Рецензенты кандидат химических наук В. Г. Коробко доктор биологических наук В. А. Гвоздев Патрушев Л. И
 Скачать 5.83 Mb.
|
Глава 10.ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ И РАСТЕНИЯМетодические достижения генной инженерии микроорганизмов, разрушившие межвидовые барьеры в передаче генов, подготовили благоприятную почву для введения рекомбинантных ДНК в многоклеточные организмы. Действительно, идея введения чужеродных генов в геном многоклеточного организма ничем существенно не отличается от блестяще реализованных идей генетической трансформации бактериальных клеток гетерологичными последовательностями нуклеиновых кислот. Поэтому неудивительно, что с развитием генной инженерии появление трансгенных животных и растений не заставило себя долго ждать. 10.1.Способы получения трансгенных многоклеточных организмовМногоклеточный организм высших животных и растений является продуктом онтогенетического развития, при котором из одной клетки (зиготы), образовавшейся в результате слияния двух половых клеток родителей (гамет), путем большого числа дроблений образуется вся совокупность высокодифференцированных клеток органов и тканей организма. Поскольку любая соматическая клетка или клетка зародышевого пути, в конечном счете, берет свое начало от двух объединившихся родительских клеток, она, как правило, заключает в себе всю (или большую часть) генетическую информацию родительских организмов. Несмотря на то что эта схема является упрощенной и по мере развития дифференцированного состояния соматических клеток их генетический материал часто претерпевает необратимые перестройки (например эритроциты человека вообще лишены ядер), такая картина подчеркивает преемственность генетического материала в рядах клеточных поколений соматических клеток организмов. Почти все гены зигот имеют хорошие шансы быть представленными в большинстве соматических клеток организма и принять участие в формировании их генотипа и фенотипа. Предпосылки такого рода привели к мысли о возможности изменения фенотипа многоклеточных организмов путем введения новых рекомбинантных генов в геном зигот, еще не претерпевших дробления в раннем эмбриональном развитии. В случае объединения с геномом зиготы новые гены должны распространиться в ряду клеточных поколений соматических клеток и экспрессироваться в большинстве этих клеток. Поскольку, с известными ограничениями, весь многоклеточный организм можно рассматривать как клон соматических клеток, произошедших от единственной клетки, распространение рекомбинантных генов, введенных в зиготу, в соматических клетках организма допустимо рассматривать как разновидность молекулярного клонирования последовательностей ДНК. Такой молекулярно-генетический подход к изменению генотипа и фенотипа многоклеточных организмов был реализован экспериментально в середине 1970-х годов. Заражение мышиных эмбрионов на предимплантационной стадии развития вирусом лейкоза мышей (MuLV) приводило к образованию взрослых особей, содержащих вирусную ДНК, интегрированную в геном как соматических клеток, так и клеток зародышевого пути, и эта ДНК передавалась из поколения в поколение. Гены, искусственно введенные в геном многоклеточных организмов и передающиеся от родителей потомству, получили название трансгенов, процесс такого введения и передачи генов обозначили трансгенозом, а животные или растения, содержащие трансгены в геноме своих клеток, стали называть трансгенными. Развитие техники создания трансгенных животных и растений привело к возникновению нового быстро развивающегося направления молекулярной генетики. Были получены уникальные знания об особенностях экспрессии генов и биосинтезе белков в онтогенезе многоклеточных организмов, а также о возможности изменения фенотипа трансгенных организмов, в том числе и коррекции мутантного фенотипа, и использования трансгенных организмов для решения задач биотехнологии, связанных с биосинтезом рекомбинантных белков. Для получения трансгенных животных в настоящее время применяют три основных метода. Во всех методах рекомбинантные гены в составе векторных молекул вводятся в клетки эмбрионов на ранних стадиях их развития. Наиболее популярным и эффективным методом является прямая микроинъекция нескольких сотен копий линеаризованных молекул рекомбинантной ДНК в пронуклеусы оплодотворенных яйцеклеток. Для этого мышей-самок скрещивают с самцами-производителями и через 12 ч после спаривания вскрывают их яйцеводы, выделяют оплодотворенные одноклеточные яйца и помещают их в культуральную жидкость. В пронуклеусы оплодотворенных яиц с помощью микроманипулятора вводят очищенную ДНК, и прооперированные яйца пересаживают в яйцеводы псевдобеременных реципиентных самок. Некоторая часть жизнеспособных трансплантированных яиц проходит в организме мышей полный пренатальный цикл развития, после чего развившиеся детеныши рождаются естественным путем или с использованием кесарева сечения. Трансгенных животных идентифицируют в помете гибридизацией по Саузерну высокомолекулярной ДНК тканей хвостов с соответствующими зондами, далее трансгенные животные скрещивают друг с другом для получения чистых линий и анализируют экспрессию трансгенов. Приблизительно у 70% трансгенных мышей экзогенная рекомбинантная ДНК имеется во всех соматических клетках и клетках зародышевого пути. Это свидетельствует о том, что у них интеграция рекомбинантной ДНК в хромосомы прошла до прохождения первого цикла их репликации в оплодотворенной яйцеклетке. У остальных 30% трансгены содержат лишь часть соматических клеток, т.е. они являются мозаиками, причем у некоторых трансгенных животных клетки зародышевого пути становятся дефектными, а сами животные – бесплодными. Как правило, трансгены стабильно передаются из поколения в поколение без существенных изменений. Однако в ряде случаев отмечены их перестройки, образование делеций и амплификация. Кроме непосредственной микроинъекции в пронуклеусы используют введение рекомбинантной ДНК в цитоплазму или ядра двухклеточных эмбрионов, а также в полость бластоцеля зародышей. Прямая микроинъекция рекомбинантных генов в клетки высокоэффективна, однако методически сложна и требует дорогостоящего оборудования. Более простым способом доставки чужеродных генов в геном животного-реципиента является использование векторов на основе вирусов. В этом случае эмбрионы на ранней (восьмиклеточной) стадии развития инкубируют в культуральной среде в присутствии фибробластов, в которых образуются рекомбинантные ретровирусы, и после заражения такими вирусами эмбрионы пересаживают псевдобеременным самкам мышей, где они продолжают свое развитие. Кроме простоты одним из преимуществ данного способа введения ДНК является то, что в геном клеток зародышей интегрируется, как правило, одна копия исследуемого гена, фланкированного длинными концевыми повторами вирусной хромосомы, что может способствовать эффективной экспрессии гена. Однако к недостаткам метода следует отнести необходимость проведения дополнительных генно-инженерных манипуляций при подготовке ретровирусного вектора, ограниченную емкость вектора (размер вставки – до 10 т.п.о.) и мозаицизм образующихся трансгенных животных, которые состоят из клеток как содержащих, так и не содержащих трансгены. Наконец, следует упомянуть еще об одном способе введения рекомбинантных генов в клетки зародышевой линии животных, при котором используют плюрипотентные (дифференцирующиеся по разным направлениям) эмбриональные стволовые клетки линий ES и EK, предшественники которых были взяты из бластоцисты зародышей мышей. Рекомбинантные гены вводят в такие клетки любым из вышеупомянутых способов, а кроме того, электропорацией или другими стандартными методами, применяемыми для доставки генов в культивируемые соматические клетки. При этом вместе с исследуемыми генами возможно введение селектируемых маркеров, которые позволяют проводить отбор клеток, экспрессирующих данные маркеры и, следовательно, гарантированно содержащих сцепленные с ними исследуемые гены. Отобранные таким образом клетки переносят в бластоцисты развивающихся эмбрионов или используют для получения агрегационных химер объединением их с клетками восьмиклеточных эмбрионов с последующей пересадкой эмбрионов псевдобеременным самкам. |