Виды асептики и антисептики. Учебное пособие для студентов III курсов фармацевтического факультета Под редакцией канд мед наук
 Скачать 0.53 Mb.
|
|
I этап. Растирают в стерильной ступке 10 таблеток, заливают стерильным физиологическим раствором. Бактериологической петлей забирают взвесь и помещают на 2 предметных стекла. Мазки сушат, фиксируют и окрашивают по Граму и Нейссеру. При микроскопии мазка, окрашенного по Граму, определяют наличие конгломератов и одиночных грамположительных палочек длиной 5-30 мкм. При микроскопии мазка, окрашенного по Нейссеру, определяют наличие конгломератов и одиночных палочек длиной 5-30 мкм, с желто-оранжевыми зернами волютина. II этап. Готовят 10-кратное разведение препарата и засевают на среду № 3 для накопления энтеробактерий. При наличии роста на данной среде делают высев на среду Эндо и висмут-сульфитный агар. Препарат не должен содержать энтеробактерий. (!!!) Практическая работа. В лабораторию поступил препарат «Гастрофарм» для определения идентичности лактобацилл и контроля энтеробактерий. Промикроскопируйте мазки, определите наличие энтеробактерий и дайте заключение по предложенному препарату. Определение идентичности ядов, используемых для приготовления лекарственных форм Материал для исследования: мазь «Випросал», содержащая яд гюрзы. Цель исследования: определение наличия и идентичности яда гюрзы. Методика исследования Основа исследования — реакция преципитации в геле (РП). 1. В преципитационные пробирки разливают 1,5%-й «голодный» агар, смешанный в соотношении 1:1 с сывороткой, содержащей антитела к яду гюрзы (слой № 1). 2. После застывания слоя № 1 поверх него наливают 0,5 мл 0,75%-го МПА (слой № 2, где будет происходить реакция преципитации: антиген-токсин + антитела сыворотки в виде мутного кольца). 3. После застывания слоя № 2 на него наслаивают 0,5 мл предварительно расплавленного при 45 "С препарата. Пробирку закрывают резиновой пробкой и инкубируют в термостате (t=37 °C) в течение 4 суток. После чего, при наличии кольца преципитации, делают заключение об идентичности яда. Практическая работа. В лабораторию поступили на исследование 2 серии мази «Випросал» для определения наличия и идентичности яда гюрзы. По готовым демонстрационным наборам сделайте заключение об идентичности яда, находящегося в лекарственном препарате. Определение антимикробной активности прополиса Цель исследования: определить антимикробную активность препарата. Методика исследования Готовится спиртовое разведение порошка прополиса (маточный раствор). В дозированные 3 объема расплавленного и остуженного до 40 °С МПА вносят такие количества маточного раствора, чтобы получить конечные концентрации прополиса в агаре 0,08; 0,04; 0,02%. Полученные разведения прополиса в агаре разливают по 15 мл в чашки Петри и дают застыть. Параллельно готовят 2 контрольные чашки: а) 1 мл спирта этилового (96°) +15 мл МПА (для исключения бактериостатического действия спирта на тест-штамм); б) 15 мл МПА (для подтверждения жизнеспособности тест-штамма). На все чашки петлей высевают тест-штамм Bacillus cereus 8035 и помещают их на сутки в термостат (t=35—37"С). После инкубации на контрольных чашках должен наблюдаться рост, что свидетельствует о жизнеспособности тест-штамма и отсутствии бактериостатического действия спирта, являющегося компонентом готовой лекарственной формы (настойки прополиса). Бактериостатическое действие собственно прополиса должно проявляться в концентрации не более 0,08%, о чем будет свидетельствовать отсутствие роста тест-штамма на чашке с данной концентрацией и меньшими. Практическая работа. На исследование поступили 2 серии препарата. После проведения всех необходимых манипуляций чашки с опытом и контролями были помещены в термостат на сутки. Оцените полученные на чашках результаты и сделайте заключение по антибактериальной активности двух серий прополиса. Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар Определение антимикробной активности антибиотиков основано на их способности угнетать рост микроорганизмов. Определение проводят методом диффузии в агар на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-штаммов, образующихся при испытании растворов определенных концентраций Государственного стандартного образца и испытуемого препарата. Антимикробная активность антибиотиков выражается в единицах действия (ЕД) или мкг. Для большинства антибиотиков 1 ЕД или мкг соответствуют 1 мкг активного вещества. Метод определения (трехдозный) В чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности, разливают расплавленные и остуженные до 49±1°С два слоя питательной среды, в верхний из которых засеваются конкретные тест-микробы. В агаровых слоях чашек делают лунки диаметром 6-8 мм и вносят равные объемы рабочих растворов стандартного (CI, C2, СЗ) и испытуемого (И1, И2, ИЗ) образцов. Концентрации растворов, содержащие малую, среднюю и большую дозы, должны находиться в соотношении 1:2:4. Концентрация раствора С2 должна быть близка к контрольной концентрации раствора стандартного образца, указанной в ГФ XI. По величине зон задержки роста тест-микроба на основании специальных формул, отражающих зависимость величины зон задержки роста от концентрации, рассчитывают количество антибиотика, содержащегося в исследуемом препарате. (!!!) Практическая работа. На исследование поступил таблетированный эритромицин. Для определения количества антибиотика в 1 таблетке препарат раститровали согласно требованиям ГФ XI. В работе использовался тест-штамм для эритромицина — Bacillus cereus HB в концентрации 20 млн. спор на 1 мл среды. Оцените результаты исследования ориентировочно (сравнивая зоны задержки роста испытуемого препарата и стандартного образца) и дайте предварительное заключение о содержании антибиотика в исследуемом препарате. Микробиологический контроль стерильности лекарственных препаратов (???).Контрольные вопросы Понятие «стерильные лекарственные формы». Современные лекарственные средства, к которым предъявляются требования стерильности (дополнения к ГФ XI). Удельный вес стерильных растворов в рецептуре больничных аптек. Обеспечение стерильности: а) соблюдение правил асептики, б) выбор правильного метода и режима стерилизации. Растворы, стерилизуемые в конечной упаковке. Растворы, не подлежащие стерилизации, а изготавливаемые в асептических условиях. Консерванты и требования к ним. Источники формирования пирогенности инъекционных и инфузионных растворов. Методы современного контроля пирогенности инъекционных и инфузионных растворов: а) биологический метод (ГФ XI), б) применение ЛАЛ-теста для определения эндотоксина (ВФС 42-2960-97), в) микробиологический метод (дополнения к методическим рекомендациям по микробиологическому контролю в аптеках от 1990 г.). Санитарно-микробиологические требования к микробной обсемененности субстанций, используемых для приготовления инъекционных растворов. Правила исследования на стерильность лекарственных препаратов. (!!!) Задания для практической работы 1. Работа с ситуационными задачами по анализу ОМЧ воды для инъекций до стерилизации. 2. Работа с ситуационными задачами по анализу ОМЧ субстанций до стерилизации. 3. Работа с ситуационными задачами по анализу результатов контроля стерильности инъекционных и инфузионных растворов. Лекарственные средства, к которым предъявляется требование стерильности: инъекционные и инфузионные растворы и другие виды препаратов для парентерального введения (вводимые в полость суставов, в плевральную полость и т. д.); глазные капли после стерилизации и изготовленные в асептичесих условиях; все глазные препараты (мази, пленки, офтальмологические растворы для орошения и др.); препараты, наносимые на открытые раны и ожоги; жидкие лекарственные средства для новорожденных; медицинские иммунобиологические препараты (МИБП). В аптеках лечебных учреждений до 30-40% рецептуры составляют инъекционные лекарственные формы. Некоторые инъекционные растворы не выдерживают термической стерилизации (барбамил, мединал, адреналина гидрохлорид и др.). Некоторые из препаратов в инъекционных растворах сами по себе оказывают бактерицидное действие (аминазин, дипразин, гексаметилентетрамин и др. Инъекционные растворы должны быть стерильными, так как они вводятся через полую иглу с нарушением целости кожных и слизистых покровов. По требованию врача могут быть стерильными мази, присыпки, пластыри. Требования стерильности этой категории лекарственных форм не лишены оснований: зарегистрированы случаи заражения столбняком при использовании нестерильных присыпок. При заводской технологии изготовления инъекционных растворов воздух в ампульные цехи подается профильтрованный, стерильный. Инъекционный способ введения лекарственных форм имеет ряд преимуществ: быстрота действия вводимых лекарственных препаратов; отсутствие разрушительного действия ферментов желудочно-кишечного тракта и печени на лекарственные формы; отсутствие действия медикаментов на органы вкуса и обоняния и раздражения желудочно-кишечного тракта; полное всасывание вводимых лекарственных форм; возможность точной локализации действия лекарств (в случае применения анестезирующих веществ); точность дозирования; возможность введения лекарства больным, находящимся в бессознательном состоянии; возможность заготовки инъекционных препаратов впрок (в ампулах). Требования, предъявляемые к инъекционным растворам (ГФ XI): стерильность; апирогенность; стабильность; отсутствие механических включений. Состав практически всех растворов для инъекций, а также способы обеспечения их стерильности и стабильности регламентированы. Требование стерильности предполагает отсутствие в препарате микроорганизмов на любой стадии их развития. Это ведущее требование должно обеспечиваться следующими приемами: соблюдение правил асептики при изготовлении раствора, выбор правильного метода и режима стерилизации. Стерильные растворы аптечного изготовления делятся на две группы: растворы, которые стерилизуются в конечной упаковке; растворы, которые не подлежат стерилизации и готовятся в асептических условиях на основе стерильной воды с использованием стерильных растворителей, посуды, вспомогательных материалов, с применением мембранной фильтрации и т. д. Необходимым компонентом любого стерильного лекарственного препарата являются растворители: вода очищенная; вода для инъекций; жирные масла; этилолеат. В состав комплексных растворителей могут входить глицерин, бензиловый и этиловый спирты, пропиленгликоль и др. Основными руководящими документами при изготовлении стерильных растворов в аптеках и на фармацевтических производствах являются: ГФ XI и дополнения к ней; методические указания по изготовлению стерильных растворов в аптеках; фармакопейные статьи (ФС); Приказ №214 от 16 июля 1997 г. «О контроле качества лекарственных средств, изготовляемых в аптеках»; Приказ №1026 от 19 октября 1982 г. «Об усилении контроля за санитарным состоянием родильных домов, детски* "лечебно-профилактических учреждений и аптек» и прочая нормативная документация. Отбор образцов на исследование Образцы готовых лекарственных средств и медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) отбираются для контроля от каждой серии в количествах не менее 3 и не более 40 (в зависимости от величины партии). Для посевов используют жидкие среды: тиогликолевую — для бактериальной микрофлоры; жидкую среду Сабуро — для грибковой микрофлоры. Эти питательные среды обладают высокими ростовыми свойствами и обеспечивают рост микроорганизмов при посеве их в количестве менее 100 жизнеспособных клеток. Соотношение объема исследуемой лекарственной формы и среды — 1:10. Этапы исследования Прежде всего необходимо определить; не обладает ли лекарственная форма антимикробным действием, во избежание неправильной оценки результатов анализа. Определение антимикробного действия препарата проводят при отсутствии явных указаний на наличие консерванта или антимикробного вещества. Используемые в методике тест-штаммы: E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans. Тест-штаммы выращивают на сахарном бульоне при 35-37 оС, 48 часов (Candida albicans — на жидкой среде Сабуро при 20-25 оС, 72 часа). Выращенные культуры разводят стерильным физиологическим раствором до конечной концентрации 1000 клеток/мл; в пробирки вносится по 0,1 мл приготовленной взвеси. 1-я пробирка: 0,1 мл взвеси Staphylococcus aureus + (10:1) тиогликолевая среда и лекарственное средство, t = 35-37 "С, 48 часов; 2-я пробирка: 0,1 мл взвеси Pseudomonas aeruginosa + (10:1) тиогликолевая среда и лекарственное средство; t = 35-37 "С, 48 часов; 3-я пробирка: 0,1 мл взвеси Е. coli + (10:1) тиогликолевая среда и лекарственное средство; t = 35-37 "С, 48 часов; 4-я пробирка: 0,1 мл взвеси Candida albicans + (10:1) жидкая среда Сабуро и лекарственное средство; t=20-25 °С, 72 часа. Контроли: пробирки с теми же средами, но без лекарственного средства + тест-штаммы (для оценки жизнеспособности тест-штаммов). Отсутствие роста в опытных пробирках свидетельствует об антибактериальном действии лекарственного препарата. При исследовании на стерильность для предотвращения антибактериального действия препарат засевается в жидкие среды (тиогликолевая и Сабуро) в соотношении 1:250 или используются инактиваторы, указанные в частных фармакопейных статьях (например, для сульфаниламидов — парааминобензойная кислота, для пенициллинов и цефалоспоринов — фермент пенициллиназа и т. д.). Если препарат обладает выраженным антимикробным действием, то используют метод мембранной фильтрации (см. ГФ XI, с. 189-191): по окончании фильтрации фильтры отмывают стерильным физиологическим раствором и делят на две части, помещая одну в тиогликолевую среду, а другую — в среду Сабуро. Антибиотики испытываются на стерильность только методом мембранной фильтрации! Испытание на стерильность лекарственных средств без антимикробного действия Метод прямого посева Препарат вносится в соотношении 1:10 в жидкие питательные среды по 2-3 пробирки, которые помещаются в термостат: тиогликолевая среда — t = 35-37 "С, 14 суток; среда Сабуро — t = 20-25 "С, 14 суток. Посевы просматриваются ежедневно! При испытании мазей и растворов лекарственных средств в маслах отбирают в асептических условиях по 0,1 г (мл) каждой единицы и вносят в стерильную колбу объемом 250 мл, где находятся стерильный фосфатный буфер (рН 6,8-7,0), стерильные стеклянные бусы и стерильный эмульгатор. Содержимое колбы подогревают до 41 ±1 °С и встряхивают в течение 30 минут (не более) до получения однородной эмульсии (возможно использование термовстряхивателя). Полученную эмульсию в стерильных условиях переносят в количестве 5,0 мл в колбы, содержащие по 40 мл тиогликолевой среды и среды Сабуро. Инкубация при 35-37 "С для тиогликолевой среды и при 20-25 °С — для среды Сабуро. Посевы просматриваются ежедневно! Для лекарственных препаратов, разлитых в склянки объемом более 100 мл, можно использовать метод мембранной фильтрации Учет и интерпретация результатов Посевы просматривают в рассеянном свете ежедневно и по окончании срока инкубации (14 дней). Наличие роста микробов в питательных средах оценивают визуально (макроскопически) по появлению помутнения, пленки, осадка и микроскопически (мазки, окрашенные по Граму). Если рост через 14 суток отсутствует во всех засеянных пробах, то выдают заключение о том, что препарат (лекарственная форма) стерилен. Если рост наблюдается хотя бы в одном из посевов макроскопически и подтверждается микроскопически, то посев повторяют: засевают такое же количеств образцов. При этом: если рост отсутствует во всех пробах — посевы стерильные, выдается заключение о том, что препарат стерилен; если рост микробов отмечается хотя бы в одном из посевов и это подтверждается микроскопически (в мазках определяются микроорганизмы, идентичные микробам первого контроля), то выдается заключение, что препарат нестерилен; если во вторичном посеве отмечается рост микробов (хотя бы в одной из проб), но в мазках определяются формы микроорганизмов, отличающиеся от первоначальных, испытание повторяют в третий раз на удвоенном количестве образцов. Если рост отсутствует во всех образцах, то препарат считают стерильным. Если отмечается рост хотя бы в одном из посевов, то препарат нестерилен. Растворы для инъекций до стерилизации должны храниться не более 3 часов. Изготовляемые в аптеках растворы для инъекций подвергаются микробиологическому контролю в СЭС выборочно, не реже 2 раз в квартал, а также испытанию на содержание пирогенных веществ — ежеквартально. Если посев инъекционных растворов (до стерилизации) не делается непосредственно в аптеке, то с момента забора материала до посева должно пройти не более 3 часов. Приготовление растворов для инъекций проводится в асептических условиях. Асептические условия приготовления лекарственных препаратов регламентируются статьей ГФ XI «Стерилизация», Инструкцией по приготовлению растворов для инъекций в шпеках, Приказом Министерства здравоохранения РФ (№309), Методическими указаниями по изготовлению стерильных раствором в аптеках. ОМЧ инъекционных растворов до стерилизации — не более 40 сапрофитов в 1 мл (Приложение № 1 к Методическим указаниям по микробиологическому контролю в аптеках № 3182-84). Растворы для инъекций должны готовиться из лекарственных веществ, полностью отвечающих требованиям фармакопейных статей и других нормативных документов. Некоторые лекарственные вещества должны обладать повышенной степенью чистоты или подвергаться особой очистке, т. к. могут являться питательной средой для размножения микроорганизмов или оказаться загрязненными на технологических этапах: гексаметилентетрамин; глюкоза; кальция глюконат; кофеин-бензоат натрия; натрия цитрат; кальция хлорид; магния сульфат и др. Препараты для инъекций должны храниться в специальных штангласах с притертыми пробками в специальном шкафу. Перед заполнением штангласов новыми порциями препаратов банки и пробки тщательно очищаются и стерилизуются. Вспомогательные вещества (стабилизаторы, солюбилизаторы, консерванты и др.) также должны соответствовать требованиям нормативной документации. Растворители Обычная дистиллированная вода нередко содержит значительное количество живых и мертвых микроорганизмов. Поэтому для приготовления инъекционных растворов применяется дистиллированная вода повышенной чистоты, свободная от микробов и пирогенных веществ — вода для инъекций (см. раздел «Вода» данного методического пособия). В качестве растворителей применяются также жирные масла: персиковое, абрикосовое, миндальное, — которые обладают малой вязкостью и легко проходят через узкий канал иглы. Могут быть использованы хорошо рафинированные подсолнечное масло и масло земляного ореха (стерилизация масел рассмотрена в разделе «Асептика в фармации» данного методического пособия). Асептически изготавливают лекарственные формы, не переносящие термической обработки — например, растворы с термолабильными веществами. Малоустойчивыми системами являются также взвеси и эмульсии, т. к. в них при нагревании резко усиливаются процессы рекристаллизации, флокуляции взвеси и коалесценции (слияние частиц). Эмульсии — микрогетерогенные системы, в которых и дисперсная фаза, и дисперсионная среда образованы жидкостями, взаимно не растворимыми. Это грубодисперсные системы («масло-вода»). Эмульсии типа «масло-вода» употребляются в медицинской практике как per os, так и парентерально (линименты, жидкие мази, эмульсионные мази). В этих случаях строжайшее соблюдение асептических условий — единственный путь получения лекарственных препаратов, по своему состоянию весьма близких к понятию стерильных. Это достигается тем, что растворитель или основу для мази, инструменты, посуду стерилизуют отдельно. Термолабильные лекарственные вещества асептически взвешивают и растворяют в стерильном растворителе (иногда с добавлением консерванта) или смешивают со стерильной основой стерильными инструментами и помещают в стерильные отпускные склянки. Термостабильные компоненты лекарственных препаратов стерилизуются. Препараты готовят в асептическом блоке (см. раздел «Асептика в фармации» данного пособия, Приказ МЗ РФ № 309). Офтальмологические (глазные) лекарственные формы Данные лекарственные препараты занимают особое место среди лекарств в силу специфики их использования. Глазные препараты должны быть стерильными, т. к. конъюнктиву глаза необходимо защищать от инфекции. В норме она обмывается слезной жидкостью, содержащей лизоцим, который лизирует грамположительную микрофлору, наиболее часто попадающую на слизистую. При заболеваниях глаз количество вырабатываемого лизоцима часто резко уменьшается. Инфицирование глаз нестерильными препаратами может привести к тяжелым последствиям, вплоть до потери зрения. С учетом этого предпринимается следующее. 1. При приготовлении глазных капель в асептических условиях скрупулезно соблюдаются все мельчайшие требования асептики. Проводят стерилизацию глазных лекарственных препаратов, если они выдерживают термическую обработку. Надо помнить, что при использовании глазных капель при первом открытии флакона, капли могут обсеменяться микроорганизмами. Поэтому целесообразно готовить малые объемы препарата и вводить консерванты для сохранения стерильности (характеристика, механизм действия и требования, предъявляемые к консервантам, изложены в разделе «Асептика» данного методического пособия). Выбор способа термической обработки глазных капель определяется степенью устойчивости лекарственных веществ в растворах при нагревании. В заводских условиях может использоваться стерилизация фильтрованием. Глазные мази: основа должна быть стерильной, иначе мазь может стать причиной инфицирования конъюнктивы и слезных протоков. В качестве основы чаще всего используют вазелин сорта «для глазных мазей», сплав вазелина с ланолином или метилцеллюлозои и другими высокомолекулярными соединениями. Стерильность надо не контролировать, а обеспечивать! Условия обеспечения стерильности Персонал — санитарно-микробиологическая грамотность и ее соблюдение. Помещение — асептика, ее обеспечение и поддержание. Оборудование — технологическое соответствие нормативам. Минимальная исходная микробная контаминация субстанций до стерилизации. Валидация процесса — критические точки. Контроль оборудования и процесса. (!!!) Практическая работа Задание 1 Для санитарно-бактериологического исследования из аптеки взят на исследование инъекционный раствор глюкозы до стерилизации, спустя час после приготовления. Проведены следующие виды исследований: ОМЧ, контроль наличия в растворе глюкозы золотистого стафилококка, энтеробактерий, псевдомонад и грибов. В таблице представлены результаты проведенных исследований.
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||