Пригодность аналитических методик. Руководство для лабораторий по валидации методов и смежным вопросам Под редакцией Б. Магнуссона и У. Эрнемарка
 Скачать 1.02 Mb.
|
|
Пример 3. Валидационное исследование выполняют путем анализа холостой пробы. В условиях сходимости проводят десять (m) независимых анализов холостой пробы. Полученное среднее измеренное значение равно 2 мг/кг, стандартное отклонение s 0 – 1 мг/кг. Случай 1. Методика измерения предусматривает, что тестовые пробы анализируют один раз (n = 1), а поправку вводят по результатам анализа одной холостой пробы (n b = 1). В серии измерений каждый опыт состоит из единичного анализа тестовой пробы и единичного анализа холостой пробы (n b ). Тогда, согласно рис. 2, стандартное отклонение, по которому расчитывают LOD/LOQ, равно: Случай 2. Методика измерения предусматривает, что тестовые пробы анализируют дважды (n = 2), и также дважды анализируют холостую пробу. В серии измерений каждый опыт состоит из двукратного анализа (n = 2) тестовых проб и двукратного анализа (n b = 2) холостых проб. Концентрацию, полученную для тестовых проб, корректируют путем вычитания среднего значения для двух холостых проб. Тогда, согласно рис. 2, стандартное отклонение, по которому расчитывают LOD/LOQ, равно: 33 нее; – стандартное отклонение m единичных результатов в нулевой точке или вблизи – стандартное отклонение, используемое для расчета LOD и LOQ; n – количество усредняемых результатов повторных наблюдений, при каждом из которых выполняют все операции методики измерения; n b – количество усредняемых результатов наблюдений с холостыми пробами, по которым рассчитывают поправку на холостую пробу в соответствии с методикой измерения. Рис. 2. Расчет стандартного отклонения , которое используют для оценки LOD и LOQ. Блок-схема начинается с экспериментального стандартного отклонения, s 0 , рассчитанного по результатам повторных измерений в условиях сходимости для пробы с концентрацией, близкой к нулю, с введением или без введения поправки на холостую пробу, которую применяют ко всем результатам в соответствии с методикой. Эта поправка может быть получена из одного опыта с холостой пробой или как среднее значение из результатов нескольких опытов с холостой пробой. По результатам m повторных измерений при валидации рассчитать стандартное отклонение, s 0 Будут ли вводить поправки на холостую пробу при регулярном применении метода? Да Нет Используя стандартное отклонение , рассчитать LOD и LOQ 34 6.2.3 Оценка LOD Обычно для целей валидации достаточно получить приближенное значение LOD, т.е. уровня, на котором обнаружение аналита становится проблематичным. Для этого можно, как правило, воспользоваться "правилом 3s", описанным в "Краткой справке 2". Если метод применяют для оценки соответствия нормативным или техническим требованиям, требуется более строгий подход, в частности, необходимо учитывать число степеней свободы, связанное с . Подробно это описано в документе IUPAC [49] и других источниках [50, 51]. Если критическое значение и/или LOD используют для принятия решений, тогда необходимо регулярно контролировать прецизионность и, при необходимости, пересчитывать эти пределы. В различных секторах и/или нормативных документах могут использовать разные подходы для оценки LOD. Приводя предел обнаружения, желательно указывать правила, по которым он был определен. В отсутствие каких-либо секторальных руководств по оценке LOD, в общем случае можно воспользоваться подходами, приведенными в "Краткой справке 2". Краткая справка 2. Предел обнаружения (LOD) Что делать Сколько раз Что вычислить/определить по полученным данным Комментарии а) Повторные анализы холостых проб, т.е. матриц, не содержащих определяемого аналита или Повторные анализы тестовых проб с низкой концентрацией аналита. 10 Рассчитать стандартное отклонение результатов Исходя из рассчитать согласно блок-схеме на рис. 2 Рассчитать LOD по формуле LOD = 3× б) Повторные анализы холостых реактивов или Повторные анализы холостых реактивов с низкой концентрацией добавленного аналита. 10 Рассчитать стандартное отклонение результатов Исходя из рассчитать согласно блок-схеме на рис. 2 Рассчитать LOD по формуле LOD = 3× Подход б) приемлем, когда невозможно получить холостые пробы или тестовые пробы с низкой концентрацией аналита. Если эти холостые реактивы не проходят все этапы методики измерения и их подают непосредственно в прибор, тогда расчет даст LOD прибора. Примечания: 1) Для некоторых аналитических методов, например, хроматографии, в тестовую пробу со слишком низкой концентрацией аналита или в холостой реактив, возможно, потребуется вводить добавку, чтобы получить ненулевое стандартное отклонение. 2) При каждом определении нужно полностью выполнить все этапы методики измерения. 3) Стандартное отклонение выражают в единицах концентрации. Если стандартное отклонение выражено в единицах сигнала, LOD представляет собой концентрацию, соответствующую сигналу на холостой пробе у В +3× . Краткий пример расчета LOD через сигнал приведен также в [5]. 35 6.2.4 Оценка LOQ LOQ представляет собой самый низкий уровень содержания аналита, который можно определить с приемлемыми показателями точности. В различных руководствах в качестве критериев приемлемости указывают разные характеристики, например прецизионность, правильность и прецизионность, неопределенность измерения [52]. На практике, однако, LOQ обычно рассчитывают как концентрацию аналита, равную полученному стандартному отклонению ( ) на низких уровнях концентрации, умноженному на некоторый коэффициент, k Q . В Рекомендациях IUPAC [49] принято значение по умолчанию k Q = 10, и если стандартное отклонение примерно постоянное на низких концентрациях, этот множитель соответствует относительному стандартному отклонению (RSD), равному 10 %. Также иногда используют множители 5 или 6, тогда значения RSD составляют 20 % и 17 %, соответственно [53, 54]. См. далее [8] и "Краткую справку 3". Краткая справка 3. Предел количественного определения (LOQ) Что делать Сколько раз Что вычислить/определить по полученным данным Комментарии а) Повторные анализы холостых проб, т.е. матриц, не содержащих определяемого аналита или Повторные анализы тестовых проб с низкой концентрацией аналита. 10 Рассчитать стандартное отклонение результатов Исходя из рассчитать согласно блок-схеме на рис. 2 Рассчитать LOQ по формуле LOQ = k Q × Множитель k Q обычно равен 10, но часто используют и другие значения, например, 5 или 6 (исходя из критерия "пригодности для конкретного применения") б) Повторные анализы холостых реактивов или Повторные анализы холостых реактивов с низкой концентрацией добавленного аналита. 10 Рассчитать стандартное отклонение результатов Исходя из рассчитать согласно блок-схеме на рис. 2 Рассчитать LOQ по формуле LOQ = k Q × Подход б) приемлем, когда невозможно получить холостые пробы или тестовые пробы с низкой концентрацией аналита. Если холостые реактивы не проходят все этапы методики измерения и их подают непосредственно в прибор, тогда расчет даст LOQ прибора. Примечания: 1) Для некоторых аналитических методов, например, хроматографии, в тестовую пробу со слишком низкой концентрацией аналита или в холостой реактив, возможно, потребуется вводить добавку, чтобы получить ненулевое стандартное отклонение. 2) При каждом определении нужно полностью выполнить все этапы методики измерения. 3) Стандартное отклонение выражают в единицах концентрации. 36 6.2.5 Альтернативные методики В предыдущих разделах описан общий подход к оценке LOD и LOQ на основе стандартного отклонения результатов для концентрации, близкой к нулю, полученных в условиях сходимости. Такой подход является широко распространенным, но в стандартах и программах валидации приводят и другие методики. В некоторых случаях, например, когда результаты для холостых проб существенно различаются день ото дня, определение проводят в условиях промежуточной прецизионности, а не сходимости. Например, если имеются результаты контроля качества для проб с низким уровнем концентрации, то для оценки LOD и LOQ можно использовать стандартное отклонение этих результатов. Когда для расчета LOD и LOQ используют стандартное отклонение, полученное в условиях промежуточной прецизионности, не нужно проводить показанную на рис. 2 корректировку, учитывающую введение поправки на холостую пробу. Следовательно, экспериментальное стандартное отклонение, полученное по данным внутреннего контроля качества, будет равно стандартному отклонению , которое используют для расчета LOD и LOQ. В ISO 11843-2 [46] описано, как можно определить LOD прибора непосредственно по калибровочной кривой. 6.2.5.1 Достоверность оценок LOD и LOQ Следует отметить, что даже при 10 повторах, указанных в "Краткой справке 2" и "Краткой справке 3", оценки стандартного отклонения являются по сути своей непостоянными. Таким образом, оценку LOD/LOQ, полученную в ходе валидации, следует воспринимать как ориентировочное значение. Этого будет достаточно, если с помощью оценки LOD/LOQ нужно просто показать, что концентрация аналита в пробах значительно превышает LOD/LOQ. Если можно предполагать, что концентрация аналита в лабораторных пробах будет низкой, LOD/LOQ необходимо регулярно контролировать. 6.2.6 Способность к обнаружению для качественного анализа Задачей качественного анализа (Приложение D) является идентификация или классификация веществ, и по сути он дает ответ "да/нет" на вопрос о превышении заданной пороговой концентрации аналита [55]. Для качественных методов прецизионность нельзя представить как стандартное отклонение или относительное стандартное отклонение, но можно выразить через долю истинно и ложно положительных и отрицательных результатов. При валидационном исследовании пороговую концентрацию можно определить путем установления доли ложно положительных и отрицательных результатов на нескольких 37 уровнях ниже и выше предполагаемой пороговой концентрации. Пороговым уровнем считают такую концентрацию, при превышении которой доля ложно отрицательных результатов будет невелика – в соответствии с заданной вероятностью, например, 5 %. При валидации оценивают пороговый уровень, заявленный в документе на методику (см. пример 4 и "Краткую справку 4"). Пример 4. Определение пороговой концентрации для качественного метода с заявленной пороговой концентрацией 100 мкг/л. На каждом уровне было сделано десять наблюдений. Построен график зависимости доли положительных результатов, в процентах, от концентрации, по которому можно визуально определить пороговую концентрацию, при которой результат испытания становится недостоверным. Если принять как критерий долю ложно отрицательных результатов < 5 %, пороговая концентрация находится между 100 и 130 мкг/л. C (мкг/л) 150 130 100 75 50 20 10 Число положительных/ отрицательных результатов 10/0 10/0 9/1 5/5 1/9 0/10 0/10 Концентрация (мкг/л) Краткая справка 4. Предел обнаружения (LOD) для качественного анализа Что делать Сколько раз Что вычислить/определить по полученным данным Проанализировать в случайном порядке холостые пробы с добавками аналита на разных уровнях концентрации. 10 Построить график зависимости доли положительных или отрицательных результатов, в процентах, от концентрации, и по графику визуально определить пороговую концентрацию, при которой результат испытания становится недостоверным. Д ол я п ол ож ит ел ьн ых рез ул ьтато в ( %) 38 6.3 Рабочий диапазон 6.3.1 Определение "Рабочий диапазон" – это интервал, в пределах которого метод обеспечивает результаты с приемлемой неопределенностью. Снизу рабочий диапазон ограничен пределом количественного определения LOQ. Верхняя граница рабочего диапазона определяется концентрацией, при которой наблюдаются значительные аномалии аналитической чувствительности. Примером этого является эффект плато при высоких значениях оптической плотности в UV/VIS спектроскопии. 6.3.2 Общие замечания по проверке диапазона при валидации Рабочий диапазон метода, подлежащего валидации, должен быть указан в документе на метод (см. А.5 в Приложении А). При валидации необходимо подтвердить, что метод можно использовать в этом диапазоне. Чтобы оценить рабочий диапазон, лаборатория должна рассмотреть как линейность метода, так и предлагаемую процедуру калибровки, изложенную в методике. 6.3.3 Рабочий диапазон метода и прибора Многие методы предусматривают, что пробы для испытаний, полученные лабораторией (лабораторные пробы), подвергают обработке (дигестии, экстрагированию, разбавлению) и после этого подают на измерительный прибор и снимают его показания. В таких случаях есть два рабочих диапазона. Рабочий диапазон метода, указанный в его области применения (например, раздел А.5 в Приложении А), относится к концентрации аналита в лабораторной пробе. Для твердой пробы, в частности, он может быть выражен в миллиграммах на килограмм. Рабочий диапазон прибора выражают в единицах концентрации аналита в обработанной тестовой пробе, которую подают на прибор для измерения (например, в миллиграммах на литр для раствора после экстрагирования пробы). Пример рабочего диапазона прибора показан на рис. 3А, где приведена зависимость сигнала прибора от концентрации аналита в калибровочных эталонах. Пример рабочего диапазона метода показан на рис 3В, где приведено соотношение измеренной концентрации и известной концентрации аналита в анализируемой пробе. Измеренная концентрация – это Термин в VIM [7] – "интервал измерений" или "рабочий интервал" 39 результат, полученный согласно методике измерения (включая все этапы подготовки пробы) с использованием прибора, откалиброванного в соответствии с документом на методику. В ходе валидации необходимо оценить как рабочий диапазон прибора, так и рабочий диапазон метода. Данные о рабочем диапазоне часто получают в ходе разработки метода. В таких случаях достаточно включить эти данные в протокол валидации. Рис. 3. А) Типовой пример калибровочной кривой, полученной инструментальным методом. Показаны характеристики "рабочий диапазон", "линейный диапазон", "аналитическая чувствительность", "LOD" и "LOQ". В) Типовой пример кривой, полученной по методике измерения, где представлена зависимость измеренной концентрации от концентрация аналита в пробе. 6.3.4 Оценка рабочего диапазона прибора Между LOQ и верхним пределом рабочего диапазона прибора его выходной сигнал описывается определенной зависимостью, линейной или нелинейной. В процессе валидации необходимо: 1) подтвердить эту зависимость, 2) продемонстрировать, что рабочий диапазон прибора совместим с интервалом, указанным в области применения метода и 3) убедиться в правильности выбора предлагаемой методики калибровки прибора (одноточечная, двухточечная или многоточечная). Чтобы оценить рабочий диапазон прибора и подтвердить его пригодность для конкретного применения, нужно исследовать его с помощью калибровочных эталонов, которых перекрывают предполагаемый диапазон концентрации на ± 10 % или даже ± 20 %, и построить график (см. "Краткую справку 5", шаг 1). Для диапазона от 1 до 100 мг/л перекрытие на ± 20 % означает интервал от 0,8 до 120 мг/л. Выбранные концентрации должны быть равномерно распределены по всему диапазону. Сначала рабочий диапазон оценивают визуально по виду калибровочной кривой. Следующим шагом является подтверждение вида зависимости между концентрацией и выходным сигналом прибора с Рабочий диапазон Рабочий диапазон Линейный диапазон Концентрация в эталоне для калибровки Концентрация в пробе Аналитическая чувствительность С иг на л от п ри бо ра И зм ер енн ая к онц ент ра ция 40 помощью статистических характеристик регрессии и графика остатков для выбранной модели (например, линейной или квадратичной) (см. "Краткую справку 5", шаг 2). Оценка также может включать применение специальных статистических приемов, таких как проверка по "критериям согласия" [56, 57]. По калибровочной кривой и соответствующим статистическим характеристикам, полученным в рабочем диапазоне прибора, можно судить о приемлемости процедуры калибровки, приведенной в методе. Дополнительно это оценивают при проверке рабочего диапазона метода. 6.3.5 Оценка рабочего диапазона метода Для оценки рабочего диапазона метода необходимо следующее: 1) наличие проб с известной концентрацией и холостых проб; 2) пробы должны быть подвергнуты всем операциям методики измерения; 3) концентрация различных проб должна, по возможности, охватывать весь интересующий диапазон и 4) прибор должен быть откалиброван в соответствии с предложенной методикой калибровки. Результат измерения для каждой пробы рассчитывают в соответствии с документом на методику (см. "Краткую справку 5", шаг 3). Строят график, на котором вдоль оси у откладывают измеренные значения, а вдоль оси х – известную концентрацию в пробах, как показано на рис. 3В. Рабочий диапазон метода и линейность оценивают визуально по графику и подтверждают оценку с помощью статистических данных и графика остатков для линейной регрессии. Для оценки рабочего диапазона можно использовать результаты исследований прецизионности и смещения (см. разделы 6.5.2 и 6.6.2.1), при условии, что эти исследования охватывают весь рабочий диапазон метода. Рабочий диапазон метода должен быть установлен для каждой матрицы, входящей в область применения метода. Это связано с возможным нарушением линейности выходного сигнала под воздействием помех и с тем, что способность метода к экстракции/извлечению аналита может меняться в зависимости от матрицы пробы. |