Пригодность аналитических методик. Руководство для лабораторий по валидации методов и смежным вопросам Под редакцией Б. Магнуссона и У. Эрнемарка
 Скачать 1.02 Mb.
|
|
Раздел Содержание изменения Дата Авторизация 1 3.4 Измененное значение расхода 1,2 л/мин 08.02.96 DGH …… А.1.3 Пересмотр Нужно следить за тем, чтобы дата применения метода всегда находилась в интервале между "датой пересмотра" и "датой следующего пересмотра", указанными в таблице. Дата пересмотра Результат пересмотра Дата следующего пересмотра Авторизация 68 А.2 Введение Во введение, при необходимости, включают комментарии, касающиеся технического содержания методики, оснований для ее разработки и т.д. Если необходима сопутствующая информация о методе, ее желательно включать в этот раздел. А.3 Название Название должно содержать информацию о типах проб, к которым можно применять данный метод, определяемых аналитах или характеристиках и принципе измерения. По возможности, название должно включать только приведенные ниже элементы. Рекомендуется следующий формат названия: Определение A {аналит или измеряемая величина} (в присутствии B {влияющие компоненты} в C {матрица} с применением D {принцип определения}. А.4 Требования безопасности Указывают все возможные источники опасности и меры предосторожности, необходимые для ее устранения. Подробно эти меры могут быть описаны в соответствующих разделах, но привлечь внимание к источникам риска и необходимым мерам предосторожности нужно здесь. Следует должным образом предупредить о любых рисках, связанных со следующим: - обращение с пробами; - обращение с растворителями, реактивами, стандартными образцами и другими материалами или их приготовление; - эксплуатация оборудования; - требования особых условий для работы, например, необходимость использовать вытяжные шкафы; - последствия выхода за установленные параметры эксперимента (пределы взрываемости). А.5 Область применения Этот раздел позволяет быстро оценить, может ли метод подойти для решения поставленной задачи и существуют ли определенные ограничения. Необходимо привести следующую информацию: - описание решаемой задачи (для чего необходим метод); - аналиты или измеряемые величины, которые можно определять с помощью данного метода; 69 - определяемая форма аналита – какие именно формы существования аналита в материале можно определить, общее или извлекаемое его содержание и т.д.; - матрицы проб, в которых может быть определен аналит; - рабочий диапазон (интервал измерения), в пределах которого можно применять метод. Его выражают через свойства лабораторной пробы например, концентрацию; - известные влияющие компоненты, которые препятствуют применению метода или ограничивают его; - оборудование, используемое в методе; - минимальный размер пробы. В пищевой отрасли [35] в качестве синонима сферы применения используют понятие "применимость" и определяют его как "аналиты, матрицы и концентрации, для которых можно удовлетворительно использовать метод анализа". А.6 (Нормативные) ссылки Этот раздел содержит перечень документов, необходимых для применения метода. Документы, которые были только источниками для разработки метода, нужно указывать в библиографии в конце документа. А.7 Определения В этом разделе приводят все определения используемых в тексте терминов, которые необходимы для его полного понимания. По возможности следует использовать определения ISO. Давайте ссылки на источники. При необходимости в раздел можно включать химические структурные формулы. А.8 Сущность метода Указывают основные этапы метода, принцип, на котором основана методика анализа. Можно представить блок-схему или причинно-следственную диаграмму. Раздел должен быть изложен так, чтобы из него можно было легко понять, как работает метод. Необходимо также объяснить принцип выполнения расчетов. Если это нужно для объяснения метода или расчетов, приводят детали соответствующих химических реакций, относящихся к методу (например, в случае применения дериватизации или титриметрии). Пример: "Концентрацию измеряют с помощью построенной по 6 точкам калибровочной кривой, по которой определяют значение концентрации, соответствующее оптической плотности пробы, вводят в него поправку на холостую пробу и умножают на коэффициент концентрирования". 70 А.9 Реакции Раздел должен содержать информацию об основных реакциях, если это необходимо для лучшего понимания текста или вычислений. С помощью уравнений реакций можно обосновать расчеты, выполняемые по экспериментальным данным, и лучше объяснить метод, особенно если имеют место несколько последовательных изменений степени окисления определяемого элемента. В случае титрования уравнения реакции особенно полезны тем, что показывают число эквивалентов в одном моле реагента. A.10 Реактивы и материалы В этом разделе приводят перечень всех реактивов и материалов, необходимых для анализа, и их основные характеристики (концентрация, плотность и т.д.). Следует указывать: • регистрационные номера CAS (при наличии); • сведения о любой опасности, связанной с образцами и реактивами, и инструкции по их утилизации; • класс реактива или его чистоту; • необходимость брать материалы для калибровки и для контроля качества из независимых партий; • детали приготовления, в том числе необходимость готовить реактивы заранее; • требования к упаковке и хранению; • срок годности исходного материала и приготовленного реактива; • необходимый состав с указанием вида концентрации или другой величины; • требования к маркировке. А.11 Оборудование Нужно описать каждую единицу оборудования и способ их соединения достаточно подробно, чтобы исключить любую неоднозначность при сборе установки. Пронумеруйте их, чтобы далее можно было ссылаться на номера. Для большей ясности можно использовать диаграммы и блок-схемы. Все проверки функционирования собранной аппаратуры необходимо описать в подразделе "Предварительный опыт" или "Пробный опыт" раздела "Выполнение измерений" (см. А.13). В разделе указывают предельно допустимые значения характеристик оборудования и требования к его верификации со ссылками на раздел "Калибровка" (см. А.13) и всю необходимую эксплуатационную документацию. В соответствующих случаях следует давать ссылки на международные стандарты или другие международно признанные документы на 71 лабораторную посуду и оборудование. В этот раздел также включают требования к средствам обеспечения надлежащих условий измерений (вытяжные шкафы и т.п.). А.12 Отбор проб Здесь подразумевается, что отбор проб охватывает как процесс отбора для получения лабораторной пробы, так и промежуточный отбор из лабораторной пробы тестового образца, из которого извлекают тестовую порцию. Если процесс отбора пробы и подготовки лабораторной пробы не зависит от химического анализа как такового, то, как правило, достаточно дать ссылку на методику, описывающую конкретно отбор пробы. Если подходящей методики не существует, раздел "Отбор проб" может содержать план и методику отбора проб, включая указания о том, как избежать изменения состава материала и учесть требования к применению статистических методов. Данный раздел должен содержать всю информацию, необходимую для приготовления тестового образца из лабораторной пробы. Укажите условия хранения, кондиционирования (предварительной обработки) и утилизации проб. Если этап отбора проб достаточно сложный, можно составить отдельный документ с пошаговыми инструкциями. А.13 Выполнение измерений Раздел должен содержать последовательное описание всех операций. Если метод уже описан в другом стандарте, тогда пишут "использовать метод, установленный ISO 12345" или "использовать один из методов, установленных ISO 12345" и указывают, при необходимости, какие-либо изменения в методе. Следует обратить внимание на операции, которые требуют особых мер предосторожности. Раздел "Выполнение измерений", как правило, включает в себя подразделы, описывающие следующие элементы и этапы методики: - тестовая порция (ее приготовление из тестовой пробы или лабораторной пробы и требуемая масса или объем); - опыты с холостыми пробами (условия и ограничения); - предварительный или пробный опыт (например, для проверки характеристик измерительного прибора); - измерение или испытание. Указывают количество измерений или испытаний (например, "повторить дважды") и подробно описывают все этапы; - калибровка. Определяют самые важные этапы аналитического процесса. Правильность их выполнения обеспечивают за счет точного следования методике и калибровки. Дают ссылки на соответствующие разделы, описанные выше. Приводят 72 указания по калибровке приборов – что нужно калибровать, как, чем и как часто. Необходимо обратить внимание на соответствующую метрологическую прослеживаемость калибраторов. А.14 Расчеты В разделе описывают, как нужно рассчитывать результаты. Приводят информацию о единицах, в которых должны быть выражены результаты измерения и другие величины; уравнение, используемое для расчета; значения символов, используемых в уравнении; количество десятичных знаков или значащих цифр, с которым должен быть представлен результат. Символы величин должны соответствовать ISO 80000 [14]. А.15 Прецизионность Если для метода проводились межлабораторные сличения, нужно привести данные по прецизионности (т.е. сходимость и воспроизводимость). Данные по прецизионности должны быть рассчитаны (и, желательно, опубликованы) согласно соответствующей части ISO 5725 или другому подходящему международному стандарту (на который нужно дать ссылку). Четко указывайте, в какой форме дана прецизионность – абсолютной или относительной, и представлена ли она в виде пределов прецизионности. А.16 Обеспечение качества и контроль качества Одним из результатов валидации должно быть описание необходимых процедур внутреннего и внешнего (проверка квалификации) контроля качества. Нужно объяснить, в какой форме выполняют контроль качества, указать частоту операций контроля качества при анализе партии, критерии приемлемости результатов, действия, которые нужно предпринять в случае отрицательного результата. Дайте ссылки на соответствующие описанные выше разделы. А.17 Особые случаи Указывают все изменения, которые необходимо вносить в методику при наличии или отсутствии определенных компонентов в продукте, подлежащем анализу. Об этих изменениях должно быть уже сказано выше в разделе "Область применения". Каждый особый случай нужно представлять под своим заголовком. А.18 Протокол испытаний Этот раздел должен содержать перечень информации, которую нужно включать в протокол испытаний. Как правило, представляют следующие данные: - ссылку на применяемый метод; 73 - результаты и, при необходимости, соответствующие показатели качества измерения (прецизионность, неопределенность, доверительный интервал), включая ссылки на раздел "Расчеты"; - какие-либо отклонения от методики; - какие-либо замеченные необычные особенности; - дата проведения испытания. А.19 Приложения Чтобы облегчить восприятие, некоторую информацию удобнее представлять в приложениях. Нужно четко указывать, является ли приложение нормативным или справочным. В приложения, например, могут быть вынесены данные, полученные при валидации метода, анализ рисков и расчет неопределенности. В последнем случае необходимо указать основные составляющие неопределенности, присущие методу, и привести их установленные значения. Следует упомянуть также несущественные составляющие, которые не были учтены в окончательном расчете. Нужно привести суммарную стандартную неопределенность и/или расширенную неопределенность и пояснить, как она была рассчитана. Более подробный расчет может содержаться в отдельном документе, на который дают ссылку. А.20 Библиография Если нужны ссылки на источники информации, их можно давать непосредственно в тексте, или, если их несколько, в библиографии в конце документа. 74 Приложение В. Статистическое обоснование расчета предела обнаружения * В "Краткой справке 2" в разделе 6.2.3 указано, что предел обнаружения (LOD) можно рассчитать путем умножения соответствующего стандартного отклонения на коэффициент, равный 3. В настоящем приложении приведено статистическое обоснование этого коэффициента. Целью определения LOD обычно является установление самой низкой концентрации аналита в пробе, которую можно обнаружить с помощью данной методики измерения с заданной доверительной вероятностью. Определение LOD состоит из двух этапов. Сначала определяют "критическое значение". Его устанавливают так, чтобы при реальном отсутствии аналита в пробе вероятность получения результата измерения, превышающего критическое значение, была не более α. Превышение критического значения является основанием для признания пробы "положительной". Вероятность ложно положительного результата обычно устанавливают на уровне α = 0,05; в таком случае критическое значение будет равно примерно 1,65s (где s – стандартное отклонение большого количества результатов, полученных на холостой пробе или пробе с низкой концентрацией аналита, а 1,65 – значение одностороннего коэффициента Стьюдента t для бесконечного числа степеней свободы и уровня значимости α = 0,05). Критическое значение удобнее всего выражать как концентрацию, хотя, в принципе, это может быть любая наблюдаемая величина, например, площадь пика. Каждый результат, превышающий критическое значение, должен быть признан положительным. Тем не менее, если бы истинное значение концентрации в пробе было точно равно критическому значению (выраженному как концентрация), то следовало бы ожидать, что примерно половина результатов измерения окажется ниже критического значения, и тогда доля ложно отрицательных результатов составит 50 %. Очевидно, что вероятность ложно отрицательного результата на уровне 50 % слишком высока для практического применения; метод не позволяет надежно получать результаты, превышающие критическое значение, если концентрация равна критическому значению. LOD определяют как такую истинную концентрацию, для которой при установленном критическом значении доля ложно отрицательных результатов будет приемлемой. Исторически сложилось так, что вероятность ложно отрицательного результата, β, обычно принимают равной вероятности ложно * Текст составлен на основе руководства Eurachem по терминологии в аналитических измерениях [8]. 75 положительного результата (IUPAC рекомендует значения по умолчанию α = β = 0,05 [49]). При α = β = 0,05 значение LOD должно на 1,65s превышать установленное критическое значение. Таким образом, при α = β = 0,05 коэффициент для расчета LOD будет равен 1,65 + 1,65 = 3,30. Это значение часто округляют, и тогда, как показано в "Краткой справке 2", LOD принимают равным 3s. Такой подход основан на некоторых аппроксимациях, описанных в литературе [49]. Множитель 3, рассчитанный в предыдущем абзаце, получен из одностороннего коэффициента Стьюдента t для бесконечного числа степеней свободы с округлением до одной значащей цифры. Для статистически строгой оценки LOD коэффициент должен учитывать число степеней свободы, связанное с оценкой s. Например, если s получают по результатам 10 повторных измерений, коэффициент Стьюдента для α = 0,05 равен 1,83 (9 степеней свободы). В этом случае LOD будет равен 3,7s. 76 Приложение С. Дисперсионный анализ (ANOVA) Основная идея, на которой основан "дисперсионный анализ" (ANOVA), состоит в следующем: если данные из совокупности результатов многократных наблюдений можно сгруппировать определенным образом, например, по исполнителям, приборам, датам, лабораториям, методам и т.д., суммарную дисперсию всей совокупности можно представить как объединение межгрупповой (s 2 ) и внутригрупповых дисперсий. ANOVA можно использовать для оценки результатов того типа экспериментального исследования, который показан на рисунке С.1. По такому "гнездовому плану" многократные измерения (как правило, в условиях сходимости) повторяют в различных сериях измерений и получают р групп данных. Для получения оценки промежуточной прецизионности по результатам такого исследования необходимо максимальное изменение условий между сериями (разные дни, разные исполнители и т.д.). Группа 1 Группа 2 Группа p x 11 ... x 1n x 21 ... x 2n x p1 ... x pn Рис. C1. Пример "гнездового плана" эксперимента, посредством которого можно оценить различные показатели прецизионности с применением ANOVA На рис. С.2 показан общий вид таблицы однофакторного ANOVA для суммарного количества результатов N в р группах с числом наблюдений n и числом степеней свободы v. Строки таблицы соответствуют отдельным составляющим дисперсии. В первой строке представлена дисперсия между среднегрупповыми значениями, во второй – внутригрупповая дисперсия и в третьей – дисперсия совокупности данных в целом. Электронные таблицы и статистическое программное обеспечение дают также значение F, критическое значение F и соответствующее значение вероятности P. Составляющие дисперсии Сумма квадратов (SS) v Средний квадрат (MS) F P F crit Межгрупповая SS b p - 1 MS b = SS b /(p-1) MS b / MS w Внутригрупповая (остатки) SS w N - p MS w = SS w /(N-p) Суммарная SS tot = SS b +SS w N - 1 Рис. С2. Структура таблицы однофакторного ANOVA 77 Показатели межгрупповой дисперсии почти всегда либо называют "межгрупповыми", либо обозначают фактором группирования (например, исполнитель, день или лаборатория). По отношению к внутригрупповой дисперсии в программном обеспечении, учебниках и т.д. используют различные термины, из которых чаще всего встречаются "внутригрупповая дисперсия", "дисперсия остатков", "дисперсия погрешности" и "дисперсия измерений". Если предположить, что "гнездовой план", представленный на рис. С.1, реализован в одной лаборатории, многократные измерения в каждой группе выполнены в условиях сходимости и условия анализа различались между группами, то сходимость и промежуточную прецизионность можно рассчитать следующим образом: 1. Стандартное отклонение сходимости s r вычисляют как квадратный корень из внутригруппового среднего квадрата, который характеризует внутригрупповую дисперсию: 2. Вклад в суммарную дисперсию от фактора группирования (s between ) также получают из таблицы ANOVA: 3. Промежуточную прецизионность s I можно рассчитать путем объединения указанных выше составляющих от внутригрупповой и межгрупповой дисперсии: Эксперимент, о котором шла речь в разделе 6.6.4, можно проиллюстрировать следующим образом. В рамках валидации метода, проведенной в одной лаборатории, выполняли повторные измерения в течение каждого из восьми дней (Таблица С1). Чтобы воспроизвести условия регулярного применения метода, в течение каждого дня измерения выполняли в условиях сходимости, но в разные дни это делали разные аналитики, использовали разное оборудование и т.д. |