Пригодность аналитических методик. Руководство для лабораторий по валидации методов и смежным вопросам Под редакцией Б. Магнуссона и У. Эрнемарка
 Скачать 1.02 Mb.
|
|
Раздел Приме- чание Есть ли ресурсные ограничения и какие именно (персонал, время, деньги, приборы и реактивы, лабораторное оборудование)? - - а) Требуется ли отбор проб и промежуточных проб (и будут ли это делать в лаборатории)? Есть ли ограничения на размер/наличие проб? Какова химическая, биологическая и физическая природа матрицы? Аналит является рассеянным или локализованным? Требуется ответ качественный или количественный? Селективность LOD и LOQ 6.1 6.2 Какие нужно определять аналиты и каков вероятный уровень их содержания (%, мкг/г, нг/г и т.д.)? Присутствуют ли аналиты в более чем одной химической форме (например, разные степени окисления, стереоизомеры) и нужно ли различать эти формы? Селективность LOD и LOQ Рабочий и линейный диапазоны 6.1 6.2 6.3 Какую величину нужно измерять (что есть "измеряемая величина")? Это "полная" концентрация присутствующего аналита или его "извлеченное количество" при определенных условиях? Степень извлечения 6.5 Какие требуются правильность и прецизионность? Какая целевая неопределенность и как она должна быть выражена? Правильность и коэффициент восстановления Сходимость, промежуточная прецизионность, воспроизводимость Неопределенность 6.5 6.6 6.7 б) Каковы возможные помехи для аналита(-ов)? Селективность 6.1 Установлены ли предельные значения для всех параметров, важных для выполнения анализа (например, время экстрагирования, температура инкубации)? Устойчивость 6.8 в) Нужно ли сравнивать результаты с результатами других лабораторий? Неопределенность 6.7 б) Нужно ли сравнивать результаты с внешними требованиями? Неопределенность 6.7 б) а) Некоторые элементы аналитических требований непосредственно не связаны с требованиями валидации метода, но они в более общем плане влияют на возможность применения конкретных методов. Например, различные методы будут применимы в зависимости от того, рассеян ли аналит в объеме пробы или сосредоточен на поверхности. б) Существенным элементом аналитических требований является возможность судить о том, подходит ли метод для данного конкретного применения, и, следовательно, они должны включать допустимую неопределенность, выраженную либо как стандартная неопределенность, либо как расширенная неопределенность. в) Как правило, устойчивость опубликованных стандартных методик в пределах их области применения, т.е. для определенных типов матрицы и рабочего диапазона, установлена. В связи с этим верификация при внедрении в лаборатории опубликованной стандартной методики обычно не включает проверку устойчивости. 26 6. Характеристики метода 6.1 Селективность 6.1.1 Термины и определения Аналитическую селективность определяют как "степень, до которой метод можно применять для определения конкретных аналитов в смесях или матрицах без помех со стороны других компонентов с аналогичными свойствами" [41]. Определения в различных документах [7, 18, 42] более или менее согласуются с такой интерпретацией. Хотя IUPAC рекомендует использовать термин "селективность", в некоторых областях, например, в фармацевтике [13], используют термины "специфичность" или "аналитическая специфичность". Последний вариант рекомендуют использовать во избежание путаницы с термином "диагностическая специфичность", применяемым в лабораторной медицине [43]. 6.1.2 Влияние помех В общем случае можно сказать, что аналитические методы состоят из этапа измерения и, при необходимости, предварительного этапа отделения аналита. На этапе измерения, как правило, не измеряют непосредственно концентрацию аналита, а количественно определяют какую-то связанную с ней конкретную величину (например, интенсивность света). Следовательно, очень важно установить, что измеренное значение величины обусловлено только наличием аналита, а не какого-то другого компонента с подобными химическими или физическими свойствами, и не возникает случайно, тем самым вызывая смещение результата измерения. Для улучшения селективности измерительной системы может потребоваться этап отделения аналита, предшествующий этапу измерения. Помехи могут вызывать смещение, увеличивая или уменьшая сигнал, относимый к измеряемой величине. Степень воздействия для данной матрицы обычно пропорциональна сигналу, и поэтому такое воздействие иногда называют "пропорциональным". Оно изменяет угол наклона калибровочной функции, но не ее свободный член. Это воздействие также называют "вращательным" [44]. "Поступательное" или "фиксированное" воздействие обусловлено сигналом от помех, присутствующих в тестовом растворе. Следовательно, оно не зависит от концентрации аналита. Его часто называют "фоновой помехой" или "помехой базовой линии". Это воздействие влияет на свободный член калибровочной функции, но не на угол ее наклона. 27 Во многих случаях пропорциональные и поступательные воздействия могут присутствовать одновременно. Методом стандартных добавок можно корректировать только пропорциональные воздействия. 6.1.3 Оценка селективности Селективность необходимо устанавливать для методов, разработанных внутри лаборатории или адаптированных из научной литературы, а также методов, опубликованных органами по стандартизации, но используемых за пределами сферы применения, указанной в стандарте на метод. Если методы, опубликованные органами по стандартизации, используют в рамках установленной сферы применения, то для такого случая их селективность, как правило, уже была исследована в процессе стандартизации. Селективность метода обычно исследуют путем изучения его способности измерять содержание заданного аналита в пробах, куда специально были введены определенные вещества-помехи (которые предположительно могут присутствовать в пробах). Если не ясно, присутствуют помехи или нет, селективность метода можно исследовать, изучая его способность измерять содержание аналита в сравнении с другими независимыми методами. Ниже в примерах 1 и 2, а также в "Краткой справке 1" рассмотрены практические аспекты проверки селективности. Проверить правильность идентификации компонентов можно путем подтверждения другими методами. Чем больше будет доказательств, тем лучше. Конечно, всегда приходится искать компромисс между затратами средств и времени, необходимыми для идентификации аналита, и уверенностью в том, что идентификацию выполнили правильно. В то время как для оценки сходимости проводят несколько повторных измерений с помощью одного метода, для подтверждения идентификации аналита нужно выполнить измерения с помощью нескольких, желательно независимых, методов. Подтверждение повышает уровень доверия к исследуемому методу, и оно особенно полезно, когда подтверждающие методы основаны на существенно отличных принципах. В некоторых случаях, например, при анализе органических проб неизвестного состава методом газовой хроматографии, использование подтверждающих методов является очень важным. Если оцениваемый метод измерения обладает высокой селективностью, то подтверждение другими методами можно не делать. Важным аспектом селективности, на который следует обратить внимание, является возможность существования аналита в пробе более чем в одной форме, например: связанной или несвязанной; неорганической или металлоорганической; с различной степенью окисления. Следовательно, во избежание недоразумений очень важно определить, что является измеряемой величиной для данного метода. 28 Краткая справка 1. Селективность Что делать Сколько раз Что вычислить/определить по полученным данным Комментарии Выполнить анализ проб и стандартных образцов исследуемым методом и другими независимыми методами. 1 Исходя из результатов подтверждения с помощью других методов, определить способность метода идентифицировать аналит и измерять содержание аналита при отсутствии помех. Принять решение, какое количество дополнительных доказательств будет достаточным для достижения нужной достоверности. Выполнить анализ проб, содержащих различные предполагаемые помехи в присутствии определяемых аналитов. 1 Изучить влияние помех. Препятствуют ли помехи обнаружению или измерению содержания аналита? Если помехи препятствуют обнаружению или измерению содержания аналита, нужно доработать метод. Пример 2. Спектроскопия В инфракрасной спектроскопии идентификацию неизвестных соединений можно выполнять путем сопоставления сигналов оптического поглощения (т.е. "пиков") в спектре аналита с пиками эталонного спектра, записанного в библиотеку в памяти спектрометра. После того как соединение было идентифицировано, нужно записать спектр стандартного образца аналита точно при тех же условиях, что и спектр пробы. Чем больше пиков у аналита и стандартного образца совпадают, тем выше вероятность правильной идентификации. Также стоило бы исследовать, насколько форма спектра зависит от способа отделения аналита и подготовки к инфракрасному анализу. Например, если спектр записан с помощью солевого диска, то распределение по размеру частиц тестовой порции в диске может повлиять на форму спектра. Пример 1. Хроматография Пик на хроматограмме может быть идентифицирован как соответствующий некоторому аналиту на том основании, что стандартный образец, содержащий этот аналит, порождает сигнал в той же точке хроматограммы. Однако неизвестно, обусловлен ли этот сигнал данным аналитом или каким-то другим веществом, элюируемым одновременно, т.е. нет ли здесь "фиксированного" воздействия? Возможна одна из этих причин или обе одновременно. Идентификация аналита только этим способом не является достоверной, и требуется какое-то дополнительное подтвержение. Например, можно повторить хроматографический анализ с применением колонки другой полярности, с другим принципом разделения, и посмотреть, по- прежнему ли сигналы от пробы и от стандартного образца будут появляться в одно и то же время. Если пик обусловлен более чем одним компонентом, то колонка другой полярности может быть хорошим средством разделения компонентов. Во многих случаях высокую селективность могут обеспечить современные масс-спектрометрические приборы, например, газовые или жидкостные хроматографы с масс- спектрометрическим детектором. 29 6.2 Предел обнаружения и предел количественного определения 6.2.1 Термины и определения Есть три общих понятия, важных для измерения в области низких концентраций. Во- первых, бывает нужно установить значение результата анализа, при получении которого отличие уровня содержания аналита от нуля будут считать значимым. Достижение этого уровня часто влечет за собой некоторое действие, например, признание материала загрязненным. Этот уровень называют "критическим значением", "пределом принятия решения" или, в директивах ЕС, CCα [38]. Во-вторых, важно знать самую низкую концентрацию аналита, обнаруживаемую с помощью данного метода при заданном доверительном уровне. То есть, при какой истинной концентрации с высокой вероятностью будет превышено критическое значение, описанное выше? Для этого понятия используют такие термины, как "предел обнаружения" (LOD), "минимальное обнаруживаемое значение" или, в директивах ЕС, CCβ [38]. В-третьих, важно также установить самый низкий уровень, при котором значения характеристик являются приемлемыми для типичного применения. Этот уровень обычно называют "предел количественного определения" (LOQ) Терминология, касающаяся всех этих понятий, очень разнообразна и отличается в различных секторах. Например, термин "предел обнаружения" (LOD или DL) ранее не был общепринятым, хотя его и использовали в некоторых секторальных документах [13, 38]. Тем не менее, в настоящее время он включен в VIM [7] и IUPAC GoldBook [17]. ISO использует общий термин "минимальное обнаруживаемое значение приведенной переменной состояния", который применительно к химическому анализу звучит как "минимально обнаруживаемая приведенная концентрация" [45, 46, 47, 48]. В настоящем руководстве для трех описанных выше понятий используются термины "критическое значение", "предел обнаружения" (LOD) и "предел количественного определения" (LOQ). При валидации метода наиболее часто определяют LOD и LOQ. Также необходимо различать предел обнаружения прибора и предел обнаружения метода. Предел обнаружения прибора можно определить по результатам анализа пробы, часто холостого реактива, которую вводят непосредственно в прибор (т.е. исключая все стадии подготовки пробы), или по отношению сигнал/шум, например, на хроматограмме. Предел обнаружения метода (LOD) нужно определять по данным анализа проб, которые Используют также синонимы "предел определения", "предел представления данных" и "предел применения". 30 подверглись всем операциям методики измерения, с использованием результатов, рассчитанных по тем же уравнениям, которые используют для рутинных проб. Предел обнаружения метода является самой важной для валидации метода характеристикой, и поэтому именно ему уделено наибольшее внимание в настоящем руководстве. В следующих разделах описана экспериментальная оценка LOD и LOQ. Статистическое обоснование расчета LOD приведено в Приложении B. Поскольку и LOD, и LOQ зависят от прецизионности в нулевой точке или вблизи ее, сначала в разделе 6.2.2 описана экспериментальная оценка стандартного отклонения результатов вблизи нуля. 6.2.2 Определение стандартного отклонения на низких уровнях концентрации Как правило, LOD и LOQ рассчитывают путем умножения стандартного отклонения (s' 0 ) на соответствующий коэффициент. Важно, чтобы это стандартное отклонение отражало прецизионность при анализе типичных тестовых проб и чтобы число повторных измерений было достаточным для получения надежной оценки. В этом разделе стандартное отклонение s' 0 определяют через стандартное отклонение s 0 для единичных результатов вблизи нуля с учетом усреднения и введения поправок на холостую пробу, применяемых на практике (см. ниже). Альтернативные подходы рассмотрены в разделе 6.2.5. Определяя LOD и LOQ в экспериментах с простым повторением, нужно принимать во внимание следующие моменты. Пробы для оценки LOD и LOQ. Желательно использовать либо а) холостые пробы, т.е. матрицы, не содержащие определяемый аналит, либо б) тестовые пробы с концентрацией аналита, близкой к предполагаемому LOD или ниже его. Холостые пробы более пригодны для методов, где на этих пробах получают хорошо измеряемый сигнал, например, для спектрофотометрии и атомной спектроскопии. Однако для таких методов, как хроматография, которая основана на обнаружении пика над уровнем шума, необходимы пробы с концентрацией, близкой к LOD или превышающей его. Их можно приготовить, например, вводя добавки в холостую пробу (см. раздел 5.4). В случаях, когда холостые пробы или тестовые пробы с низкой концентрацией аналита отсутствуют, часто используют холостые реактивы . Если эти реактивы не Имеет место разнобой в терминологии, относящейся к холостым пробам (подробнее см. раздел 5.4.1). 31 подвергают всем операциям методики измерений, а вводят непосредственно в прибор, по результатам таких опытов будут получены LOQ/LOD прибора. Охват сферы применения метода. Если область применения метода включает существенно различные матрицы, может потребоваться определение стандартного отклонения отдельно для каждой матрицы. Обеспечение репрезентативности повторных измерений. Стандартное отклонение должно отражать характеристики метода при его применении в лаборатории, т.е. стандартное отклонение нужно рассчитывать по результатам измерений, при которых анализы выполнены в строгом соответствии с документом на методику измерения в целом, включая все этапы подготовки пробы. Значения величины, используемые для расчета s 0 , должны быть выражены в единицах измерения, указанных в методике. Условия измерений. Стандартное отклонение, как правило, определяют в условиях сходимости, и именно такая процедура описана в данном разделе. Тем не менее, более надежную оценку можно получить в условиях промежуточной прецизионности. Этот подход рассмотрен далее в разделе 6.2.5. Количество наблюдений. Число повторов (m) должно быть достаточным для получения адекватной оценки стандартного отклонения. Как правило, считают необходимым выполнить от 6 до 15 повторов; в методиках/программах валидации часто рекомендуют делать 10 повторов (см. раздел 6.2.5.1). Учет усреднения. Во многих методиках измерения предусмотрено, что измеренное значение определяют как среднее из результатов повторных измерений, причем при каждом повторе выполняют все операции методики измерения. В таком случае стандартное отклонение единичных результатов s 0 необходимо откорректировать путем деления на квадратный корень из n, где n – количество усредняемых повторных результатов, указанное в методике. Учет влияния поправок на холостую пробу. Если методика измерения предполагает введение поправки на холостую пробу, то нужно это учитывать при определении стандартного отклонения, используемого для расчета LOD и LOQ. Если во все результаты, полученные в ходе валидационного исследования, вводят одну и ту же поправку на холостую пробу (подход, рекомендованный здесь для упрощения), тогда стандартное отклонение результатов будет меньше, чем получаемое на практике, когда в результаты вводят различные поправки, полученные в разных повторах. В этом случае s 0 необходимо откорректировать, умножив на , где n – количество усредняемых результатов повторных наблюдений, при каждом из которых выполняют все операции методики 32 измерения, а n b – количество наблюдений с холостыми пробами, по результатам которых рассчитывают поправку. Следует отметить, что в условиях промежуточной прецизионности в результаты будут внесены различные поправки на холостую пробу, поэтому корректировать стандартное отклонение не нужно (см. раздел 6.2.5). Варианты расчета приведены в примере 3, а блок-схема на рис. 2 иллюстрирует алгоритм того, как следует учитывать усреднение и введение поправки на холостую пробу. |