|
|
Учебно-методическое пособие. Учебнометодическое пособие для самоподготовки и самостоятельной работы студентов лечебного факультета по микробиологии, вирусологии
Занятие 1
Микроорганизмы являются возбудителями инфекционных болезней, которые часто встречаются в практике врача. Для того чтобы правильно поставить диагноз инфекционного заболевания, необходимо хорошо знать морфологию микробов, их основные формы, уметь различать их под микроскопом. Каждый врач должен владеть методом микроскопии, для чего необходимо знать устройство микроскопа и правила работы с ним.
Цель самоподготовки
После самостоятельного изучения темы студент должен знать:
- предмет и задачи микробиологии;
- основные этапы исторического развития микробиологии;
- положение микроорганизмов среди других живых существ, принципы их классификации, основные группы микроорганизмов; основные формы бактерий,
- принцип и правила микроскопии с иммерсионным объективом;
- усвоить принцип тёмнопольной, фазово-контрастной, люминесцентной и электронной микроскопии;
принципы организации и назначение бактериологической, вирусологической, серологической лабораторий,
оснащение лаборатории и рабочего места бактериолога,
правила работы на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии.
Исходный уровень знаний
Для усвоения материала темы необходимо знать:
- устройство оптического микроскопа, принцип его работы, разрешающую способность;
- преломление света, показатель преломления среды,
- устройство и принцип работы тёмнопольного и фазово-контрастного микроскопов;
- устройство и принцип работы люминесцентного микроскопа;
- устройство и принцип работы электронного микроскопа;
- принципы разделения живых существ на эукариотов и прокариотов.
Цель занятия
Ознакомиться с принципами организации и оборудования бактериологической, вирусологической и серологической лабораторий.
Приобрести навыки соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности в бактериологической лаборатории.
Ознакомиться с основными типами микроскопии, их значением. Овладеть микроскопическим методом исследования.
Ознакомиться с основными формами бактерий.
Получить чёткое представление о положении микробов среди живых организмов и принципах их классификации.
Научится готовить микропрепараты бактерий и окрашивать их простым методом.
План изучения темы
1. Микробиология: определение предмета, отрасли микробиологии, методы исследования, задачи медицинской микробиологии, связь с другими науками, основные разделы.
2. Место бактерий среди других микроорганизмов, размеры, основные формы.
3. Методы изучения морфологии бактерий, простые методы окраски, основные красители.
4. Специальные методы микроскопии.
После изучения темы студент должен уметь
1. Готовить фиксированные препараты из культур микроорганизмов, растущих на плотных питательных средах.
2. Окрашивать препараты простыми методами.
3. Проводить микроскопию с иммерсионной системой микроскопа
4. Дифференцировать микроорганизмы по морфологическим, тинкториальным свойствам и интерпретировать полученные результаты.
ПРАВИЛА ДЛЯ СТУДЕНТОВ, РАБОТАЮЩИХ НА КАФЕДРЕ МИКРОБИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ, ИММУНОЛОГИИ
Работа на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и в бактериологической лаборатории требует строгого соблюдения специальных правил, так как исследования проводятся с использованием культур патогенных микроорганизмов и заразного материала от больных и экспериментальных животных. Соблюдение этих правил необходимо для обеспечения как личной безопасности, так и безопасности окружающих.
1. Студенты должны приходить на кафедру в халатах, шапочках, иметь сменную обувь. Категорически запрещается работать в учебных лабораториях без халатов и шапочек, выпускать из-под спецодежды волосы, воротнички, курить, принимать напитки и пищу, пользоваться мобильной связью.
2. Каждый студент имеет постоянное рабочее место в лаборатории. Из личных вещей студента на рабочем месте допускается наличие только рабочей тетради, в которой делаются записи и зарисовки. Ничего лишнего (в том числе учебников и других книг) на рабочем столе не должно быть.
3. С собой нужно иметь: тетрадь для ведения дневника работы, тетрадь для тестовых заданий, цветные карандаши. Не разрешается вести записи красными чернилами или пастой.
4. До начала работы необходимо проверить рабочее место, состояние микроскопа, о недостатках сообщить дежурным студентам и преподавателю.
5. Работать аккуратно, экономно расходовать материалы и реактивы, по окончании работы гасить спиртовку. Необходимо проявлять максимальное внимание ко всем этапам работы с культурами и заражёнными микробами животными. Во время проведения посевов и приготовления мазков не разговаривать и не ходить по лаборатории. Все пробирки и чашки с посевами должны быть промаркированы. В случае загрязнения заразным материалом поверхности стола и других предметов, кожи рук и лица - обработать дезинфицирующим раствором и немедленно сообщить о случившемся преподавателю. Использованные пипетки, предметные и покровные стекла, шпатели, ватные тампоны необходимо помещать в сосуды с дезинфицирующим раствором (пипетки – при полном погружении). Пинцеты, бактериальные петли, иглы после работы с исследуемым материалом необходимо прожигать в пламени горелки.
6. В конце занятия привести в порядок рабочее место. Все предметы на рабочем столе разместить в том порядке, в каком они были до работы. Отработанный материал (культуры, микробный материал и др.) поместить в бикс для обеззараживания путём автоклавирования. Микроскоп привести в порядок и поместить в шкаф. Вылить в специальную ёмкость воду из лотков, обработать при необходимости руки дезинфицирующим раствором и вымыть их с мылом.
ОБЯЗАННОСТИ ДЕЖУРНОГО
1. Дежурные получают от лаборанта всё необходимое для работы, проверяют, всё ли в порядке.
2. Устраняют все недостатки, возникающие в процессе работы.
3. Собирают у студентов посевы, ставят в термостат; использованные посевы сдают лаборанту для обеззараживания путём автоклавирования.
4. По окончании работы следят за тем, чтобы все рабочие места были приведены в порядок, микроскопы протерты и поставлены на место.
5. Сдают лабораторию лаборанту.
Дополнительный материал к занятию
Методы обеззараживания отработанного материала
и контаминированных патогенными микробами объектов
внешней среды
Использованные в работе предметные стекла, пипетки, стеклянные шпателя и металлические инструменты немедленно после работы помещают в стеклянные банки с дезинфицирующим раствором (3% раствор хлорамина), которые должны находиться на рабочем столе.
Посуда, в которой выращивались микроорганизмы (чашки, пробирки, флаконы), складываются в биксы для обеззараживания путём автоклавирования.
Рабочее место по окончании работы подлежит уборке с применением дезинфицирующих средств. Используют более концентрированные растворы, чем для обработки рук, - 5% раствор хлорамина. Пинцетом берут кусочек ваты, смоченной дезинфицирующим раствором, и протирают поверхность стола на рабочем месте.
Мероприятия при возникновении аварии
Объём мероприятий по ликвидации аварии зависит от характера выполняемой работы, вида и свойств возбудителя, масштабов аварии:
- авария с разбрызгиванием патогенных биологических агентов (ПБА), т.е. с образованием аэрозоля (бой пробирок, флаконов или колб с жидкой культурой; бой чашек и пробирок с культурами на агаре с конденсатом; разбрызгивание бактериальной суспензии из пипетки или шприца; разбрызгивание тканевой жидкости при вскрытии трупов заражённых животных, а также другие аварии, ведущие к контаминации воздуха или окружающих предметов, например, авария при транспортировании ПБА в автоклавную и между подразделениями);
- авария без разбрызгивания ПБА (касание петлей с инфицированным материалом края чашки, пробирки, флакона, кристаллизатора, трещина на чашке Петри, пробирке, флаконе с биологическим материалом, падение на стол твёрдой частицы при обжигании петли после посева, касание поверхности посева на твёрдой питательной среде и т.п.);
- авария, связанная с нарушением целостности кожных покровов.
В подразделении, проводящем работу с ПБА, в специально отведённом месте хранят гидропульт (автомакс), комплекты рабочей (для переодевания пострадавших) и защитной (для сотрудников, ликвидирующих последствия аварии) одежды, аварийную аптечку.
В состав аварийной аптечки входит: спирт этиловый 70% (два флакона по 100 мл), 2 - 3 навески перманганата калия для приготовления 0,05% раствора (0,0125 г перманганата калия + 25 мл воды), стерильная дистиллированная вода, 5% настойка йода, ножницы с закруглёнными браншами, перевязочные средства (вата, бинты и пр.), жгут и нашатырный спирт.
Кроме вышеперечисленного в аптечке подразделений, проводящих вирусологические исследования, должны быть 1% раствор борной кислоты, интерферон или индуктор интерферона; в аптечке подразделения, проводящего микологические исследования - 1% раствор борной кислоты или навески для приготовления раствора (0,25 г борной кислоты + 25 мл воды).
Порядок действий при возникновении аварийной ситуации.
При аварии с разбрызгиванием ПБА:
- все находящиеся в помещении лица немедленно прекращают работу и, задержав дыхание, выходят из заразного помещения в предбокс, плотно закрывают дверь, включают аварийную сигнализацию и сообщают о случившемся руководителю подразделения;
- руки обрабатывают дезинфицирующим раствором или спиртом; если лицо не было защищено, то его обильно обрабатывают 700 этиловым спиртом;
- слизистые глаз, носа и рта обрабатывают препаратами из аварийной аптечки; рот и горло прополаскивают 700 этиловым спиртом, в нос закапывают раствор марганцовокислого калия 1:100000 или 1% раствор борной кислоты, а при аварии с вирусами затем закапывают интерферон или индуктор интерферона;
- защитную одежду снимают, погружают в дезинфицирующий раствор или помещают в бикс (бак) для автоклавирования;
- открытые части тела протирают 700 этиловым спиртом;
- в глаза (можно и в нос) закапывают растворы антибиотиков или других средств, к которым чувствителен возбудитель;
- принимают гигиенический душ;
- надевают чистую рабочую одежду.
Порядок проведения дезинфекционных мероприятий:
- сотрудники, участвующие в ликвидации аварии, должны быть одеты в хирургический халат, косынку, пластиковые бахилы;
- при проведении дезинфекции способом орошения в качестве СИЗ органов дыхания используются респираторы марки РУ-60 М или РПГ-68 с патроном, соответствующим применяемому дезинфектанту, или противогаз типа ГП-5;
- для обработки используют дезинфицирующий раствор, эффективный в отношении соответствующего инфекционного агента;
- дезинфекцию помещения проводят, разбрызгивая из гидропульта (автомакса) дезинфицирующий раствор от входной двери и далее, продвигаясь по обработанной территории и орошая перед собой все предметы (пол, стены, потолок) и воздушную среду;
- через 2 часа после первичной обработки собирают тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, осколки разбитой посуды, погружая их в ёмкость с дезинфицирующим раствором; лабораторную посуду с посевами, находившуюся в момент аварии на рабочих поверхностях, погружают в ёмкость с дезинфицирующим раствором или обтирают салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором, и помещают в ёмкость для автоклавирования;
- по окончании дезинфекции воздух и поверхности в помещении обеззараживают бактерицидными лампами по режимам согласно нормативным документам;
- сотрудник, проводивший дезинфекционную обработку, выходит в предбокс или коридор, снимает защитную одежду, погружая её в дезинфицирующий раствор;
- спустя два часа проводят уборку помещения, после чего работа может быть возобновлена.
Методы антисептической обработки рук лабораторных работников, контаминированных исследуемым материалом, культурами
патогенных микробов
По окончании работы руки обрабатывают дезинфицирующим раствором. Используют ватные тампоны или марлевые салфетки, смоченные в 700 этиловом спирте (1% хлорамин, 3% раствор лизола). Последовательность обработки: тыл кисти, ладонная поверхность, межпальцевые пространства и ногтевые ложа, т.е. с учётом первоначальной обработки менее, а потом наиболее загрязнённых мест. Вначале обрабатывают левую, а потом правую кисть руки.
При загрязнении рук культурой патогенного микроба или патологическим материалом сразу же обрабатывают данный участок кожи, покрывая его на 3-5 минут ватой, смоченной в дезинфицирующем растворе.
После обработки рук дезинфицирующим раствором их моют водой с мылом.
Приготовление фиксированных препаратов
из культур микроорганизмов
Приготовление окрашенного препарата из культуры микроорганизмов включает: 1) приготовление мазка, 2) высушивание мазка, 3) фиксацию, 4) окраску.
Приготовление мазка. При приготовлении мазка из культуры микроорганизмов, выросшей на поверхности плотной питательной среды, на обезжиренное предметное стекло наносят петлёй небольшую каплю физиологического раствора, располагая её в центре круга, нарисованного с обратной стороны карандашом по стеклу. При работе спиртовка должна находиться прямо перед вами, на удобном для работы расстоянии. Предметное стекло должно находиться в чашке Петри или лотке: категорически запрещается готовить мазки на предметном стекле, лежащем на столе! В правую руку берут бактериологическую петлю, в левую - пробирку с культурой. Петлю стерилизуют, внося её в пламя горелки в вертикальном положении. После того как петля накалится докрасна, проводят конец петледержателя через пламя. После этого из пробирки вынимают пробку, удерживая её мизинцем правой руки. После обжигания на спиртовке края пробирки в неё вносят петлю, которую охлаждают, прикасаясь к стенкам пробирки. Затем петлей с поверхности среды снимают небольшое количество культуры. Не касаясь стенок пробирки, вынимают петлю и закрывают пробирку пробкой над спиртовкой. После этого пробирку с культурой помещают в штатив, а культуру на петле вносят в приготовленную заранее каплю физиологического раствора, хорошо размешивают и равномерно распределяют по стеклу в виде небольшого круга или овала
1–1,5 см в диаметре. По окончании приготовления мазка петлю вновь стерилизуют в пламени спиртовки.
Для приготовления мазка из бульонной культуры на предметное стекло наносят 1–2 петли исследуемого материала, стерилизуя петлю перед каждым погружением в бульонную культуру микроорганизма, как описано выше, и равномерно распределяют по стеклу (в этом случае не требуется предварительного нанесения на стекло физиологического раствора).
Высушивание мазка. Высушивание мазка производится на воздухе. Для ускорения высушивания предметное стекло с мазком, обращенным кверху, можно подержать в струе тёплого воздуха высоко над пламенем спиртовки, не внося препарат в пламя.
Фиксация мазка. Для этого используют физический и химический методы. Физический метод заключается в фиксации мазка над пламенем спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх (троекратно по 1 секунде). Эту операцию проводят достаточно быстро, стараясь не перегреть мазок, так как при перегревании могут произойти необратимые изменения в клетке. Химический метод фиксации является более мягким по сравнению с фиксацией на пламени. В качестве фиксаторов используют этанол, ацетон, смесь Никифорова (эквивалентное соотношение этанола и эфира), метанол, формалин. После фиксации мазок можно окрашивать.
Окраска мазка. Для окраски мазка следуют предписаниям для каждой методики окраски. При окраске простым способом на мазок наносят несколько капель раствора красителя так, чтобы весь мазок был покрыт им. Краситель оставляют на определённое время. Затем препарат промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой.
Правила работы с микроскопом при использовании
иммерсионной системы
Настроить освещение микроскопа, используя вогнутое зеркало и объектив х8. Первоначально освещение настраивают при боковом осмотре верхней линзы конденсора. После этого при наблюдении в окуляр, изменяя положение зеркала, настраивают равномерную освещённость поля зрения.
На приготовленный и окрашенный мазок на предметном стекле нанести каплю иммерсионного масла и поместить его на предметный столик, укрепив зажимами. Иммерсионное масло можно наносить только на сухой мазок.
При помощи револьверного устройства установить иммерсионный объектив с увеличением х90.
Осторожно опустить тубус микроскопа до погружения объектива в каплю масла.
Установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта.
Провести окончательную фокусировку препарата микрометрическим винтом, вращая его в пределах только одного оборота. Нельзя допускать соприкосновения объектива с препаратом, так как это может повлечь повреждение стекла или фронтальной линзы объектива (свободное расстояние иммерсионного объектива 0,1-1 мм).
По окончании работы с микроскопом необходимо вытереть масло с иммерсионного объектива и перевести револьверное устройство на объектив с малым увеличением (х8).
Контрольные вопросы
Назовите самостоятельные научные дисциплины в микробиологии; основные разделы медицинской микробиологии, основные задачи медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии, основные методы, применяемые в медицинской микробиологии. Назовите отличительные признаки микроорганизмов как представителей царства прокариот. Какие размеры имеют бактерии? Какие различают основные формы бактерий? Как называются кокки, расположенные попарно, цепочкой, гроздьями? По четыре? Пакетами? Как называются палочки, образующие споры? Как называются извитые формы бактерий? Каким будет общее увеличение микроскопа: 1) окуляр х7, объектив х8; 2) окуляр х7, объектив х40;
3) окуляр х7, объектив х90? Каков предел разрешающей способности микроскопа с иммерсионным объективом? Какова роль иммерсионного масла? Каким свойством должно обладать иммерсионное масло для микроскопии? Нужно ли применять иммерсионное масло при микроскопии с объективом: х8, х40, х90? Этапы приготовления препарата–мазка. Для чего фиксируют мазки? Способы фиксации. Что такое простой способ окраски? Назовите красители, применяемые для простых способов окраски и их цвет.
Тёмнопольная микроскопия - на каком физическом принципе основана? Ход лучей света в микроскопе. Какие конденсоры применяются? Как выглядит поле зрения и изучаемые объекты, почему? Можно ли этим методом исследовать живые микробы? Как готовится препарат для исследования в тёмном поле? Фазово-контрастная микроскопия – принцип метода. Какие приборы и приспособления нужны для фазово-контрастной микроскопии? Преимущества данного метода.
Люминесцентная микроскопия - на каком физическом явлении основана? Виды люминесценций. Какой источник света используется? Как называются красители, применяемые для получения вторичной люминесценции? Можно ли исследовать этим методом живые микроорганизмы? Преимущества метода. Электронная микроскопия – что используется в электронном микроскопе вместо световых лучей? Чем объясняется высокая разрешающая способность электронного микроскопа: Какова длина световой волны; длина волны потока электронов? Чему равна предельная разрешающая способность любого микроскопа? Во сколько раз (примерно) больше разрешающая сила электронного микроскопа по сравнению со световым? Какой величины объекты можно увидеть в электронном микроскопе? Для чего применяется электронный микроскоп? Назовите методы микроскопии, позволяющие наблюдать живые микроорганизмы.
Работа студента на практическом занятии 1. Ознакомление с правилами работы в микробиологической лаборатории.
2. Усвоение таксономического положения микробов. Начертите в тетради таблицу «Место микробов среди других живых существ».
3. Приготовление и окраска препаратов из бактериальных культур. Внимательно проследите за демонстрацией преподавателем техники приготовления и окраски препаратов. Приготовьте мазки-препараты из культур стафилококка и кишечной палочки; окрасьте простым способом – водным фуксином и метиленовым синим. Ознакомьтесь с наиболее употребительными красителями, применяемыми в микробиологической практике.
4. Микроскопирование и зарисовка окрашенных мазков-препаратов различных форм бактерий. Внимательно проследите за демонстрацией преподавателем техники микроскопии; самостоятельно промикроскопируйте и зарисуйте мазки–препараты различных форм бактерий: круглые (стафилококк, сарцина, стрептококк), палочковидные бактерии (стрептобацилла), извитые (вибрион).
5. Изучение методов тёмнопольной, фазово-контрастной и люминесцентной микроскопии. Повторите устно принципы микроскопии, ознакомьтесь с люминесцентной тёмнопольной и фазово-контрастной микроскопией.
|
|
|
Скачать 1.36 Mb.