лекции. Вопросы лекции
 Скачать 5.13 Mb.
|
Хроматографические методыАбсолютое большинство веществ живой и неживой природы и синтетических веществ, используемых в производстве самых разнообразных продуктов питания и непродовольственных товаров, представляют собой не индивидуальные химические соединения, а сложные многокомпонентные смеси веществ. В процессе получения готовой продукции чаще всего состав исходного сырья изменяется: в результате технологических воздействий некоторые компоненты частично или полностью исчезают, появляются новые вещества. Должное качество продукции достигается, как правило, при достаточно строгом компонентном составе получаемой продукции. К сожалению, большинство современных физических и физико-химических методов анализа, используемых для контроля компонентного состава вещества, дает аддитивную величину измеряемого аналитического сигнала, которая слагается из его величин, образуемых отдельными компонентами смеси, зачастую имеющими различную химическую природу и различное влияние на качество продукции. Это ограничивает использование таких методов для строгого контроля компонентного состава продукции и приводит к необходимости использовать те или иные методы разделения смесей веществ. Особенно большие трудности возникают, если все компоненты разделяемой смеси образуют одну фазу. В этом случае необходимо или изменять агрегатное состояние части компонентов смеси, или добиваться изменения фазового равновесия или кинетики процесса разделения. Например, в таких методах разделения, как экстракция и ректификация, вещества, входящие в смесь, переходят через границу раздела фаз в обоих направлениях, стремясь к установлению равновесия. Эффективность разделения значительно повышается, если процесс перехода вещества из одной фазы в другую с установлением равновесия многократно повторяется. На рис. 1 представлена простейшая хроматографическая система, в которой поток подвижной фазы увлекает молекулы сорбата, одновременно с этим тормозящие факторы удерживают их на поверхности или в объеме сорбента. Поскольку действие тормозящих сил зависит от структуры молекулы, то одни молекулы задерживаются в колонке дольше других и в итоге могут быть выделены в виде отдельных компонентов. С помощью регулирования таких параметров, как температура хроматографического процесса, тип сорбента, тип и скорость движения подвижной фазы и др. можно добиться оптимального разделения многокомпонентной смеси. Фракции отдельных компонентов можно собрать для последующего использования (препаративная хроматография) или они могут быть «опознаны» с помощью компьютерной программы, определяющей химический состав вещества (аналитическая хроматография).  Рисунок 1. Разделение компонентов смеси в хроматографической системеЕще более эффективно смеси веществ разделяются, если разделение смеси производить так, чтобы одна из фаз была подвижной и перемещалась отностельно другой – неподвижной. В этом случае, как и при установлении фазового равновесия, молекулы веществ, входящих в смесь, на выходе из неподвижной фазы возвращаются в нее, однако вследствие движения подвижной фазы попадают не в прежний участок объема неподвижной фазы, а в новый, ближайший по направлению движения подвижной фазы, объем (рис.2). Многократное повторение элементарных актов фазовых переходов, большая поверхность раздела фаз и относительно малая толщина взаимодействующих слоев фаз обеспечивает высокую эффективность разделения многокомпонентных смесей веществ, часто обладающих близкими свойствами. Эти условия в большей мере выполняются в методе разделения смеси веществ, получившего название хроматографического и в настоящее время широко используемого на практике не только в качестве метода разделения, но и метода анализа сложных многокомпонентных смесей веществ.  Рисунок 2. Основные элементы хроматографического процесса рассмотрим на примере разделения бинарной смеси в условиях колоночной жидкостной адсорбционной хроматографии. Представим себе трубку, заполненную простым адсорбентом (колонку), через которую непрерывно течет растворитель (рис. 4).  Рисунок 3. Принципиальная схема хроматографической колонкиАдсорбент (сорбент, наполнитель колонки) удерживается в колонке фильтрами, он неподвижен и поэтому называется неподвижной фазой. Растворитель, перемещающийся относительно сорбента, называется подвижной фазой (в некоторых случаях элюентом). Введем в верхнюю часть колонки по одной молекуле соединений - сорбатов, обозначенных далее Х и У (рис. 4).  Рисунок 4. Основные элементы хроматографического процессаПри движении вдоль колонки эти молекулы будут диффундировать внутри пор сорбента и, в результате межмолекулярных взаимодействий того или иного типа, адсорбироваться на поверхности неподвижной фазы. Естественно, что на практике в колонку не вводят единичные молекулы и поэтому данная картинка предельно упрощает реальную ситуацию. Если в колонку введены хотя бы несколько молекул разного вида, то обнаружим, что средние скорости перемещения молекул X и У по-прежнему различны. Помимо этого, скорости перемещения отдельных молекул каждого вида отклоняются в ту или иную сторону от среднего для данного вида значения. Молекулы сорбатов, первоначально введенные в колонку в виде мгновенного импульса, выходят из нее более продолжительно, это объясняется тем, что в ходе хроматографической миграции каждое индивидуальное вещество перемещается в направляющей системе в ограниченном (постепенно изменяющемся) объеме. Эти объемы и соответствующие им участки длины колонки, равно как пятна и полосы на хроматографической пластинке, будем ниже именовать. хроматографическими зонами, или просто зонами. Неидентичность скоростей перемещения одинаковых молекул в хроматографии называется размыванием. Оно связано с рядом явлений в колонке, которые подробнее рассмотрим позднее. Это нежелательное явление приводит к тому, что среди молекул У могут находиться также молекулы Х, скорость которых близка к скорости наиболее "быстрых" молекул У. В результате зоны Х и У могут частично наложиться одна на другую и разделение окажется неполным. С помощью хроматографии могут быть решены следующие задачи: 1) разделены сложные смеси веществ на отдельные компоненты; 2) установлена идентичность и однородность химических соединений; 3) определен количественный состав сложных смесей или количественное содержание отдельных компонентов; 4) установлена молекулярная структура соединений. В отличие от других методов, основанных на распределении компонентов между фазами, таких как экстракция и сорбция, хроматография - это динамический процесс, состоящий из многократных актов сорбции-десорбции компонентов, так как он происходит в потоке подвижной фазы. Такой динамический характер обеспечивает достижение значительно более высокой эффективности хроматографии по сравнению с сорбцией и экстракцией в статических условиях.    История открытия хроматографических методов
Разделение М.С. Цвет проводил в колонке, показанной на рис. 6. Смесь веществ А, Б и В – природных пигментов, первоначально находящихся в зоне (е), – при приливании соответствующего растворителя Д (элюент разделяется) на отдельные зоны. Смесь веществ А, Б и В, сначала находящихся в зоне е, разделяется при элюировании растворителем Д (элюент) на отдельные зоны, движущиеся с разными скоростями к выходу из колонки. Как всегда, все началось, казалось бы, c самого простого, что мог проделать любой школьник. В прежние годы школьники писали чернилами. И если промокашка попадала на чернильное пятно, то можно было заметить, что раствор чернил разделялся на ней. Более подробно появление термина "Хроматография" описана самим М.В. Цветом. В стеклянную трубку с сорбентом М.С. Цвет вносил некоторое количество спиртовой вытяжки красящих пигментов зеленых листьев. Верхняя часть сорбента, находящегося в стеклянной колонке, приобретала интенсивно зеленый цвет. Затем через колонку Цвет пропускал подвижную фазу. Компоненты исследуемой смеси, растворяясь в ней, экстрагируются и продвигаются по колонке, сорбируясь новыми порциями сорбента. Вещества различной химической природы перемещаются по слою сорбента с разными скоростями за счет различного распределения компонентов анализируемой смеси между подвижной и неподвижной фазами, образовав в итоге четко разделенные окрашенные зоны (рис. 2). Цвет отмечал: "Если петролейно-эфирный раствор хлорофилла профильтровать через столбик адсорбента, то пигменты по расположению их в адсорбционном ряду отличаются отдельными окрашенными зонами. Получаемый таким образом препарат я называю хроматограммой, а предлагаемую методику - хроматографической". Так впервые прозвучало слово "хроматография" (от греч. хроматос - цвет, окраска и графио - пишу, описываю). Если подвижная фаза - жидкость, говорят о жидкостной хроматографии, если газ – соответственно о газовой, если их смесь в различных вариантах, то о газо-жидкостной хроматографии. Результаты этих экспериментов были опубликованы М. Цветом в статье «О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биохимическому анализу». В этой формулировке М. Цвет дал достаточно четкое определение адсорбционной хроматографии, основанной на различии компонентов анализируемой смеси по сродству к выбранному адсорбенту. Он высказал идею о возможности применения для хроматографического разделения смеси веществ различий и в других свойствах компонентов, в частности в растворимости труднорастворимых осадков. Однако предложенный М. Цветом метод его современниками не был оценен и длительное время не находил использования. В более поздних работах он обосновал метод теоретически, описал разные его варианты, аппаратуру, практическое применение. Основным условием для хроматографического разделения он считал различие в адсорбируемости. Первое заявление для зарубежных коллег о разработанном им аналитическом методе на основе адсорбции М.С. Цвет сделал в статье об изучении бурых водорослей, переданной в «Доклады Немецкого ботанического общества» 16 мая 1906 г. и вышедшей в том же году. В ней метод был лишь назван, но никак не описывался. Автор отсылал читателя к своему русскому сообщению 1903 г. в «Трудах Варшавского общества естествоиспытателей. Однако никто не обратил какого-либо внимания на это замечание Цвета, не было на него отсылок и в последующие годы. Цвет заявил о своем методе западноевропейской науке двумя специальными статьями – «Физико-химическое исследование хлорофилла. Адсорбция» и «Адсорбционный анализ и хроматографический метод. Применение к химии хлорофилла», переданными в тот же журнал соответственно 21 июня и 21 июля 1906 г. и увидевшими свет в том же году. В названных двух немецких статьях и особенно в последней из них Цвет не только ознакомил зарубежных читателей с разработанным им методом, но и сообщил о результатах его совершенствования путем более эффективных адсорбентов, растворителей и приемов. Изучение основной работы М. С. Цвета «Хромофиллы в растительном и животном мире», опубликованной в 1910 г., показывает, что ученый существенно развил предложенный им хроматографический метод. 28 ноября 1910 г. в Варшавском университете М.С. Цвет блестяще защитил русскую диссертацию на степень доктора ботаники. В этот период М.С. Цвет настойчиво искал возможность занять специальную кафедру ботаники в Самарском или Новоалексеевском институтах или в Львовском университете. В одном из прошений в Министерство просвещения ученый писал: «Назначение на кафедру... дало бы мне возможность шире применить мои знания и шире же развернуть научную деятельность». Но для дважды доктора ботаники – М.С. Цвета, широко известного в России и за рубежом, в Российской империи ни кафедры, ни лаборатории не нашлось. И это не могло не оказать отрицательного влияния на жизнь М. С. Цвета. А когда началась первая мировая война, и пришлось срочно эвакуироваться из Варшавы все рукописи и рабочие журналы Цвета погибли. Наконец, в марте 1917 г. М.С. Цвет был избран профессором университета в Юрьеве (Тарту) и директором ботанического сада. Но проработать там удалось меньше года: он вновь должен был эвакуироваться, на сей раз в Воронеж, где в это время организовывался университет. В Воронеже он стал одним из первых профессоров Воронежского университета. И в Тарту, и в Воронеже состояние здоровья М.С. Цвета было очень неважным. По отзывам университетских врачей, М.С. Цвет страдал декомпенсированным пороком сердца. Умер он 26 июня 1919 г. в больнице и был похоронен на кладбище Алексеевского монастыря. К сожалению, время от времени предпринимаются попытки преуменьшить роль М.С. Цвета в открытии хроматографии. Повидимому, наиболее достойным ответом на это являются справедливые слова одного из энтузиастов и знатоков хроматографии Л. Цехмайстера, который пишет: «Очевидно, Цвет является истинным изобретателем хроматографии во всех ее важнейших аспектах». Один из известных женевских ботаников Дере в своей обширной статье о М.С. Цвете и хроматографии еще в 1943 г. писал, что М.С. Цвет за свое открытие достоин Нобелевской премии хотя бы потому, что значительная часть нобелевских лауреатов по химии не получила бы столь значительных результатов без открытой М.С. Цветом хроматографии. М.С. Цвет своими работами вдохнул новое, более глубокое содержание в те адсорбционные методы, которые были известны до него. В частности, нынешнее широкое развитие хроматографии на бумаге является, в первую очередь, следствием распространения открытых М.С. Цветом общих закономерностей на случай адсорбционного разделения смеси на полосках бумаги. Открытый М.С. Цветом хроматографический метод длительное время практически не использовался. Лишь после работы Э. Ледерера, Р. Куна и Винтерштайна (1931 г.) он занял по праву заслуженное место, после чего началась и продолжается пора расцвета хроматографии в ее все новых и новых вариантах, во все новых и новых областях применения. Существенный вклад в развитие идей М.С. Цвета, в первую очередь в области фотосинтеза и хроматографии, внесли советские ученые, особенно в послевоенный период. Однако вернемся к классическим опытам М.С. Цвета. Было известно, что различные пигменты по-разному извлекаются из растертых листьев растений: некоторые (каротин) хорошо растворяются в нефтяном лигроине, а другие (ксантофилл и хлорофилл) извлекаются (экстрагируются) только полярными растворителями, например спиртами. Цвет впервые правильно объяснил это явление тем, что пигменты находятся в хлорофилловых зернах в адсорбированном состоянии и сила адсорбции у них различна. Поэтому каротин легко десорбируется и переходит в растворитель, а для выделения других пигментов нужно, чтобы спирт вытеснил их, так как сам он адсорбируется сильнее пигментов. Так нельзя ли использовать адсорбцию для разделения веществ? Цвет добавил к раствору (экстракту) пигментов порошок мела, и действительно, некоторые пигменты адсорбировались, а некоторые остались в растворе. Но разделение было неполным. На основании этого он пришел к выводу, что нужен не однократный, а многократный адсорбционный процесс. Вот тогда-то Цвет и проделал свой исторический опыт. В трубку с порошком мела он залил раствор пигментов. В верхней части образовалось окрашенное кольцо. Затем в трубку он стал непрерывно подавать бензол. Пигменты частично растворялись в нем, опускались, адсорбировались другими зернами мела, снова растворялись в новых порциях бензола и снова опускались по трубке. Но так как разные вещества по-разному извлекались бензолом из адсорбента, они опускались по трубке с разной скоростью. Поэтому первоначальное зеленое кольцо, опускаясь, постепенно расширялось и делилось на несколько разноцветных колец. В конце концов, этих колец оказалось шесть: верхнее желтое, затем оливково-зеленое, далее темно-зеленое и три желтых. Цвет извлек слой адсорбента из трубки, разрезал его на цилиндрики, в каждом из которых оказалось своё цветное кольцо (рис. 7). Теперь можно было извлечь вещества из адсорбента спиртом и исследовать. В результате Цвет показал, что хлорофилл – это не индивидуальное соединение, а смесь двух веществ, которые разделились на колонке и дали оливково-зеленое и темно-зеленое кольца. Остальные вещества были ксантофиллами. «Как лучи света в спектре, – отмечал Цвет, – в столбике углекислого кальция закономерно располагаются компоненты пигментов, давая возможность для своего качественного и количественного определения».  Рисунок 7. Разделение хлорофилла на мелеАмериканский ученый Г. Стрейн писал, что Цвет разработал «остроумный» метод химического анализа, которому суждено оказать влияние на жизнь человечества и всего живого мира. Он позволяет осветить сложнейшие природные процессы, процессы питания, влияния гормонов на внешний вид и характер людей и животных. Благодаря этому методу в сложном механизме живой клетки обнаружены реакции, которые ранее невозможно было себе представить. Немецкий биолог Л. Цехмейстер отмечал, что «метод Цвета осуществил заветную мечту химика». Цвет назвал получаемую при разделении веществ разноцветную картину хроматограммой, а сам метод хроматографическим адсорбционным анализом или хроматографией. Название было подобрано очень остроумно, если учесть, что слово «хроматография» в переводе с греческого означает «цветопись», то есть, с одной стороны, говорит о разделении окрашенных веществ, а с другой – напоминает об имени изобретателя метода. Конечно, дело не в том, что разделяемые вещества окрашены, автор сам указывал, что с равным успехом можно разделять и бесцветные соединения. Главное – это возможность разделения веществ по их склонности к адсорбции. Цвет указывал: «Само собою, разумеется, описанные явления присущи не только хлорофилльным пигментам: ясно, что самые разнообразные окрашенные или бесцветные химические соединения подчиняются тем же закономерностям». Процесс перемещения разделяемых веществ в потоке растворителя Цвет назвал проявлением хроматограммы. И по сей день этот вариант хроматографии называют проявительным или элюционным анализом. Сейчас, когда разработаны разнообразные хроматографические методы, мы, пользуясь современной классификацией их, можем сказать, что Цвет впервые использовал проявительный вариант жидкостно-адсорбционной хроматографии. Проявителем, подвижной фазой служила жидкость, а неподвижной, сорбирующей фазой – твердый адсорбент. К сожалению, судьба хроматографии оказалась похожа на судьбу многих открытий и изобретений, особенно тех, которые опередили свое время. Сначала открытие не признается, о нем говорят как об ошибке, как о том, чего «не может быть, потому что не может быть никогда», потом проходит время и постепенно открытие «входит в обиход», становится «само собой разумеющимся», но... предлагают изменить его название. А дальше оказывается, что у автора было много предшественников и он, собственно, ничего не открыл и не изобрел. Если к этому времени автор еще жив, он постоит за свой приоритет. А если нет? Всегда ли потомки оказываются справедливы? Всегда ли они увенчивают лаврами именно того, кто этого заслужил? Да и вообще, как правильно определить автора? Ведь почти всегда имеются предшественники, всегда, чтобы посмотреть дальше, надо, как говорил Ньютон, «встать на плечи гигантов». Еще при жизни Цвета ряд крупных ученых выступило против его метода. Среди противников хроматографии были и немецкий биолог Р. Вильштеттер и К.А. Тимирязев крупнейшие ученые, чей вклад в развитие науки трудно переоценить. Вильштеттер сам выполнил прекрасную работу по исследованию хлорофилла, получив предварительно продукты реакции его с кислотой и щелочью. Какие же возражения были выдвинуты против хроматографического метода анализа? Дело в том, что Цвет, как биолог, проводил свои опыты с веществами, которые не очень устойчивы и могут разлагаться, вступать в химические реакции. Критики метода полагали, что разделяемые вещества, адсорбируясь, могут изменять свое строение. Таким образом, это были возражения не против метода, а против его применения к конкретным объектам. Если бы Цвет разделял смеси более простых по строению и устойчивых веществ, например углеводородов, возражения отпали бы сами собой. А сейчас надо доказывать большее, доказывать, что ни одно из выделенных веществ не изменилось. Для этого нужны время, условия и силы. И тем больше оказалась заслуга Цвета, тем ярче засияли его идеи, когда выяснилось, что все возражения противников несостоятельны, что все результаты и даже предсказания подтвердились, когда метод получил всеобщее признание и развитие. Но это произошло потом, спустя мнoго лет после смерти Цвета. Мы должны исходить из тех позиций, что истинным автором открытия или изобретения достоин считаться тот, кто впервые построил прочный фундамент, на котором последующие поколения ученых воздвигнут здание, а не те кто, может быть и раньше, но заложили лишь отдельные кирпичики. А так как здание будет расти не только ввысь, но и вширь, то расширенный фундамент может вбирать в себя и рядом лежащие более старые кирпичики и блоки. Д.И. Менделеев писал: «Научные открытия редко делаются сразу... время вызывает действительного творца, обладающего всеми средствами для проведения истины во всеобщее сознание; однако не должно забывать, что он может являться только благодаря труду многих и накопившейся сумме данных». Со времени опубликования в 1910 году книги М.С. Цвета «Хромофиллы в растительном и животном мире» очень немногие из химиков использовали хроматографический метод. Долгое время он оставался малоизвестным, но в 1913 году Л. Пальмер и Экклес использовали этот метод для разделения ограниченного числа пигментов из растворов для спектральных исследований. Л. Пальмером была написана книга «Каротиноиды и пигменты». Впоследствии в 1931 г. группе немецких ученых из Института фундаментальной медицины Р. Куну, А. Винтерштейну и Э. Ледереру удалось выделить хроматографическим методом α- и βкаротин из сырого каротина, что дало толчок к дальнейшему развитию хроматографии и ее широкому использованию в ботанических и биохимических лабораториях. Рихард Кун (R. Kuhn) Австрийский химик Рихард Кун родился в Вене. После окончания гимназии Р. Кун поступил в Венский университет, но вскоре перешел в университет в Мюнхене. Там он изучал химию у Рихарда Вильштеттера лауреата Нобелевской премии «за исследования красящих веществ растительного мира, особенно хлорофилла» (1915 г.) и в 1922 г. получил докторскую степень. За свои исследования, главным образом, хлорофиллов Вильштеттер получил в 1915 году Нобелевскую премию по химии. Вильштеттер был одержим диссертацией Цвета по хлорофиллам (и хроматографии), переведенной на немецкий язык и изданной в виде книги, и читал ее Куну и его сотрудникам. Р. Кун продолжал заниматься исследованиями в Мюнхенском университете, пока в 1926 г. не перешел в Федеральный технологический институт в Цюрихе. Кун занялся изучением каротиноидов – биологических пигментов, являющихся важной составной частью живых клеток. В 1931 г. независимо друг от друга Кун и Пауль Каррер обнаружили в каротине два четко отличающиеся друг от друга компонента: альфа-каротин и бетакаротин. Позже Р. Кун открыл третий вид – гамма-каротин. Продолжая исследования, Р. Кун выяснил, что каротин является исходным веществом витамина А, т.е. необходимым «стартовым материалом» для производства этого витамина биологическими системами. Р. Кун и его сотрудники открыли присутствие каротиноидов в организмах многих растений и животных, тем самым значительно расширив возможности использования такого важного аналитического инструмента, как хроматография. В 1939 г. Р. Куну была присуждена Нобелевская премия по химии за 1938 г. «в знак признания проделанной им работы по каротиноидам и витаминам». Эдгар Ледерер (E. Lederer) Эдгар Ледерер родился в 1908 г., в Вене, Австрия. Окончил Венский университет, где в 1930 г. получил степень доктора. Начал работать в Гейдельберге под руководством Р. Куна. В 1935–1937 г.г. был директором института витаминов в Ленинграде. В 1938 г. вернулся во Францию. С 1954 г. в Сорбоннском университете, затем с 1960 г. директор института химии природных веществ Национального Центра научных исследований в Жив-сюр-Иветте. Был кавалером ордена Почетного легиона, почетным доктором 2-х университетов, членом 6 академий, получил 7 медалей за научные достижения. В историю хроматографии Э. Ледерер вошел как ученый, блестяще подтвердивший результаты М.С. Цвета после периода, когда метод использовали сравнительно мало. Прибыв в лабораторию Р. Куна и получив от него задачу – исследовать, содержатся ли ксантофиллы и зооксантины в лютеине куриного яйца, – Э. Ледерер вспомнил, что в книге Пальмера о каротиноидах упоминаются работы М.С. Цвета. Э. Ледерер тщательно ознакомился с переводом основной книги М.С. Цвета, и в декабре 1930 г. был получен ксантофилл и зооксантин. Далее были продолжены эксперименты с каротинами моркови, и снова успешное разделение. Публикацию этих результатов принято рассматривать как очень важный этап в широком использовании хроматографии. После возрождения хроматографии, в тридцатых годах, наряду с широким использованием того варианта, который был предложен Цветом и признан классическим, проявительного варианта жидкостно-адсорбционной хроматографии, и его усовершенствованием стали возникать и развиваться новые варианты метода. Прежде всего, был устранен существенный недостаток классического варианта. Дело в том, что Цвет получал хроматограмму на слое сорбента, поэтому для выделения разделенных веществ ему приходилось извлекать адсорбент из колонки и экстрагировать вещества. Таким образом, перед каждым анализом колонку нужно было заново заполнять адсорбентом. Японский ученый В. Кошара, в отличие от Цвета, после проявления зон на сорбенте продолжал подачу проявителя до тех пор, пока все разделенные вещества не выходили поочередно из колонки. Так была получена жидкая хроматограмма, или хроматограмма в элюате (в потоке, выходящем из колонки). Преимущества этого способа очевидны: во-первых, в руках у исследователя оказываются растворы каждого из разделенных веществ в проявителе, во-вторых, после окончания одного анализа в колонку можно сразу (или, если это необходимо, после отдувки растворителя воздухом) вводить следующую пробу. Одновременно хроматография развивалась и в других направлениях. Так, были разработаны бумажная и тонкослойная хроматография. Первое упоминание об этих методах содержится в работе советских ученых Н.А. Измайлова и М.С. Шрайбер (Харьковский химико-фармацевтический институт) «Капельные хроматографические методы анализа и их использование в фармакологии», опубликованной в 1938 г. Особенность проведения эксперимента заключалась в том, что сорбент, на котором проводили разделение, находился не в колонке, а был нанесен тонким слоем (2 мм) на стеклянную пластину. Слой готовили из пасты, состоящей из оксида алюминия, оксида магния или кальция и воды. Каплю исследуемого раствора (спиртового экстракта лекарственного растения) помещали на адсорбент и элюировали, постепенно нанося капли растворителя (спирта) в центр пятна. Хроматограмма при этом имела вид концентрических зон. Авторы сравнили затем полученные ими кольцевые хроматограммы с соответствующими колоночными хроматограммами (рис. 8) и указали на преимущество их нового метода. Работа русских исследователей заканчивается следующим выводом: «Разработан метод хроматографического адсорбционного анализа, основанный на разделении веществ в тонком слое адсорбента на зоны, при применении одной капли вещества. Результаты, полученные предложенным методом, качественно совпадают с результатами, полученными обычным методом адсорбционной хроматографии. Метод позволяет получить удовлетворительные результаты при затрате одной капли исследуемого вещества, очень небольших количеств адсорбента и за минимальное время. Метод можно использовать для анализа фармацевтических препаратов и их идентификации, а также для предварительной оценки сорбента и растворителя. Новым методом было изучено 16 фармацевтических препаратов».  Рисунок 8. Сравнение окраски флуоресценции настойки белладонны, полученной методом колоночной хроматографии на оксиде алюминия (1) и методом тонкослойной хроматографии (2) перед проявлением (а) и после проявления (б) этиловым спиртом [5])В 1940 г. шведский ученый A. Тиселиус разработал фронтальный и вытеснительный методы хроматографического анализа. С фронтальным вариантом мы уже познакомились; он отличается тем, что исследуемая смесь подается в колонку непрерывно. Этот метод наиболее близок к природным хроматографическим процессам. Вытеснительный метод основан на том, что более сильно адсорбирующееся вещество вытесняет с поверхности адсорбента слабо адсорбирующееся и занимает его место. Поэтому после введения в колонку определенного количества анализируемой пробы начинают подавать вытеснитель – жидкость, адсорбирующуюся сильнее всех компонентов смеси. Toгда зоны компонентов распределяются на слое по степени адсорбируемости и каждое последующее вещество, вытесняя предыдущее, протолкнет его вперед. Такой метод позволяет сконцентрировать компоненты на слое адсорбента и поэтому удобен, в частности, при определении примесей. Однако в общем случае он никак не может конкурировать с проявительным вариантом. Арне Тиселиус (A. Tiselius) Шведский биохимик Арне Вильгельм Каурин Тиселиус родился в Стокгольме. В 1921 г. Тиселиус поступил в Упсальский университет и в 1925 г. получил магистерскую степень. А. Тиселиус занимался исследованием электрофореза. А затем он обратил внимание на другой метод разделения – хроматографию. А. Тиселиус сумел доказать, что сыворотка белка, известная как глобулин, фактически состоит из трех видов, которые он назвал альфа-, бета- и гамма-глобулином. А. Тиселиус распространил хроматографию на разделение бесцветных веществ. А. Тиселиус изучил много вариантов хроматографии, включая использование элюата, адсорбируемого в целом сильнее, чем любое из разделяемых веществ. Эту технологию он назвал вытеснительным анализом. В 1948 г. А. Тиселиусу была присуждена Нобелевская премия по химии «За исследование электрофореза и адсорбционного анализа, особенно за открытие, связанное с комплексной природой белков сыворотки». А. Тиселиус, установив, что глобулин не является гомогенным веществом, заложил основы научноисследовательской работы, направленной на разделение плазмы крови человека на составные части. Хроматографический метод был подхвачен другими учеными. В частности, когда в 1933 году Винтерштайн из группы Куна посетил «Лабораторию пищевой химии Данна» в университете Кембриджа и продемонстрировал хроматографическое разделение каротиноидов, ему ассистировал двадцатитрехлетний инженерхимик Арчер Портер Мартин. Он был направлен в эту лабораторию, занимавшуюся проблемами питания, чтобы обнаружить витамин Е (токоферол). Год спустя Мартин приступил к собственным исследованиям по хроматографии. Он увидел некоторую аналогию: «Я был околдован сходством хроматографии и дистилляционной колонны. Механизмы разделения каротиноидов и разделение летучих веществ дистилляцией были похожи. Две фазы двигались друг относительно друга, и взаимодействия между ними определяли обмен веществ и их разделение». Ричард Лоуренс Миллингтон Синг получил стипендию на определение аминокислотной последовательности шерстяного волокна от Международного фонда шерстяной промышленности. А. Мартин помог ему сконструировать противоточный экстрактор с использованием воды и хлороформа. Целью работы было разделить смесь олигопептидов, которые образуются при разрушении протеинов волокна, на составные части, которые можно идентифицировать с тем, чтобы по ним установить исходную последовательность протеинов. В 1940 году Мартин вернулся в Лидс в научную лабораторию британской шерстяной промышленности, и Синг, после короткого размышления, последовал за ним, прихватив новую аппаратуру. Позже Синг писал: «Пока наша противоточная распределяющая машина работала, мы делили динитрофенилгидразоны альдегидов хроматографически на оксиде магния. Неудовлетворенные работой с хлороформно-водным экстрактором, мы подумали о том, нельзя ли его изменить таким образом, чтобы иметь только одну движущуюся фазу и чтобы при этом проба вводилась в точке подачи подвижной фазы, как при хроматографии». В результате решения задачи разделения аминокислот и их производных Мартином и Сингом были разработаны принципы распределительной хроматографии: они закрепляли одну из фаз (неподвижную фазу) на носителе, например, порошкообразном силикагеле, и затем заполняли им колонку. В качестве «растворителя», называемого в данном случае подвижной фазой, использовали хлороформ с добавкой этанола. Комплексы с метилоранжем в качестве индикатора позволяли наблюдать перемещение аминокислот по стеклянной колонке. Арчер Джон Портер Мартин (A. J. P. Martin) Арчер Джон Портер Мартин родился в 1910 г. в Лондоне, окончил Кембриджский университет и получил степень доктора в 1936 г. В 1938-1946 г.г. работал в Ассоциации производства шерсти, затем в Совете по медицинским исследованиям до 1956 г. затем консультантом многих компаний, в 1964-1974 г.г. в Эйндховене (Голландия). Лауреат Нобелевской премии по химии 1952 г. за открытие распределительной хроматографии. Командор Британской империи, награжден рядом медалей и орденом Восходящего Солнца. С Р. Сингом познакомился в 1937 г. и они вместе стали заниматься выделением кислот из шерсти. А. Мартин осуществил впервые двухмерную проявительную хроматографию, которая была использована для разделения пептидов. А. Мартин разработал теорию движения зон, связав скорость их перемещения с коэффициентами распределения, а применив теорию эквивалентных теоретических тарелок, описал законы их размывания. А. Мартин и А. Джеймс осуществили вариант газовой распределительной хроматографии и разработали метод газожидкостной хроматографии. Этот метод оказался особенно полезным для характеристики жирных кислот и смесей стероидов, имеющихся в микрограммовых количествах. Ричард Лоуренс Миллингстоун Синг (R. L. M. Synge) Ричард Лоуренс Миллингстоун Синг родился в 1914 г. в Ливерпуле, Англия. Окончил Тринити-колледж Кембриджского университета. Степень доктора Кембриджского университета получил в 1941 г. Работал в Промышленной Кампании по шерсти, в Институте превентивной медицины и институте исследования пищевых продуктов. Основной круг интересов – биохимия и анализ пептидов. В 1952 г. вместе с А. Мартином получил Нобелевскую премию «за открытие распределительной хроматографии». В 1941 г. А. Мартин и Р. Синг решили применить принцип противоточного распределения к методу хроматографии. Подход был назван распределительной хроматографией, так как в нем использовались и хроматография, и распределение растворенного вещества между двумя растворителями. Получив в 1943 г. докторскую степень, Р. Синг вошел в штат Листеровского института профилактической медицины в Лондоне в качестве биохимика. Занимаясь анализом пептидных антибиотиков, он продолжал в то же время сотрудничать с А. Мартином в совершенствовании метода распределительной хроматографии. А. Мартин и Р. Синг в 1944 г. разработали метод бумажной хроматографии, при котором в качестве носителя применяется фильтровальная бумага. В 1941 г. А. Мартин и Р. Синг продемонстрировали возможности распределительного варианта хроматографии и показали, что разделение веществ происходит в результате их распределения между двумя фазами растворителей [6]. Было установлено, что в основе разделения веществ методом распределительной хроматографии лежит закон распределения, а не адсорбционные явления, как в случае Цветовой хроматографии. Действительно, если имеем две жидкие, не смешивающиеся друг с другом фазы (например, вода-толуол, водабензол), и в одну из фаз ввести исследуемое соединение и тщательно перемешать фазы, то через некоторое время устанавливается равновесие распределения исследуемого соединения между фазами, которое описывается законом распределения. Теперь, если одну из фаз этой системы сделать неподвижной (например, закрепить на твердом носителе), заполнить этой фазой колонку и пропускать через колонку другую, не смешивающуюся с первой фазу, то при вводе в колонку смеси веществ они будут распределяться между фазами в соответствии с величинами коэффициентов распределения исследуемых соединений в данной системе фаз. В июне 1941 года А. Мартин и Р. Синг доложили результаты своей жидкость-жидкостной распределительной хроматографии Биохимическому сообществу в Лондоне, а 19 ноября 1941 года они отправили в «Biochemical journal» статью: «Новая форма использования двух жидких фаз для хроматографии», за которую в 1952 году получили Нобелевскую премию. В работе была также детально представлена теория процесса, которая, по мнению инженера-химика Мартина, находится в тесном родстве с процессом дистилляции. Так была постулирована «Высота, эквивалентная теоретической тарелке» (ВЭТТ), отрезок между двумя воображаемыми площадками, на котором устанавливается распределительное равновесие одного вещества между двумя фазами. ВЭТТ определяет эффективность разделения, и для хроматографии эта величина оказывается равной 20 мкм, что на порядки лучше, чем величина ВЭТТ в 10 мм, находимая для дистилляции. Марсель Юлий Эдуард Голей (M. J. E. Golay) Марсель Юлий Эдуард Голей родился в 1902 г. в Невшателе, Швейцария. Окончил Техническую высшую школу в Цюрихе. В 1931 г. получил степень доктора по атомной физике в Чикаго. За свою многолетнюю творческую жизнь достиг успехов в разных областях и получил 4 научных медали. Его интерес к газовой хроматографии возник в 1955 г. с теоретической оценки возможности использования полых колонок, исследования влияния различных параметров на эффективность колонок, включая способ введения и объем вводимой пробы. Эти труды оказали влияние на работы по повышению эффективности хроматографических колонок, в том числе и для препаративной хроматографии. В 1957 году М. Голей предложил использовать в качестве колонок длинные капилляры, что значительно повысило эффективность разделения. Использование капилляров дало возможность проводить детальный анализ смесей, включающих десятки и сотни компонентов. Таким образом, М. Голей создал вариант капиллярной хроматографии. Приблизительно в это же время были изобретены высокочувствительные пламенно-ионизационный и ионизационный детекторы, что в итоге обеспечило следующий качественный скачок в развитии газовой хроматографии. Хроматография оказала огромное влияние на развитие науки. Более десятка крупных работ, удостоенных Нобелевской премии, так или иначе, связаны с хроматографией. Например в 1958 г. Нобелевская премия была присуждена Ф. Сенгеру по химии «за установление структур белков, особенно инсулина». Он доказал, что белок может быть расщеплен на составляющие его аминокислоты с разрушением пептидных связей, а для разделения и идентификации аминокислот использовалась хроматография. В 1972 г. У. Стайну и С. Муру была присуждена половина Нобелевской премии по химии «за их вклад в прояснение связи между химической структурой и каталитическим действием активного центра молекулы рибонуклеазы». Для получения высокочистых образцов фермента рибонуклеазы использовалась ионообменная хроматография. В 2002 г. К. Танака стал Нобелевским лауреатом, разделив половину премии с Дж. Фенном, «за развитие методов идентификации и структурного анализа биологических макромолекул: за развитие методов мягкой десорбционной ионизации для массспектрального анализа биологических макромолекул». В настоящее время тандем хроматографии и масс-спектрометрии является неотъемлемым инструментом при анализе объектов окружающей среды, биоматериала для ранней диагностики соединений, в криминалистической химии, при допинговом контроле и т.д. В СССР с 1953 года стала официально функционировать Комиссия по хроматографии при Академии наук СССР, которая впоследствии была реорганизована в Научный совет по хроматографии. Существенный вклад в создание и развитие отечественной хроматографической школы внесли: А.А. Жуховицкий - хроматография вакантная, ступенчатая, итерационная и дифференциальная хроматография, хромадистилляция; А.В. Киселев - развитие газо-адсорбционной хроматографии, хроматоскопия; К.В. Чмутов - фундаментальные исследования равновесия, динамики и кинетики сорбции хроматографии, препаративная хроматография; Я.И. Яшин - развитие газо-адсорбционной хроматографии, хроматографическое приборостроение; Л.Н. Москвин, А.И. Горшков, М.Ф, Гумеров - жидкостногазовая хроматография; В.Г. Березкин - развитие газо-адсорбционной хроматографии, реакционная хроматография; И.А. Ревельский - газовая хромато-масс-спектрометрия для анализа примесей; Б.В. Иоффе, А.Г. Витенберг, Б.В. Столяров - развитие газовой экстракции; М.С. Вигдергауз, Л.А. Онучак - мезофазная хроматография; И.Г. Зенкевич - идентификация по индексам удерживания; Д.А. Вяхирев - разработка новых принципов и методов газовой хроматографии и внедрение их в промышленность, препаративная хроматография; В.А. Даванков - новый принцип разделения энантиомеров – лигандообменная хроматография на хиральных комплексообразующих сорбентах. Предложен принцип синтеза сверхсшитых полимеров стирола, на базе которых создана серия нейтральных полимерных сорбентов нового поколения; К.И. Сакодынский - развитие хроматографического приборостроения, труды по адсорбции и газовой хроматографии. Кроме того, следует отметить немалый вклад в развитие хроматографической науки и приборостроения Научного совета по аналитической химии и персонально академика РАН Золотова Ю.А. и члена-корреспондента РАН Шпигуна О.А.    |
Рисунок 5. Цвет М.С. (1872-1919 г.г.)