов в их обычном генетическом окружении (подробнее см. раздел 3.2). Из экспериментов с трансгенными животными известно, что для эффективной экспрессии трансгена часто требуется присутствие его интронов. Более того, чтобы предотвратить возмущающее действие регуляторных элементов хромосом клеток-хозяев, необходимо включать в трансген протяженные фланкирующие последовательности. В частности, для достижения полного уровня экспрессии кластера глобиновых трансгенов требовалось фланкировать кластер некодирующей 5’-концевой последовательностью -глобинового гена и 3’-концевой последовательностью -глобинового гена длиной в 20 т.п.о. каждая. Таким образом, для достижения полного уровня экспрессии трансгена необходимо вводить в клетки-мишени фрагменты геномной ДНК длиной в 250 т.п.о. и более, что является трудновыполнимой задачей. Для исключения интерференции эндогенных регуляторных элементов с таковыми трансгенов часто требуется присутствие в генно-инженерных конструкциях специальных регуляторных элементов – инсуляторов (см. раздел 3.2.4), которые должны предотвращать действие гетерологичных энхансеров на трансгены. При этом необходимо иметь в виду, что инсуляторы не оказывают защитного действия на экспрессию трансгенов, не интегрированных в хромосому клетки-реципиента. Таково в самых общих чертах генетическое окружение трансгена, действие которого необходимо учитывать при создании соответствующих генно-инженерных конструкций. Однако имеются и другие, лучше изученные механизмы, которые обеспечивают тканеспецифическую экспрессию трансгенов.

Тканеспецифические промоторы. Обеспечение тканеспецифической экспрессии трансгена может достигаться путем использования в генно-инженерных конструкциях тканеспецифических промоторов, которые содержат регуляторные элементы, обеспечивающие избирательную транскрипцию гена в определенных тканях. В связи с этим повышенный интерес вызывают промоторы гена регулятора трансмембранной проводимости кистозного фиброза (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator – CFTR) и различных генов, специфически экспрессирующихся в мышечных тканях. Установлено, что фрагмент ДНК длиной в 2 т.п.о., фланкирующий ген CFTR с 5’-конца, обеспечивает, хотя и на низком уровне, экспрессию трансгенов в клетках дыхательных путей человека и мышей как in vitro, так и in vivo. Аналогичного эффекта удалось достичь с использованием промотора гена -актина скелетных мышц и энхансера гена легкой цепи миозина в составе ретровирусных векторов. Эксперименты такого рода приближают то время, когда экспрессия трансгенов в процессе генотерапии будет строго управляемой и тканеспецифической, что является необходимым условием использования генотерапии для лечения заболеваний человека.

Промоторы, активируемые в клетках опухолей. Описано несколько случаев, когда клетки опухолевых тканей обеспечивают более высокий уровень экспрессии определенных генов по сравнению с соответствующими клетками здоровых тканей, что достигается повышением уровня активности их промоторов. Это явилось основанием для разработки одной из стратегий генотерапии рака. Например, многие меланомы характеризуются высоким уровнем синтеза меланина, что связано с активацией промоторов гена тирозиназы и генов, ассоциированных с тирозиназой белковTRP-1 и TRP-2. Эти промоторы, специфически активирующиеся в раковых клетках, были использованы для обеспечения тканеспецифической экспрессии гена-активатора предшественников цитостатиков. Другим примером является раковый эмбриональный антиген (carcinoembryonic antigen – CEA) – специфический маркер опухолевых клеток, локализованный на их поверхности. Экспрессия этого белка регулируется на уровне транскрипции. Регуляторные последовательности его гена также были использованы для избирательной активации предшественников цитостатиков в раковых клетках через активацию соответствующего гена. Аналогичные результаты были получены и с использованием регуляторных элементов онкогенов, усиленно экспрессирующихся в опухолевых тканях. Подробнее о терапевтическом использовании этого подхода см. ниже.

Направленная интеграция трансгенов в определенные генетические локусы. Альтернативным, хотя и более трудоемким, подходом к достижению избирательной экспрессии трансгенов является их введение сразу под контроль эндогенных регуляторных элементов клеток-мишеней, которые присутствуют в сайте интеграции. Известно, что адено- ассоциированный вирус дикого типа осуществляет сайт-специфическую интеграцию своего генома в хромосому 19 человека и что такая специфичность сохраняется и в ряде генно-инженерных конструкций, полученных с его использованием. Однако векторы на основе ДНК адено-ассоциированных вирусов не могут нести вставку, размер которой превышает 2,5 т.п.о., что ограничивает их практическое использование.

10.5.3.Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний

Несмотря на разработку множества новых лекарственных препаратов, направленных на лечение онкологических заболеваний, за последние 30 лет не удалось увеличить число пациентов, проживших более 5 лет после начала заболевания распространенными видами рака, например раком молочной железы или кишечника. Этот факт, выявивший принципиальную неэффективность химиотерапии, стимулировал разработку альтернативных методов лечения онкологических заболеваний, среди которых одним из самых многообещающих подходов является генотерапия.

Многие формы онкологических заболеваний протекают на фоне нарушения регулируемой экспрессии онкогенов или антионкогенов. Причиной такого расстройства на молекулярном уровне чаще всего являются соматические мутации. В связи с этим одним из основных подходов к генотерапии рака является доставка в опухолевые ткани соответствующих неповрежденных генов, что классифицируется как прямая генотерапия, т.е. исправление структуры гена. В случае нарушений экспрессии генов-супрессоров доставляемые трансгены должны кодировать и экспрессировать соответствующие функционально активные белки. В отличие от этого для подавления экспрессии аномально активных онкогенов чаще всего используют антисмысловые РНК или рибозимы.

Другую группу экспериментов, направленных на генотерапию рака, которые исторически были осуществлены раньше прямой генотерапии, можно было бы назвать косвенным воздействием на гены опухолевого роста. При таком подходе в результате направленной доставки трансгенов в опухолевые ткани последние становятся более чувствительными к конкретным экзогенным воздействиям. Это может достигаться путем доставки гетерологичных генов антигенов главного комплекса гистосовместимости, экспрессия которых делает соответствующие клетки иммуногенными, стимулирующими противоопухолевый иммунитет больного организма. Тот же результат получают при экспрессии в опухолевых клетках генов некоторых цитокинов, фактора некроза опухолей, - или -интерферона.

Векторы, переносящие трансгены HLA-B7 и/или IL-2, уже прошли многочисленные клинические испытания. Ранее на лабораторных животных было показано, что экспрессия на поверхности опухолевых клеток рекомбинантных аллоантигенов главного комплекса гистосовместимости приводит к активации иммунной системы животных против опухолевых клеток и регрессии опухолей. В новейших исследованиях рекомбинантные ДНК были успешно применены для лечения меланом. В использованном подходе рекомбинантный ген, кодирующий аллоантиген главного комплекса гистосовместимости человека HLA-B7, непосредственно вводили в опухоли HLA-B7-негативных пациентов в составе ДНК-липосомных комплексов. Обнадеживающие результаты получены и при клиническом применении этого подхода для лечения пяти больных с меланомами на IV стадии. У одного пациента произошла полная регрессия опухоли после двух инъекций рекомбинантной ДНК, у других наблюдали существенное улучшение состояния. Плазмидную ДНК обнаруживали в опухолях (но не в сыворотке крови) на 3–7-й день после начала лечения, а рекомбинантный белок HLA-B7 присутствовал в биоптатах опухолей у всех пациентов. Это свидетельствовало об эффективной экспрессии рекомбинантных генов в клетках меланомы и непосредственном вкладе белка HLA-B7 в терапевтический эффект генотерапии.

Другим косвенным методом является изменение клеток, таких как лимфоциты, инфильтрующие опухоли (TIL), уничтожающих раковые клетки, путем введения в них трансгенов, кодирующих цитотоксические белковые факторы или гены цитокинов для повышения противоопухолевой активности этих клеток иммунной системы. Для осуществления контроля над количеством остающихся живыми раковых клеток после терапевтических воздействий на них ex vivo клетки костного мозга маркируют, как правило, геном устойчивости к неомицину.

Ниже будут рассмотрены еще несколько примеров использования генотерапевтических воздействий для лечения онкологических заболеваний человека. Большинство описанных подходов оказались эффективными на экспериментальных животных и прошли клинические испытания.

Замещение дефектных генов-супрессоров опухолей. Мутации в антионкогене р53 обнаруживают в 50% солидных опухолей у человека. Продукт гена р53 выполняет функции активатора транскрипции других генов, ингибирующих переход нормальных клеток от фазы G₁ к S-фазе клеточного цикла. Внутриклеточный уровень этого белка возрастает в ответ на повреждение геномной ДНК, что сопровождается задержкой клеток в фазе G₁ и репарацией повреждений, а также терминальной дифференцировкой или же, если повреждения ДНК оказываются слишком большими, – апоптозом – генетически запрограммированным самоубийством клеток. Инактивация белка р53 ассоциируется с неконтролируемым ростом опухолевых клеток многих типов. Было установлено, что введение функционально активного трансгена р53 в клетки с поврежденным геном белка р53 подавляет рост опухолевых клеток или индуцирует в них апоптоз.

Подавление экспрессии онкогенов. В первой части книги уже упоминалось о том, что гены семейства ras представляют собой группу протоонкогенов, наиболее часто активирующихся при опухолевом перерождении клеток. В частности, более чем у 30% клеток аденокарцином легкого и у 80% клеток опухолей поджелудочной железы обнаруживается мутация в онкогене ras, что ассоциируется с плохим прогнозом протекания заболевания. Введение в опухолевые клетки трансгенов, экспрессирующих антисмысловую ras-РНК, приводит к уменьшению уровня пролиферации клеток и понижению их опухолеродности. Проходят клинические испытания ретровирусных векторов, экспрессирующих антисмысловые РНК гена ras. Аналогичный эффект может быть достигнут и в результате применения соответствующих рибозимов.

Введение "генов-самоубийц", или сенсибилизирующих генов в опухолевые клетки. В большинстве систем, основанных на этом принципе, используют ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk). Как уже упоминалось выше, такой ген придает клеткам, его экспрессирующим, чувствительность к ганцикловиру (GCV) – лекарству, обычно используемому для лечения герпеса. HSV-tk обладает способностью фосфорилировать GCV с образованием соответствующего монофосфата, который, в свою очередь, фосфорилируется клеточными киназами до GCV-трифосфата. Последний в процессе репликации включается в строящиеся цепи ДНК, вызывая терминацию синтеза ДНК и гибель клеток. Интересным следствием гибели клеток под действием активированного GCV является распространение летального воздействия на соседние клетки. Таким образом, соседние опухолевые клетки, не содержащие трансгена HSV-tk, тем не менее элиминируются. Это явление получило название эффекта летального соседства (neighboring-killing effect), или эффекта свидетеля (bystander effect). Проводятся клинические испытания HSV-tk-трансгена в составе ретровирусных векторов в качестве действующего начала при лечении опухолей мозга или их метастазов. В этих экспериментах мышиные клетки, экспрессирующие трансген, непосредственно имплантировали в растущие опухоли. Поскольку перенос трансгенов, опосредованный ретровирусами, ограничивается пролиферирующими клетками, в результате экспрессии трансгена происходит избирательная гибель именно опухолевых клеток. Использование подхода с трансгеном HSV-tk в клиниках дало обнадеживающие результаты, так как при этом само заболевание протекало легче и лечение хорошо переносилось пациентами. Были сконструированы и аденовирусные векторы, экспрессирующие трансген HSV-tk, которые в настоящее время испытываются для лечения раковых заболеваний.

Введение трансгенов, активирующих лекарства, в опухолевые клетки. Бактериальный ген цитозиндезаминазы является одним из примеров гена-сенсибилизатора. Этот фермент способен превращать нетоксичный для человека 5-фторцитозин в 5-фторурацил – потенциальный цитостатик. Поэтому 5-фторцитозин оказывает летальное действие на клетки, экспрессирующие цитозиндезаминазу, и остается индифферентным по отношению к другим клеткам организма человека. Ген цитозиндезаминазы рассматривается в качестве защитного средства, предохраняющего организм от неконтролируемой пролиферации клеток, измененных в результате генотерапии. Если такая нежелательная пролиферация происходит, клетки уничтожают in vivoс помощью 5-фторцитозина, нетоксичного для других клеток.

Терапия предшественниками цитотоксических лекарств, активируемых продуктами экспрессии трансгенов в клетках-мишенях. При этом подходе пытаются усилить специфичность действия цитостатиков благодаря различиям в уровнях экспрессии трансгенов в клетках разных опухолей. Для реализации такой идеи ген-сенсибилизатор доставляется в нормальные и опухолевые клетки с помощью ретровирусного вектора. При этом ген находится под контролем промотора, обеспечивающего его преимущественную экспрессию в опухолевых клетках, так как именно в них присутствуют необходимые для активации транскрипции белковые факторы. Если ген-сенсибилизатор кодирует цитозиндезаминазу, то 5-фторцитозин будет активироваться только в присутствии этого фермента, синтезирующегося в опухолевых клетках (см. выше). Конструкции с регуляторным доменом гена CEA используют для лечения метастазов колоректального рака. Другим примером является рекомбинантный вектор, обладающий промотором онкогена c-erbB-2, разработанный для лечения рака молочной и поджелудочной желез. Именно в этих опухолях часто наблюдают сверхэкспрессию такого гена.

Защита стволовых клеток от токсического действия лекарств во время химиотерапии. Ретровирусный вектор, экспрессирующий ген множественной лекарственной устойчивости MDR1, был использован при раке яичника с целью придания устойчивости стволовым клеткам организма к цитостатикам, используемым для лечения этого заболевания. Экспрессия данного гена делает клетки нечувствительными к таксолу, даунорубицину и многим другим цитостатикам и позволяет сохранять их жизнеспособность и пролиферативный потенциал, необходимые для восстановления жизнеспособности организма после применения интенсивной химиотерапии.

10.5.4.Ближайшие перспективы использования генотерапии

Какие же еще заболевания человека можно рассматривать в качестве ближайшей перспективы для генотерапии? Как упоминалось выше, ретинобластома (онкологическое заболевание, при котором поражаются зародышевые клетки сетчатки глаза) возникает вследствие двух независимых мутационных событий. Первая мутация передается по наследству в виде доминантного признака, а вторая возникает в соматических клетках в процессе развития организма. У 25% пациентов наследуемое нарушение является делецией, затрагивающей участок хромосомы 13q14, а пациенты с нормальным кариотипом содержат делецию в локусе RB1, обнаруживаемую гибридизацией по Саузерну. Для пациентов с делециями в локусе RB1 характерна предрасположенность и к другим онкологическим заболеваниям. Риск заболевания ретинобластомой детей у родителей с делециями в локусе RB1 может быть существенно уменьшен, если в клетки зародышевой линии родителей ввести недостающий участок генома. Аналогичные результаты могут быть получены при лечении болезни Леша–Нихана методами генотерапии на клетках зародышевой линии. Данный синдром вызывается дефицитом фермента пуринового метаболизма гипоксантин-гуанозинфосфорибозилтрансферазы. У пациентов идентифицированы 17 независимых мутаций в гене, расположенном на длинном плече X-хромосомы и кодирующем этот фермент.

Хорошо изучена также этиология болезни Тэя–Сакса. Для пациентов характерно полное отсутствие активности -гексозаминидазы, что сопровождается накоплением ганглиозидов или сложных сфинголипидов в лизосомах. Несмотря на разнообразие клинических проявлений болезни обнаружены только две мутации в гене -гексозаминидазы, одна из которых является вставкой 4 п.о. в экзоне 11, а другая расположена в сайте сплайсинга интрона 12.

Метахроматическая лейкодистрофия характеризуется дефицитом арилсульфатазы A и наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Субстратом фермента является гликолипид цереброзидсульфат, который входит в состав миелина. Во время заболевания цереброзидсульфат накапливается в лизосомах, что приводит к прогрессирующей демиелинизации нейронов. Ген арилсульфатазы A локализован на хромосоме 22. Три мутации описаны в аллеле I этого гена: две из них, расположенные в кодирующей части, приводят к замене Tyr-193Ser, а третья нарушает донорный сайт сплайсинга на границе экзона 2. Таким образом, превентивная генотерапия трех вышеперечисленных наследственных заболеваний потребовала бы точной замены мутантных аллелей на нормальные в клетках зародышевой линии носителей этих мутаций.

В отличие от генотерапии на уровне клеток зародышевой линии генотерапия с использованием соматических клеток сопряжена с меньшими трудностями и потенциально может быть применена для лечения ряда генетических заболеваний. Одним из существенных преимуществ работы с соматическими клетками является меньшая опасность от внесения в геном соматических клеток мутаций вследствие инсерционного мутагенеза. Это связано с тем, что распространение таких мутаций будет ограничено сравнительно небольшим клоном соматических клеток. Большинство предложений по генотерапии с использованием соматических клеток связано в настоящее время с лечением онкологических заболеваний.

Возможность применения генотерапии, объектом которой будут клетки зародышевой линии человека, ставит ряд этических проблем. Прежде всего, при современном уровне развития генетики неизбежен большой риск внесения наследуемых повреждений в геном человека, и такие повреждения будут носить необратимый характер. Кроме того, с развитием генотерапии будет возникать соблазн использования ее достижений для усиления физических возможностей человека. Генетические и социальные последствия такого рода вмешательства в генетическую природу человека в настоящее время непредсказуемы. Исходя из этого, более безопасной представляется генотерапия с использованием генов соматических клеток человека, и именно здесь успехи генной инженерии возможны в ближайшее время.

10.5.5.Успехи генотерапии в модельных экспериментах

В последнее время получены впечатляющие результаты и по коррекции дефектов на генном уровне с помощью направленного переноса генов в клетки мышей. Одним из таких примеров является успешная генотерапия мышей с синдромом shiverer (дрожание конечностей). У этих мышей имеется мутация в гене, кодирующем основной белок миелина, что фенотипически проявляется в виде тремора и конвульсий. Введение гена дикого типа в клетки зародышевой линии больных мышей приводило к рождению фенотипически здоровых особей. У потомства карликовых мышей, не способных синтезировать гормон роста и развившихся из клеток зародышевой линии, в которые ввели гибридный ген металлотионеина и ген гормона роста крыс, наблюдали восстановление способности к нормальному росту и развитию. Путем введения в клетки зародышевой линии гена дикого типа гонадотропин-рилизинг-гормона удалось восстановить репродуктивную способность у потомства мышей, родители которых были стерильны из-за отсутствия у них этого гормона и, как следствие, недоразвития гонад. В подобных же опытах введение клонированных -глобиновых генов человека в клетки мышей с -талассемией сопровождалось восстановлением нормального фенотипа у клеток красной крови и коррекцией анемии. Для мышей, моделирующих сцепленную с X-хромосомой недостаточность по орнитинтранскарбомоилазе, характерны облысение, изменение формы волос и повреждение кожи. Нормальный фенотип восстанавливался у потомства мышей, развившихся из клеток зародышевой линии, в которые был введен ген транскарбомоилазы дикого типа. При этом восстанавливалась даже нормальная экскреция оротовой кислоты. Интересные результаты были получены при попытке проведения генотерапии у мышей с синдромом диабета линии NOD (nonobese diabetic), заболевание которых, по-видимому, имеет аутоиммунную этиологию, что обусловлено дефектными генами главного комплекса гистосовместимости. У трансгенных мышей, экспрессирующих нормальные гены, не наблюдали воспалительных реакций в островках Лангерганса панкреатической железы и синдрома диабета.

На мышах моделировали также синдром мукополисахаридоза типа VII, для которого характерно нарушение ступенчатой деградации глюкозаминогликанов в лизосомах. Введение нормального гена -глюкуронидазы человека таким мышам приводило к коррекции как фенотипа, так и самого биохимического нарушения, приводящего к этому фенотипу.

10.5.6.Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии

Несмотря на впечатляющие успехи генотерапии на модельных животных, в настоящее время имеется ряд принципиальных затруднений, препятствующих широкому использованию метода для лечения заболеваний человека. При проведении генотерапии необходимо выполнять, по крайней мере, следующие условия. Каждый ген, интегрированный в геном человека, должен нормально экспрессироваться и в случае необходимости адекватно отвечать на регуляторные сигналы организма. Интеграция гена в геном не должна сопровождаться инсерционным мутагенезом, нарушающим функционирование жизненно важных генов, и вообще оказывать неблагоприятное генетическое действие. При этом дефектный ген не должен оказывать отрицательного влияния на функционирование трансгена. Необходимо помнить, что частота интеграции вводимого гена в геном эмбриональных клеток сильно варьирует от клетки к клетке, хотя и несколько возрастает при использовании ДНК в линейной форме, а также при увеличении числа копий генов, вводимых в пронуклеус. Интеграция гена часто сопровождается точковыми мутациями, делециями, дупликациями и перестройками ДНК. Кроме того, интеграция генов в геном, как правило, носит случайный характер, что затрудняет введение гена в требуемый участок генома и может сопровождаться инсерционным мутагенезом. Следствием инсерционного мутагенеза может быть инактивация жизненно важных генов или же превращение протоонкогенов в онкогены.

Ни одна из вышеперечисленных технических проблем, возникающих при практическом использовании генотерапии, не является неразрешимой, однако преодоление этих трудностей требует времени. Реализация международного проекта "Геном человека" даст возможность исследователям использовать на практике от 80 000 до 100 000 генов человека, в том числе и для генотерапии. Все это создает реальные перспективы преодоления многих заболеваний человека, считающихся неизлечимыми.