Пригодность аналитических методик. Руководство для лабораторий по валидации методов и смежным вопросам Под редакцией Б. Магнуссона и У. Эрнемарка
 Скачать 1.02 Mb.
|
|
Предисловие к первому изданию В ходе кампании по распространению в Великобритании надлежащей практики аналитических измерений были сформулированы шесть принципов, совокупность которых образует "правила наилучшей практики". Этими принципами, которые более подробно описаны в отдельном руководстве, † являются: 1. "Аналитические измерения должны удовлетворять согласованным требованиям" (т.е. поставленной цели). 2. "Аналитические измерения должны проводиться с использованием методов и средств, пригодность которых для конкретного применения была проверена". 3. "Персонал, выполняющий аналитические измерения, должен быть достаточно квалифицированным и компетентным для выполнения поставленной задачи" (и продемонстрировать, что он может выполнять анализ должным образом). 4. "Должна проводиться регулярная независимая оценка технических показателей работы лаборатории". 5. "Результаты аналитического измерения, полученные в одной лаборатории, должны быть сопоставимы с результатами, полученными в других лабораториях". 6. "Организации, выполняющие аналитические измерения, должны иметь четко определенные процедуры контроля и обеспечения качества". Эти принципы в равной мере относятся как к лабораториям, работающим самостоятельно, так и к тем, чьи результаты должны быть сопоставлены с результатами других лабораторий. Основной задачей данного документа является содействие лабораториям в осуществлении принципа №2, и, соответственно, он содержит рекомендации по оценке методов испытаний с целью демонстрации их пригодности для конкретного применения. Первое издание (1998 г.) настоящего руководства было подготовлено рабочей группой Eurachem на основе проекта, предложенного LGC. Членами рабочей группы Eurachem в то время были: D. Holcombe, P. De Bièvre, D. Böttger, C. Eastwood, J. Hlavay, M. Holmgren, W. Horwitz, M. Lauwaars, B. Lundgren, L. Massart, J. Miller, J. Morkowski, B. te Nijenhuis, B. Nyeland, R. Philipp, P. Radvila, J. Smeyers-Verbeke, R. Stephany, M. Suchanek, C. Vandervoorst, H. Verplaetse, H. Wallien, M. Walsh, W. Wegscheider, D. Westwood, H. J. van de Wiel. † The manager's guide to VAM, UK Department of Trade and Industry, Valid Analytical Measurement Programme. Опубликовано как VAM Principles M. Sargent. Anal. Proc., 1995, 32, 201-202. 4 Сокращения и символы В данном руководстве использованы следующие аббревиатуры, акронимы и символы: AMC Комитет по аналитическим методам ANOVA дисперсионный анализ AOAC International всемирно признанная организация, разрабатывающая стандарты ASTM International всемирно признанная организация, разрабатывающая стандарты BIPM Международное бюро мер и весов CCQM Консультативный комитет по количеству вещества – метрологии в химии CEN Европейский комитет по стандартизации CITAC Сотрудничество по международной прослеживаемости в аналитической химии CLSI Институт клинических и лабораторных стандартов CRM аттестованный стандартный образец EA Европейское сотрудничество по аккредитации EC Европейская комиссия EPA Агентство по защите окружающей среды EQA внешняя оценка качества EU Европейский союз GUM Оценка результатов измерений. Руководство по выражению неопределенности измерений ICH Международная конференция по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных препаратов для человека IEC Международная электротехническая комиссия ISO Международная организация по стандартизации IUPAC Международный союз теоретической и прикладной химии JCGM Объединенный комитет по руководствам в метрологии LOD предел обнаружения LOQ предел количественного определения NATA Национальная ассоциация органов по испытаниям QA обеспечение качества QC контроль качества RSC Королевское химическое общество SANCO Генеральный директорат Европейской комиссии по здравоохранению и защите прав потребителей SOP стандартная операционная процедура PT проверка квалификации RM стандартный образец RSD относительное стандартное отклонение UV/VIS ультрафиолетовый/видимый VIM Международный словарь по метрологии. Основные и общие понятия и связанные с ними термины 5 b абсолютное смещение b (%) относительное смещение, % k Q коэффициент, используемый при расчете предела количественного определения m количество измерений n количество повторных результатов наблюдений, усредняемых при представлении результатов n b количество результатов холостых опытов, усредняемых при расчете поправки на холостой опыт r предел сходимости R предел воспроизводимости R (%) степень извлечения (эффективная степень извлечения), % R' (%) степень извлечения добавки, % s стандартное отклонение s 0 оценка стандартного отклонения единичных результатов для нулевой или близкой к нулю концентрации s' 0 стандартное отклонение, используемое для вычисления LOD или LOQ s I стандартное отклонение промежуточной прецизионности s r стандартное отклонение сходимости s R стандартное отклонение воспроизводимости u стандартная неопределенность среднее значение (среднее арифметическое) опорное значение среднее значение результатов измерений, полученных альтернативным методом, например, референтным методом среднее значение для образца с добавкой в эксперименте по определению степени извлечения добавленная концентрация в эксперименте по определению степени извлечения 6 1. Введение 1.1 Основание для разработки и сфера применения данного руководства Валидация методов является существенной и необходимой частью работы аналитической лаборатории. Большинство химиков-аналитиков осознают ее важность, однако не всегда понимают, почему и когда ее следует проводить и что именно при этом нужно делать. Некоторые аналитики рассматривали валидацию метода как нечто такое, что можно делать только в сотрудничестве с другими лабораториями, и, следовательно, не проводили ее. Прояснению этого вопроса способствовали требования таких стандартов, как ISO/IEC 17025 [1], ISO 15189 [2] и ISO 15195 [3]. Например, необходимость демонстрации того, что методы соответствуют поставленной задаче, содержится в п. 5.4.2 ISO/IEC 17025: "Лаборатория должна использовать методы испытаний и/или калибровки, включая методы отбора проб, которые соответствуют требованиям заказчика и которые подходят для испытаний и/или калибровок, выполняемых лабораторией ...", и далее: "Если заказчик не указывает метод, который следует использовать, лаборатория должна сама выбрать подходящие методы ...". Задача данного руководства – рассмотреть вопросы, связанные с валидацией методов, и помочь читателю лучше понять, в чем она состоит, почему важна и дать некоторое представление о том, как ее можно осуществить. Данное руководство может быть наиболее полезно для а) руководителей лабораторий, ответственных за надлежащую валидацию методов, применяемых их лабораториями, а также б) аналитиков, ответственных за планирование и выполнение исследования методов с целью их валидации. Для других сотрудников руководство может быть полезно как источник базовой информации: для старшего персонала – с точки зрения управления, для младшего – с технической и образовательной точки зрения. В руководстве рассматривается, главным образом, валидация метода в одной лаборатории. Цель руководства – нацелить читателя на ознакомление с установленными протоколами валидации, а для тех случаев, где они отсутствуют, дать доступное введение в процессы, которые охватывает валидация, и представить некоторые основные принципы, позволяющие разработать собственные подходы к валидации. Руководство содержит ссылки на дополнительные материалы по конкретным техническим аспектам валидации. Настоящее руководство посвящено валидации количественных методов. Тем не менее, некоторые принципы, описанные здесь, также применимы к качественным методам 7 обнаружения одного или более аналитов, например, понятия селективности и предела обнаружения (LOD). В руководстве не рассмотрены подробно статистические методы, хотя, несомненно, тем, кто обладает практическими навыками применения элементарной статистики, будет проще понять и реализовать процесс валидации метода. В руководстве приведены несколько ссылок на публикации по основам статистики для химиков [4, 5, 6]. У аналитиков могут возникнуть сложности в понимании валидации метода из-за того, что многие метрологические и технические термины, используемые для описания процессов оценивания метода, отличаются в разных областях применения аналитических измерений – как по значению, так и по способу их определения. Данное руководство не позволяет определить, насколько корректно использован где-то тот или иной термин, хотя оно и должно внести некоторую ясность. Лучше всего при использовании термина, который может быть истолкован неверно, сослаться на источник и принятое соглашение. Когда речь идет о валидации метода, неявным образом подразумевают, что исследования с целью определения характеристик метода * выполняют с помощью оборудования, которое соответствует техническим требованиям, исправно работает и должным образом откалибровано. В связи с этим данное руководство не касается отдельно понятий "оценка оборудования" или "оценка прибора". Аналогично считается, что аналитик, проводящий исследования, является компетентным в конкретной области и обладает достаточными специальными знаниями, чтобы принимать правильные решения по результатам, полученным в процессе исследования. 1.2 Замечания по применению данного руководства 1.2.1 Терминология При пересмотре настоящего руководства основное внимание мы уделили обновлению терминологии и библиографических ссылок, чтобы учесть изменения, произошедшие в течение пятнадцати лет после публикации его первого издания. В терминологии мы придерживались, по возможности, 3-го издания VIM, впервые опубликованного в 2007 г. [7, 8]. Чтобы отразить термины, которые обычно используют в аналитических лабораториях, дополнительно была использована, при необходимости, терминология из * Характеристики метода часто также называют "параметрами метода", "метрологическими характеристиками" и "рабочими характеристиками". 8 ISO/IEC 17025:2005 [1], других документов ISO [9, 10, 11] и Гармонизированного руководства IUPAC по валидации в одной лаборатории от 2002 г. [12],. В некоторых случаях, когда существуют несколько сходных терминов, бывает трудно решить, какой из них следует применить. Для ясности изложения было решено использовать термины однозначно во всем тексте руководстве. В качестве примера можно привести термин, которым называют документ с подробным описанием метода, подлежащего валидации с участием персонала и применением оборудования конкретной лаборатории. Для процедур количественного анализа в VIM использован термин "методика измерения", в ISO/IEC 17025 – "метод", в ISO 15189 [2] – "методика исследования", а многие лаборатории ссылаются на свои "стандартные операционные процедуры" (SOP). Рабочая группа приняла решение придерживаться стандарта ISO/IEC 17025 и использовать общий термин "метод". Таким образом, в настоящем руководстве использован общепринятый термин "валидация метода", хотя правильнее было бы говорить "валидация методики". При выборе между терминами "ruggedness" и "robustness" (оба означают "устойчивость"), а также между "selectivity" ("селективность") и "specificity" ("специфичность") [13] предпочтение было отдано первым вариантам, так как именно их использует IUPAC [12]. Работы, выполняемые в лаборатории, называют по-разному, например, "калибровка", "измерение", "испытание", "анализ" и "исследование". В настоящем руководстве в качестве общего термина использован "анализ", а при необходимости указаны конкретные особенности. Кроме того, в руководстве часто говорится об измеренной концентрации, хотя в химической лаборатории регулярно измеряют и другие величины [14]. Когда говорят об отборе проб, их подготовке и анализу, используют такие термины, как "целевой объект", "первичная проба", "инкремент", "составная проба", "промежуточная проба", "лабораторная проба", "тестовый образец", "тестовая порция" и "тестовый раствор" [15, 16]. В этом руководстве, как правило, мы используем общий термин "проба" или "тестовый образец" * [17]. Наиболее важные термины, используемые в руководстве, определены в тексте. Там, где это возможно, были приведены определения из VIM, ISO 9000 [9] и IUPAC [17, 18]. Термины из VIM, связанные с аналитической химией, дополнительно разъяснены в Руководстве Eurachem "Терминология в аналитических измерениях" [8]. Следует отметить, что до сих пор нет полного согласия в определении некоторых терминов, используемых в отношении валидации методов. * Тестовый образец – образец, приготовленный из лабораторной пробы, из которого извлекают тестовые порции для испытания или анализа [17]. 9 1.2.2 Краткие справки В разделе 6 в затемненных таблицах содержатся "краткие справки" по определению конкретных характеристик метода. Следует, однако, признать, что во многих случаях лаборатории не располагают достаточными временем и ресурсами для проведения столь тщательных экспериментов. Выполнение операций, описанных в этих таблицах, с меньшим количеством повторов позволит все же получить полезную информацию и, конечно, это лучше, чем ничего не делать совсем. Тем не менее, эта информация будет менее надежна, чем полученная при полном количестве повторов. 10 2. Что такое валидация метода? 2.1 Определения Определения валидации, взятые из трех международных документов, приведены в таблице 1. Таблица 1. Определения понятия "валидация" в ISO 9000, ISO/IEC 17025 и VIM Определение Ссылка Подтверждение путем предоставления объективных доказательств того, что требования, установленные для конкретной задачи или применения, были выполнены ISO 9000 [9] a Подтверждение путем исследования и предоставления объективных доказательств того, что определенные требования, установленные для конкретного применения, выполняются. ISO/IEC 17025 [1] Верификация, при которой установленные требования соответствуют предполагаемому применению. VIM [7] b а ISO 9000 определяет "процесс квалификации" как "процесс демонстрации способности выполнить установленные требования". b VIM определяет "верификацию" как "предocтавление объективных доказательств того, что данный объект соответствует установленным требованиям". Валидация метода – это по сути своей процесс установления аналитических требований и подтверждения того, что возможности рассматриваемого метода соответствуют поставленной задаче. Неотъемлемой частью этого является оценивание характеристик метода. Важным моментом в данном определении является оценка пригодности метода; в прошлом валидация метода, как правило, сводилась только к оцениванию его характеристик. Принято считать, что валидация очень тесно связана с разработкой метода. Действительно, многие характеристики метода (Таблица 2), определяемые при валидации, обычно оценивают, хотя бы приблизительно, в ходе его разработки. Тем не менее, следует помнить о необходимости формальной валидации окончательного варианта метода (документированной методики). В некоторых отраслях используют понятия "первичная валидация" и "вторичная валидация", последнее – в смысле верификации [19]. Понятия "квалификация" и "метрологическое подтверждение" [20] также, по всей видимости, охватывают верификацию (см. таблицу 1). 11 Таблица 2. Перечень характеристик, которые, как правило, оценивают при валидации метода Характеристики Селективность Предел обнаружения (LOD) и предел количественного определения (LOQ) Рабочий диапазон Аналитическая чувствительность Правильность • смещение, степень извлечения Прецизионность • сходимость, промежуточная прецизионность и воспроизводимость Неопределенность измерений а Устойчивость (робастность) а Строго говоря, неопределенность измерения является не характеристикой конкретной методики измерения, а свойством результатов, полученных с помощью этой методики. 2.2 В чем разница между валидацией и верификацией? ISO 9000 [9] определяет верификацию как "подтверждение путем предоставления объективных доказательств того, что установленные требования были выполнены". Это очень близко к определению валидации из Таблицы 1. Согласно VIM [7], верификация – это "предоставление объективных доказательств того, что данный объект соответствует установленным требованиям", а валидация – это "верификация, при которой установленные требования соответствуют предполагаемому применению". Лаборатория может воспользоваться валидированной методикой, которая, например, была опубликована как стандарт, или приобрести для конкретного применения готовую измерительную систему у производителя. В обоих случаях основная работа по валидации уже была выполнена, но лаборатория все равно должна подтвердить свою способность применять метод. Такое подтверждение является верификацией. Это значит, что нужно выполнить некоторые эксперименты, которые подтвердят, что метод нормально работает в лаборатории конечного пользователя. Тем не менее, объем работ, по всей вероятности, будет значительно меньшим по сравнению с валидацией метода, разработанного в лаборатории. Термины "валидация" и "верификация" также рассмотрены в руководстве Eurachem по терминологии аналитических измерений [8]. 12 3. Почему необходима валидация метода? 3.1 Важность аналитических измерений Каждый день в тысячах лабораторий по всему миру выполняют миллионы испытаний, измерений и исследований. Существует множество причин для их проведения, например: оценка товара в торговых целях; потребности здравоохранения; проверка качества питьевой воды, пищевых продуктов и кормов; анализ элементного состава сплава в целях подтверждения его пригодности для применения в авиастроении; судебная экспертиза биологических жидкостей в уголовных делах. Практически все аспекты жизни общества тем или иным образом связаны с аналитическими исследованиями. Стоимость этих измерений высокая, а решения, принятые на основании полученных результатов, могут вызвать дополнительные затраты. Например, следствием испытаний, в результате которых продукты питания были признаны непригодными для употребления, может быть иск о компенсации ущерба; исследование, подтвердившее наличие запрещенных препаратов, может повлечь за собой штраф, тюремное заключение, а в некоторых странах – даже смертную казнь. Совершенно очевидно, насколько важно корректно выполнить измерение и быть в состоянии доказать правильность полученных результатов. 3.2 Профессиональный долг химика-аналитика Если результатам исследования нельзя доверять, значит, пользы от него мало, и его можно было вообще не проводить. Когда лаборатории поручают аналитическое исследование, исходят из того, что она имеет уровень компетентности, которым сам заказчик не обладает. Заказчик предполагает, что он может доверять представленным результатам, и, как правило, ставит их под сомнение лишь тогда, когда возникают разногласия. Таким образом, лаборатория и ее персонал бесспорно обязаны оправдать доверие заказчика, дав правильный ответ на аналитическую часть задачи, или, другими словами, результаты, для которых можно продемонстрировать "пригодность для конкретного применения". Это подразумевает, что испытания, выполненные лабораторией, соответствуют аналитической части задачи, которую желает решить заказчик, и что в окончательном протоколе результаты анализа представлены таким образом, что заказчик может их легко понять и сделать на их основании соответствующие выводы. Валидация метода позволяет химикам продемонстрировать его "пригодность для конкретного применения". Чтобы аналитический результат соответствовал поставленной цели, он должен быть достоверным до такой степени, чтобы на его основании можно было уверенно принимать 13 решение. Таким образом, характеристики метода должны быть подтверждены, а неопределенность результата – оценена с заданным доверительным уровнем. Способы оценки и представления неопределенности должны быть общепризнанными, внутренне непротиворечивыми и легко понятными [21]. Бóльшая часть информации, необходимая для оценки неопределенности, может быть получена при валидации метода. Этот вопрос кратко рассмотрен в разделе 6.7 и более подробно – в руководстве Eurachem/CITAC "Количественная оценка неопределенности в аналитических измерениях" [22]. Как бы ни был метод совершенен, а персонал – квалифицирован, аналитическая задача может быть решена путем анализа проб только при условии, что эти пробы отобраны в соответствии с поставленной задачей. Правильный отбор проб – это работа, требующая высокой квалификации, понимания конкретной задачи и связанных с ней разделов химии. В рамках поддержки заказчиков лаборатории должны, по возможности, давать им рекомендации по отбору проб. Здесь, конечно, речь идет о случаях, когда сами лаборатории не могут отбирать пробы или каким-либо образом влиять на отбор проб. В этих случаях результаты анализа будут относиться к пробам, которые предоставил лаборатории заказчик, и этот момент должен быть четко отражен в протоколе. Понятно, что основное внимание мы уделили основной цели валидации метода, т.е. демонстрации того, что метод "пригоден для конкретного применения". Тем не менее, следует отметить, что исследования в процессе валидации метода приносят дополнительную пользу лаборатории, проводящей валидацию. Они позволяют приобрести прочные знания и практические навыки реализации метода, в том числе понимание всех критически важных этапов процесса. Валидация добавляет лаборатории и ее персоналу уверенности в полученных результатах. 3.3 Разработка метода Валидации предшествует стадия разработки, в которой может участвовать различный персонал и которая может принимать разные формы. Один крайний случай – это адаптация существующего метода путем внесения незначительных изменений, которые позволяют применить его для решения новой задачи. Например, метод определения толуола в воде может быть разработан путем адаптации стандартизованного метода определения бензола в воде. Матрица здесь одна и та же, а свойства этих двух аналитов во многом сходны. Вполне вероятно, что принципы отделения, идентификации и количественного определения, применяемые к бензолу, можно также применить к толуолу. С другой стороны, если нужно определять бензол в почве, адаптация метода определения бензола в воде может быть не лучшим вариантом. Возможно, для 14 определения органических веществ в почве лучше было бы взять за основу какой-то другой метод. В другом крайнем случае химик-аналитик может начать с некоторых общих идей и, применив свои знания и опыт, разработать подходящий метод. Ясно, что это потребует гораздо больших усилий, а степень уверенности в успехе разработки будет значительно меньшей. Довольно часто при разработке метода одновременно рассматривают нескольких вариантов и в итоге выбирают из них наилучший. Независимо от того, сколько усилий вложено в процесс разработки метода, нет никакой гарантии, что он будет работать нормально во время валидации (или в обычных условиях в конкретной лаборатории). Если в разработке и валидации участвуют разные сотрудники, это позволяет проверить, насколько инструкции (методика измерения) понятны и могут быть реализованы на практике. 15 4. Когда методы нужно валидировать или верифицировать? 4.1 Валидация метода Метод валидируют, когда необходимо убедиться в том, что его характеристики подходят для конкретного применения. Например, в п. 5.4.5.2 ISO/IEC 17025 [1] указано, что лаборатория должна валидировать: - нестандартные методы; - методы, созданные/разработанные в лаборатории; - стандартные методы, используемые вне их установленной сферы применения; - расширения и модификации стандартных методов. Объем работ по валидации должен быть достаточным для выполнения требований, связанных с определенной задачей или применением [23]. Степень ("масштаб", "область распространения") валидации зависит от конкретного применения, характера внесенных изменений и условий, в которых метод будут применять. Валидация также необходима, когда нужно подтвердить эквивалентность результатов, полученных двумя методами, например, вновь разработанным и существующим стандартным/нормативным. 4.2 Верификация метода Если лаборатория использует стандартные (стандартизованные) методы, например, опубликованные ISO или ASTM, она может не делать их валидацию. Тем не менее, лаборатория должна проверить ("верифицировать") характеристики метода согласно п. 5.4.2 ISO/IEC 17025: "... Лаборатория должна подтвердить, что она может правильно использовать стандартные методы, прежде чем приступить к испытаниям или калибровке". Верификация также необходима при внесении существенных изменений, например, при замене прибора на аналогичный новый, перемещении оборудования и т.д. В лабораторной медицине большинство измерений и испытаний выполняют с помощью серийных методик, которые уже были валидированы производителем, но которые должен проверить конечный пользователь [24]. В ISO 15189 [2] подчеркнуто, что "методики исследования, используемые без изменений, подлежат независимой верификации лабораторией перед введением их в повседневное использование". Это также относится к тем случаям, когда в приборе обновлено программное обеспечение или когда при контроле качества установлено, что характеристики применяемого метода изменяются со временем. 16 5. Как делают валидацию методов? 5.1 Кто выполняет валидацию методов? 5.1.1 Подходы к валидации методов По завершении начального этапа разработки метода лаборатория должна составить детальный документ на методику измерения (см. Приложение А). Именно эта изложенная в документе методика является объектом формальной валидации. Есть два основных подхода к валидации метода: валидация с помощью межлабораторных сличений и валидация в одной лаборатории. Независимо от подхода, ответственной за обеспечение соответствия метода поставленной задаче и, при необходимости, проведение дальнейших работ с целью получения новых данных в дополнение к имеющимся результатам валидации является лаборатория, применяющая этот метод. 5.1.2 Межлабораторная валидация Валидации метода путем специально организованных межлабораторных сличений, которые часто называют "совместными исследованиями" ("collaborative studies") или "коллективными исследованиями" ("cooperative studies"), посвящено множество публикаций. Существует ряд документов, относящихся к такого рода валидации [25, 26, 27, 28], а также стандарты ISO 5725 [29], которые можно считать наиболее общеприменимыми. Когда разрабатывают метод для широкого применения, который, возможно, будет опубликован как стандартная методика, тогда, очевидно, предпочтительным способом проведения валидации является совместное исследование с участием группы лабораторий. С помощью такой валидации будет подтверждена устойчивость стандартного метода. Опубликованная информация обычно содержит оценки прецизионности (сходимость, воспроизводимость и/или соответствующие пределы прецизионности) и, в некоторых случаях, смещения. Если метод валидирован организациями, которые издают стандарты, например, ISO, CEN или АОАС International, пользователю, как правило, достаточно проверить опубликованные данные по характеристикам и/или установить характеристики метода для собственного применения. Следовательно, при таком подходе снижаются трудозатраты лаборатории, которая использует метод. 17 5.1.3 Валидация в одной лаборатории В практике лабораторий случаются ситуации, когда нужно применить какой-либо метод, но он отсутствует в виде опубликованного стандарта. Если метод разработан для применения в одной лаборатории, например, из-за отсутствия общего интереса к данному методу или из-за того, что другие лаборатории являются конкурентами, тогда оправданной будет валидация в одной лаборатории [12]. Возможность применения методов, валидированных в одной лаборатории, для регуляторных целей зависит от действующих руководящих документов, касающихся определенной области измерений. Как правило, официальное разъяснение может дать соответствующий регуляторный орган. 5.2 Объем валидационных исследований Лаборатория должна определить, какие характеристики нужно исследовать для валидации метода (см. таблицу 2 и раздел 6) и, в некоторых случаях, насколько тщательно нужно исследовать каждую характеристику. В Протоколе IUPAC [12] перечислен ряд ситуаций с учетом, среди прочего, статуса метода и компетентности лаборатории. Если сфера аналитических работ четко определена и выполняемые задачи все время одни и те же, организация или подразделение могут издавать общие рекомендации по объему валидационных исследований. В таблице 3 приведен пример из фармацевтической отрасли. Хорошей основой для планирования валидации может быть внимательное рассмотрение аналитических требований, приведенных в разделе "Область применения" документа на методику (см. А.5 в Приложении А), но следует признать, что на практике проверить их полностью не всегда возможно. Оценка характеристик метода может быть ограничена различными факторами. Это признано в ISO/IEC 17025, п. 5.4.5.3: "Валидация - это всегда компромисс между затратами, риском и техническими возможностями". В рамках накладываемых ограничений лаборатория должна сделать максимум возможного, принимая во внимание требования заказчиков и нормативных документов, накопленный опыт применения метода, имеющиеся технические средства (раздел 5.4), а также необходимость в метрологической совместимости [7] с другими подобными методами, которые уже использует эта или другие лаборатории. Некоторые характеристики могут быть приблизительно определены в ходе разработки метода или его внедрения. Часто из определенной совокупности экспериментов можно получить данные о нескольких характеристиках, и тогда рациональное планирование позволит избежать излишней затраты усилий на получение необходимой информации. 18 Таблица 3. Объем валидации для четырех типов аналитических задач. Пример взят из фармацевтической отрасли [13]. Значком 'x' отмечены характеристики, обычно определяемые при валидации Характеристики Тип аналитической задачи Обнаружение Количественное определение примесей Проверка на соответствие предельному содержанию примесей Количест- венное определение основного компонента Селективность Х Х Х Х Предел обнаружения Х Предел количественного определения Х Рабочий диапазон, включая линейность Х Х Правильность (смещение) Х Х Прецизионность (сходимость и промежуточная прецизионность) Х Х Примечание. Таблица упрощена и адаптирована к структуре и терминологии, используемой в настоящем руководстве. Рассмотреть ограничения, о которых шла речь выше, особенно важно в тех случаях, когда метод не предполагают использовать регулярно. Процесс валидации методов, применяемых на регулярной основе, описан сравнительно хорошо. Очевидно, что к эпизодическим анализам применимы те же принципы, что и к регулярным. Полученные результаты должны обладать должным уровнем достоверности. Достичь баланса между затратами времени и средств, с одной стороны, и необходимостью валидации – с другой, довольно сложно. В некоторых случаях имело бы смысл передавать выполнение анализов в другую лабораторию, которая делает их регулярно. 5.3 Программа и протокол валидации Валидацию нужно выполнять и представлять ее результаты в соответствии с документированной процедурой. Требования к программе валидации и форме протокола могут быть приведены в отраслевых руководящих документах (см. 5.5). Минимальные требования к документам по валидации могут устанавливать национальные органы по аккредитации [23]. Простой шаблон для объединенных программы валидации и протокола валидации может состоять, например, из следующих разделов. 19 • Название. В этом разделе нужно указать метод, а также – кто и когда выполняет эту работу. Следует дать краткую информацию о сфере применения метода и краткое его описание, а также привести сведения о статусе метода (например, международный стандарт, метод, разработанный в лаборатории и т.д.), аналите, измеряемой величине, единице измерения, типах проб и назначении. Отбор проб и промежуточных проб может быть частью методики измерения, и в таких случаях эти операции нужно валидировать. Даже если эти этапы валидации выполняют в другом месте, информацию о них целесообразно включать в программу/протокол валидации. • Планирование. В этом разделе следует указать цель, например: полная валидация нового метода, верификация характеристик стандартизированного метода, расширение области применения метода и т.д. Необходимо указать объем работ по валидации, т.е. перечень характеристик, которые будут исследованы, а также какие- либо сопутствующие требования. • Характеристики. В этом разделе должно быть дано краткое пояснение характеристик, повторно приведены конкретные требования, описание планируемых экспериментов и методов оценки результатов. Должны быть приведены результаты и выводы по результатам экспериментов. Каждую характеристику описывают в отдельном пункте. • Выводы. В последнем разделе должны быть подытожены работы по валидации и результаты исследований. Могут быть представлены выводы относительно регулярного применения метода, внутреннего и внешнего контроля качества. И что наиболее важно, здесь должен быть заключительный вывод о пригодности метода для конкретного применения. Отметим, что такое требование есть в ISO/IEC 17025 [1]. 5.4 Средства валидации 5.4.1 Холостые образцы Используя различные типы холостых образцов, можно оценить, какая часть измеренного сигнала обусловлена наличием аналита, а какая – другими причинами. Существуют различные типы холостых образцов: • холостые реактивы : реактивы, используемые в процессе анализа (в т.ч. растворители, применяемые для экстрагирования или растворения), анализируют, чтобы определить, дают ли они вклад в измерительный сигнал. Холостой реактив, к которому применяют аналитическую методику в целом, иногда называют "холостым образцом методики" ("procedural blank") 20 • холостые пробы: это, по существу, матрица пробы, в которой отсутствует аналит, например, проба мочи человека, не содержащая определенного вида наркотиков, или проба мяса без остаточных гормонов. Холостые пробы иногда трудно получить, но такие материалы необходимы для правильной оценки возможного влияния матрицы на результаты анализа проб. 5.4.2 Рутинные исследуемые пробы Рутинные (обычные) исследуемые пробы полезны тем, что с их помощью можно получить значения характеристик прецизионности, влияния матрицы и т.д., которые могут реально иметь место при регулярном применении метода. Если содержание аналита в исследуемом материале точно известно, его можно использовать для оценки смещения результатов измерения. Точную оценку содержания аналита можно получить с помощью референтного метода, хотя такие методы не всегда существуют. 5.4.3 Материалы/растворы с добавками Это материалы или растворы, в которые преднамеренно добавляют определяемый аналит (аналиты). Эти материалы и растворы могут уже содержать определяемый аналит, поэтому необходимо обращать внимание на то, чтобы после внесения добавки содержание аналита не выходило за пределы рабочего диапазона метода. Добавление известного количества аналита позволяет измерить соответствующее увеличение выходного сигнала и рассчитать его отношение к добавленному количеству, несмотря на то, что абсолютное количество аналита до и после внесения добавки не известно. Следует отметить, что в большинстве вариантов метода добавки аналит вносят таким образом, что он будет связан с матрицей пробы не так сильно, как в реальных образцах. Следовательно, можно ожидать, что оценки смещения, полученные методом добавок, будут слишком оптимистичными. Добавкой не обязательно должен быть только определяемый аналит. Это могут быть любые компоненты, добавляемые в пробу для оценки их влияния. Например, в пробу можно добавлять разное количество некоторого компонента, чтобы выяснить, какая его концентрация отрицательно скажется на определении аналита. Очевидно, что необходимо указывать природу добавки. 5.4.4 Материалы со связанными добавками Это материалы, для которых определяемый аналит может быть по природе своей чужеродным, но его вводят в материал в определенный момент, предшествующий отбору пробы. Следовательно, аналит будет более тесно связан с матрицей, чем в случае его 21 внесения в виде обычной добавки. Содержание аналита будет зависеть от количества аналита, контактирующего с материалом, скорости поглощения и выделения его матрицей и любых других потерь вследствие обмена веществ, спонтанного распада или других химических и физических процессов. Полезность проб со связанными добавками для валидации зависит от того, насколько точно можно определить содержание аналита. Ниже приведены примеры применения связанных добавок. 1. Гербициды в муке из зерновых, опрысканных гербицидами в процессе роста. 2. Активные ингредиенты в фармацевтических препаратах, добавленные в процессе приготовления. 3. Порошок яичного белка (с известным содержанием белка), добавленный перед выпечкой в тесто для печенья при исследовании аллергенов. 5.4.5 Эталоны Если в текстах на английском языке вам встретился термин "standard" или вы сами его употребляете, нужно быть внимательным, поскольку он может означать как документ – стандарт, например, стандарт ISO, так и эталон. Когда речь идет о веществах, используемых для калибровки или идентификации, их лучше называть "measurement standards" (эталоны) или "calibrants/calibrators" (калибраторы) [7]. Обычно в таких случаях подразумевают растворы одного вещества, но на практике это может быть любой объект, конкретный параметр или свойство которого определены в достаточной мере, чтобы он мог служить в качестве метрологической основы для сравнения. Важно различать стандартные образцы (reference materials, RM) и аттестованные стандартные образцы (certified reference materials, CRM) [7, 30], учитывая существенное отличие в возможностях их применения в процессе валидации метода (6.5.2). Стандартным образцом может быть практически любой образец, используемый в качестве основы для сравнения, в частности, лабораторные реактивы известной чистоты, промышленные реактивы или другие объекты. Интересующие нас свойство или содержание аналита должны быть стабильными и однородными, но образец не обязательно должен иметь такой высокий уровень характеризации, метрологической прослеживаемости, неопределенности и документации, как аттестованные стандартные образцы. Аттестованное значение параметра для аттестованного стандартного образца, как правило, определяют более строго, чем для стандартного образца, и, кроме того, это значение устанавливают с документированной метрологической прослеживаемостью и неопределенностью. Характеризацию образца обычно проводят с использованием нескольких различных методов или одной первичной методики измерения, чтобы, насколько 22 это возможно, уменьшить или даже устранить какое-либо смещение аттестованного значения. Для оценки смещения нужна надежная основа для сравнения, желательно, аттестованный стандартный образец с той же матрицей и концентрацией аналита, что и в тестовых образцах. 5.4.6 Статистика Статистические методы необходимы для обобщения данных и для вынесения объективных суждений о различиях между наборами данных (проверка на значимость). Аналитики должны владеть, по крайней мере, основными элементами статистической теории, необходимыми, в частности, для оценки прецизионности, смещения, линейного диапазона, предела обнаружения (LOD), предела количественного определения (LOQ) и неопределенности измерений. Сведения о некоторых полезных изданиях, посвященных применению статистики в аналитической химии, приведены в разделе "Библиография" [5, 6, 31, 32, 33, 34]. 5.5 Требования к валидации Требования к тому, как нужно проводить валидацию метода, могут быть изложены в руководствах для конкретных секторов, где применяется определенный метод [например, 13, 25, 35]. Если такие требования существуют, желательно их выполнять. Это гарантирует уверенность в том, что специальную терминологию, относящуюся к валидации, а также применяемую статистику вы интерпретируете так, как это принято в соответствующем секторе. Для официального признания метода может потребоваться определение его характеристик путем совместного исследования. 5.6 Процесс валидации метода Получив конкретное задание от заказчика, лаборатория должна сначала установить аналитические требования, т.е. определить, какими должны быть характеристики метода, чтобы можно было выполнить это задание (рис. 1). Исходя из этих требований, лаборатория должна выбрать подходящий имеющийся метод или, если это необходимо, разработать/модифицировать метод. Отметим, что некоторые руководящие документы могут содержать требование о применении конкретного метода. В таблице 4 показаны вопросы, которые могут быть поставлены при формулировании аналитических требований (колонка 1), и соответствующие характеристики метода, которые, возможно, нужно будет определить (колонка 2). Далее лаборатория 23 выбирает нужные характеристики, определяет их значения и сопоставляет с аналитическими требованиями. Процесс валидации заканчивается заключением о соответствии или несоответствии аналитическим требованиям. Если аналитические требования не выполнены, нужно продолжить разработку метода. Этот процесс разработки и оценки продолжается до тех пор, пока метод не будет признан соответствующим поставленным требованиям. В действительности аналитические требования редко согласуют заранее с заказчиком таким формальным образом. Обычно у заказчиков есть свои требования к затратам средств и/или времени, и в редких случают они знают, какими должны быть характеристики методов, хотя требования к характеристикам могут быть известны, когда методы используют для проверки соответствия регуляторным требованиям или техническим условиям. Например, Европейский союз опубликовал требования к анализу питьевой воды [36], анализам, выполняемым согласно водной рамочной директиве [37], определению уровня остатков ветеринарных препаратов в пищевых продуктах животного происхождения [38] и остатков пестицидов в продуктах питания и кормах [39]. Тем не менее, аналитику, как правило, приходится самому решать, какими должны быть характеристики метода. Очень часто в таких случаях аналитические требования устанавливают в соответствии с известными характеристиками метода (например, приведенными в стандартизированных методах, полученными при проверке квалификации или оцененными с помощью математических моделей, таких как функция Хорвица [40]). Из-за финансовых ограничений разработка метода, который удовлетворял бы определенным аналитическим требованиям, может оказаться экономически нецелесообразной, и тогда нужно либо снизить требования до достижимого уровня, либо пересмотреть основания для проведения анализа. 24 Исходя из задания от заказчика, установить аналитические требования Выбрать/изменить существующий метод или разработать новый метод Рис. 1. Процесс валидации метода: от задачи, поставленной заказчиком, до решения лаборатории о том, возможно ли удовлетворить запрос заказчика с помощью определенного метода. Примечание: валидация метода включает этап, на котором оценивают характеристики и затем сравнивают их с аналитическими требованиями. Независимо от уже имеющихся, возможно, данных по характеристикам метода, его пригодность к применению будет определяться тем, какие характеристики получает конкретный аналитик на имеющихся приборах/оборудовании. Да Метод пригоден для конкретного применения ? Нет Снизить аналитиче- ские тре- бования? Нет Дальней- шая разработка возможна? Да Да Нет Метод можно применять Метод нельзя применять Указать новые аналитические требования Оформить протокол валидации Продолжить разработку метода Определить характеристики метода |