Пригодность аналитических методик. Руководство для лабораторий по валидации методов и смежным вопросам Под редакцией Б. Магнуссона и У. Эрнемарка
 Скачать 1.02 Mb.
|
|
Краткая справка 5. Рабочий и линейный диапазоны Что делать Сколько раз Что вычислить/определить по полученным данным Комментарии 1) Проанализировать холостые пробы и калибровочные эталоны с 6 – 10 значениями концентрации, равномерно распределенными по всему интересующему диапазону. 1 Построить график зависимости выходного сигнала (ось у) от концентрации (ось х). Рассмотреть график и примерно определить линейный диапазон и верхнюю и нижнюю границы рабочего диапазона прибора. Затем перейти к п. 2). Это даст нам визуальное подтверждение линейности или нелинейности рабочего диапазона. Примечание. Если сигнал не прямо пропорционален концентрации, например, как у электродов рН или других ион- селективных электродов или в случае иммунометрических методов, то перед проведением оценки линейности необходимо преобразовать измеренные значения. 2) Проанализировать 2 – 3 раза холостые пробы и калибровочные эталоны с 6 – 10 значениями концентрации, равномерно распределенными по линейному диапазону. 1 Построить график зависимости выходного сигнала (ось у) от концентрации (ось х). Проверить визуально на наличие выбросов, которые могут быть не выявлены регрессией. Рассчитать соответствующие статистические параметры регрессии. Рассчитать и нанести на график остатки (разности между наблюдаемым и рассчитанным по линейной зависимости значениями у для каждого значения х). Случайное распределение остатков вокруг нулевого значения подтверждает линейность. Систематическое отклонение свидетельствует о нелинейности или зависимости дисперсии от уровня концентрации. Этот этап необходим для исследования рабочего диапазона, который предполагается линейным, особенно в том случае, когда в методе используется калибровка по двум точкам. Если стандартное отклонение пропорционально концентрации, тогда рассматривают вопрос о расчете взвешенной регрессии вместо простой невзвешенной линейной регрессии. Не стоит удалять выбросы без предварительной проверки с помощью дополнительных измерений при близких значениях концентрации. В некоторых случаях калибровки приборов стоит попробовать описать данные нелинейной зависимостью. При этом следует увеличить количество проб. Как правило, не рекомендуется использовать функции порядка выше второго. 3) Откалибровать прибор в соответствии с предложенной методикой калибровки. Проанализировать 2-3 раза, в соответствии с документом на методику, холостые пробы и стандартные образцы или холостые пробы с добавками с 6 – 10 значениями концентрации, равномерно распределенными по всему интересующему диапазону. 1 Построить график зависимости измеренной концентрации (ось у) от концентрации в пробах (ось х). Рассмотреть график и примерно определить линейный диапазон и верхнюю и нижнюю границы рабочего диапазона. Рассчитать соответствующие статистические параметры регрессии. Рассчитать и нанести на график остатки (разности между наблюдаемым и рассчитанным по линейной зависимости значениями у для каждого значения х). Случайное распределение остатков вокруг нулевого значения подтверждает линейность. Систематическое отклонение от нуля свидетельствует о нелинейности. Этот шаг позволяет оценить, насколько предложенные диапазон прибора и методика калибровки пригодны для данного применения. Если имеются результаты исследования смещения и прецизионности, охватывающие интересующий диапазон, тогда отдельное исследование рабочего диапазона метода может не понадобиться. 42 6.4 Аналитическая чувствительность 6.4.1 Определение Аналитическая чувствительность – это изменение выходного сигнала прибора, которое соответствует изменению измеряемой величины (например, концентрации аналита), т.е. это градиент калибровочной кривой [7, 18]. Прилагательное "аналитическая" рекомендуется использовать для того, чтобы избежать путаницы с понятием "диагностическая чувствительность" из области лабораторной медицины [43]. Иногда термином "чувствительность" называют предел обнаружения, но такое его употребление не рекомендует VIM. 6.4.2 Применение Аналитическая чувствительность не является особо важной характеристикой. Однако ее полезно применять, по крайней мере, в двух случаях: 1. Иногда нам известна теоретическая аналитическая чувствительность. Многие ион-селективные электроды ведут себя в соответствии с законом Нернста, например, изменение сигнала исправного стеклянного электрода должно составлять 59 мВ/рН. 2. Для спектрофотометрических измерительных систем оптическую плотность можно рассчитать по закону Ламберта – Бера. Это дает возможность проверить характеристики прибора, и некоторые стандарты требуют проведения такой проверки [58]. 6.5 Правильность 6.5.1 Терминология для описания качества измерения В данном руководстве для описания качества результатов, полученных с помощью определенного метода, мы используем три связанные между собой характеристики: правильность, прецизионность и неопределенность. Тем не менее, исследователи часто используют другие понятия, например, разные виды погрешностей (случайная, систематическая и суммарная), точность (правильность и прецизионность) и неопределенность. Некоторые из этих понятий являются качественными, некоторые – количественными. Со временем многие термины и определения менялись и появлялись новые термины. Кроме того, в различных секторах до сих пор отдают предпочтение разным терминам, и все это приводит к немалой путанице. На рис. 4 показана связь между терминами, а более подробную информацию можно найти в VIM [7] и руководстве Eurachem по терминологии [8]. 43 (Суммарная) погрешность Точность Неопределенность Вид погрешности Качественное описание Количественная мера u bias Рис. 4. Связь между некоторыми основными понятиями, используемыми для описания качества результатов измерений (на основе работы Menditto et al. [59]). Оценка неопределенности в соответствии с GUM [21] предполагает введение поправки на известное смещение и включение неопределенности поправки u bias в окончательный бюджет неопределенности. На рисунке это обозначено пунктирной стрелкой под блоком "смещение". Как концепция точности, так и концепция неопределенности предполагают, что измерения выполняют в соответствии с документом на методику и что "грубые ошибки" (промахи) не учитывают. "Точность" измерения выражает близость единичного результата к опорному значению [29, 48] (точное определение см. в VIM, п. 2.13). Валидация метода направлена на исследование точности результатов путем оценки систематических и случайных влияний на единичные результаты. Поэтому, как правило, исследуют две составляющие точности: "правильность" и "прецизионность". Кроме того, все более распространенным становится представление точности через единую числовую характеристику – "неопределенность измерения". Оценка правильности рассмотрена ниже, прецизионности – в разделе 6.6, а неопределенности – в разделе 6.7. "Правильность" измерения является выражением того, насколько близко среднее значение бесконечного количества результатов измерений (полученных исследуемым методом) к опорному значению. Поскольку невозможно выполнить бесконечное количество измерений, то правильность измерить нельзя. Можно, однако, получить практическую оценку правильности. Эту оценку, как правило, количественно выражают через "смещение". Опорное значение иногда называют "истинным значением" или "условно истинным ("действительным") значением". Меры рассеяния (s, RSD) при заданных условиях Прецизионность Случайная погрешность Смещение Правильность Систематическая погрешность 44 6.5.2 Определение смещения Практическое определение смещения состоит в сравнении среднего значения результатов ( ), полученных с помощью исследуемого метода, с соответствующим опорным значением (х ref ). Есть три основных способа оценки: а) анализ стандартных образцов, б) экспериментальное определение степени извлечения с использованием проб с добавками и в) сравнение с результатами, полученными другим методом (см. "Краткую справку 6"). Исследование смещения должно охватывать всю область применения метода, и поэтому может потребоваться анализ различных типов проб и/или определение различных уровней содержания аналита. Чтобы этого достичь, может понадобиться сочетание различных указанных выше способов. Смещение можно представить в абсолютном виде: (1), в относительном (в процентах): или как степень извлечения добавки: где – среднее значение для пробы с добавкой, а x spike – добавленная концентрация. Кроме того, в некоторых видах аналитических измерений используют также "степень извлечения" ("эффективную степень извлечения"), выраженную в процентах [60]: Чтобы определить смещение с помощью стандартных образцов, находят среднее значение и стандартное отклонение в серии повторных измерений и сравнивают результаты с аттестованным значением стандартного образца. Идеальным стандартным образцом является аттестованный матричный стандартный образец со значениями свойств, близкими к свойствам исследуемых проб. Аттестованные стандартные образцы (CRM) являются общепризнанным средством установления метрологической прослеживаемости [61, 62]. Также важно помнить, что в ходе валидационного исследования конкретный стандартный образец можно использовать только с одной целью. Например, стандартный образец, используемый для калибровки, нельзя использовать для оценки смещения. В сравнении с большим разнообразием типов проб и аналитов, с которыми сталкиваются лаборатории, количество доступных стандартных образцов является весьма ограниченным, и при этом еще важно, чтобы выбранный образец подходил для данного применения. В некоторых случаях следует знать детали характеризации стандартного 45 образца, например, не предусматривает ли процедура подготовки пробы, используемая при характеризации образца, определение не общего содержания аналита, а только его количества, извлекаемого при определенных условиях. Для работ в регуляторной сфере необходимо использовать соответствующие аттестованные образцы, по возможности, с идеально близкой к пробам матрицей. Для постоянного контроля смещения методов, используемых в течение длительного времени в работах для собственных нужд, можно применять стабильный внутрилабораторный образец, однако при первоначальной оценке необходимо использовать аттестованный стандартный образец. В отсутствие подходящих стандартных образцов оценить вероятный уровень смещения можно по данным о степени извлечения (полученным в опытах с добавками). Аналит может присутствовать в образце в различных формах, и иногда определять нужно только некоторые из них. Следовательно, конкретный метод может быть специально предназначен для определения только одной из форм аналита. Неудача с определением всего присутствующего аналита или его части может быть связана с самой сущностью метода. Таким образом, необходимо оценивать эффективность метода для обнаружения всего присутствующего аналита [60, 63]. Поскольку обычно не известно, какое количество конкретного аналита присутствует в пробе, нельзя наверняка быть уверенным в эффективности метода с точки зрения извлечения аналита из матрицы пробы. Одним из способов определения эффективности экстракции является добавление аналита в пробу в различных концентрациях с последующим экстрагированием и измерением концентрации аналита. Существенная проблема в данном случае состоит в том, что аналит, введенный таким образом, вероятно, не будет связан так же сильно, как тот, что присутствуют в матрице пробы естественным образом, поэтому данный способ покажет завышенную эффективность экстракции. Можно оценить смещение путем сравнения результатов, полученных с помощью исследуемого метода, с результатами, полученными другим методом. Существует два основных типа альтернативных методов – референтный метод и метод, который в настоящее время лаборатория использует в своей регулярной работе. С помощью референтного метода получают "принятое опорное значение" измеряемой величины, причем, как правило, с меньшей неопределенностью по сравнению с исследуемым методом. Особым видом референтного метода является первичный метод * . Второй случай имеет место, когда целью * "Первичный метод" – это метод, имеющий наивысшие метрологические свойства, реализация которого полностью описана и понятна в единицах SI, и результаты которого получают без сравнения с эталоном той же величины (CCQM). Соответствующий термин в VIM (см. п. 2.8) – "первичная референтная методика измерений". 46 валидации является демонстрация эквивалентности результатов, полученных с помощью исследуемого метода, и результатов, которые дает существующий метод. Здесь задача состоит в том, чтобы установить отсутствие значимого смещения по отношению к результатам, полученным с помощью существующего метода (хотя результаты измерения этим методом могут сами по себе быть смещенными). В обоих случаях сравнивают результаты, полученные с помощью исследуемого и альтернативных методов для одного и того же образца или образцов. Это могут быть внутрилабораторные стандартные образцы или просто типичные пробы. Преимущество такого подхода состоит в том, что здесь образцы не обязательно должны быть аттестованными стандартными образцами, т.к. опорное значение дает альтернативный метод. Следовательно, метод можно проверить на "реальных" образцах, близким к пробам, с которыми будет иметь дело лаборатория в своей повседневной работе. 6.5.3 Интерпретация результатов определения смещения На рис. 5 показаны две составляющие смещения, которые мы назовем "смещением метода" и "лабораторным смещением". Смещение метода возникает вследствие систематических погрешностей, присущих этому методу, независимо от того, какая лаборатория его применяет. Лабораторное смещение возникает вследствие дополнительных систематических погрешностей, характерных для лаборатории и ее реализации метода. Лаборатория сама по себе может оценить только суммарное (общее) смещение от этих двух источников. Проверяя смещение, необходимо принимать во внимание действующие договоренности, принятые в определенных случаях. Например, некоторые регуляторные нормы для пищевых продуктов выражены как значения величины, определяемой с помощью конкретного эмпирического ("операционно определенного") стандартного метода. По определению, смещение метода для "эмпирических" методик измерения равно нулю. Тогда смещение, обусловленное исключительно конкретным методом (см. рис. 5), не принимают во внимание, и основным вопросом является метрологическая сопоставимость с другими лабораториями, которые применяют тот же метод. В этом случае лаборатория должна, в идеале, определять смещение, используя стандартный образец, аттестованный с помощью конкретного регуляторного или исследуемого эмпирического метода, и тогда можно следовать обычным правилам проверки и интерпретации смещения. Если такого образца нет или нужна дополнительная информация, лаборатория может использовать другие образцы, но тогда при интерпретации результатов следует принимать во внимание все известные различия между исследуемым методом и методом(-ами), использованным для получения опорного значения. 47 Бывает так, что для выполнения конкретного аналитического требования содержание одного и того же аналита можно измерить с помощью нескольких разных измерительных приборов на разных рабочих местах в пределах одной организации. Тогда в этой организации возникают многочисленные комбинированные источники смещения. В такой весьма распространенной сложной ситуации организация может установить процедуры оценки репрезентативной неопределенности, охватывающей все рабочие места/приборы для каждой аналитической задачи. Для этого желательно использовать образец, имеющий те же свойства, в том числе матрицу, что и пробы, подлежащие анализу. С помощью вариационного анализа можно выявить основные факторы изменчивости, вносящие вклад в суммарную неопределенность измерений, и далее предпринять действия для уменьшения различий в пределах организации. Однако в большинстве случаев решение о приемлемости смещения следует принимать исходя из суммарного смещения, измеренного с помощью соответствующих стандартных образцов, проб с добавками или референтных методов, с учетом прецизионности метода и всех данных по неопределенности опорных значений, а также точности, необходимой для конечного применения. Рекомендуется проводить статистические проверки на значимость [64, 65]. Измеренное значение (лабораторное среднее) Опорное значение Суммарное смещение Межлабораторное среднее Смещение метода Лабораторное смещение Рис. 5. Общее измеренное смещение состоит из смещения метода и лабораторного смещения. Примечание. Показанные здесь лабораторное смещение и смещение метода имеют один и тот же знак. В действительности это не всегда так. 48 Краткая справка 6. Правильность Что делать Сколько раз Что вычислить/определить по полученным данным Комментарии а) Анализ стандартного образца исследуемым методом. 10 Сравнить среднее значение, , с опорным значением, x ref , стандартного образца. Рассчитать смещение, b, относительное смещение, b (%), или степень извлечения: Получаем оценку смещения с учетом как смещения метода, так и лабораторного смещения. б) Анализ 10 Сравнить разницу между Чтобы оценить чистую степень матричных средним значением, , для проб извлечения добавки, пробы с холостых проб с добавками и средним добавкой нужно сравнивать с или тестовых значением, , со значением той же пробой без добавки. проб без добавленной концентрации, x spike . Степень извлечения, добавок и с Рассчитать степень извлечения определенная по пробам с добавками добавки, , для различных добавками или матричным определяемого значений концентрации: холостым пробам, будет, как аналита в заданном диапазоне правило, выше, чем для реальных образцов, в которых связь аналита с матрицей концентрации. является более сильной. в) Анализ стандартного образца/пробы исследуемым методом и альтернатив- ным методом. 10 Сравнить среднее значение, , со средним значением, ref , полученным альтернативным методом. Рассчитать смещение, b, или относительное смещение, b (%), или степень извлечения Получаем оценку смещения относительно альтернативного метода. В качестве альтернативного можно использовать или референтный метод, или, если есть намерение заменить один метод другим и нужно продемонстрировать их эквивалентность, метод, применяемый в настоящее время в лаборатории. Сам по себе альтернативный метод может быть со смещением, и в этом случае эксперимент не даст абсолютную оценку правильности. |