1 Жебентяев Александр Ильич
 Скачать 5.46 Mb.
|
|
2.5. Выбор методов изолирования и определения токсикантов 1. Основной задачей судебно-химической экспертизы является выбор оптимального метода изолирования веществ. Для обнаружения и идентификации химических и лекарственных веществ применяются как предварительные методы (цветные реакции, тонкослойная хроматография, иммуноферментные методы и т.д.), так и подтверждающие инструментальные (спектрофотометрия в видимой, УФ- и ИК-областях, атомно-абсорбционная спектрофотометрия, газожидкостная хроматография, хромато- масс-спектрометрия). При применении прямой УФ-спектрометрии следует учитывать влияние метаболитов и других загрязняющих соэкстрактивных веществ, а также чувствительность и недостаточную специфичность метода. При применении газовой и жидкостной хроматографии для уменьшения ошибок, связанных с адсорбцией на поверхности, потерь в процессе экстракции, при выпаривании растворителей, дериватизации и невоспроизводимости, обусловленной различной техникой ввода, следует использовать метод внутреннего стандарта. Внутренний стандарт должен обладать физико-химическими свойствами, сходными с анализируемым веществом. Хроматографические свойства внутреннего стандарта должны быть такими, чтобы он элюировался с анализируемым веществом и отличался от остальных веществ, которые могут присутствовать. По возможности нужно использовать гомолог анализируемого вещества, который должен также растворяться и равномерно смешиваться с анализируемой пробой. 2. Многие лекарственные вещества и другие токсикологически важные вещества метаболизируются в организме и превращаются в полярные и конъюгированные метаболиты, которые ввиду низкой летучести трудно поддаются газохроматографической идентификации. Кроме того, конъюгаты трудно изолируются обычными 32 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ экстракционными методами, поэтому предпочтительно разрушать конъюгаты с помощью кислотного гидролиза перед экстракцией, а затем экстрагировать метаболиты, подвергать дериватизации для улучшения термической стабильности и увеличения их летучести. Однако, следует учитывать, что некоторые вещества подвергаются изменениям во время упомянутых аналитических процедур (кислотный гидролиз, дериватизация, термические превращения при газохроматографическом процессе и т.д.) и это может быть дополнительным признаком для идентификации нативных веществ и их метаболитов. 3. Исследование может быть произведено на определенное соединение, группу веществ или на неизвестное вещество по схеме общего судебно-химического исследования в зависимости от вопросов, поставленных в сопроводительном документе. 4. Если в ходе исследования возникает необходимость в проведении анализа на другие вещества, то эксперт обязан расширить исследование. 5. Для исследования всегда нужно применять лишь те методы и процедуры, с которыми эксперт ранее ознакомился, владеет ими, знает все условия воспроизведения, сможет учесть все ошибки, которые возникают при их применении. Любые изменения метода или процедуры должны быть четко документированы, объяснены причины их изменения. Все изменения должны быть согласованы с заведующим отделом. 6. В отделе судебно-химических экспертиз должны иметься разработанные рекомендации для всех используемых стандартных методик. Все методики должны быть апробированы. Любые изменения методик должны быть мотивированы и обоснованы. 7. В зависимости от поставленных задач разрабатывается соответствующая схема анализа. Если анализ направлен на обнаружение одного яда или группы веществ, то применяют специально разработанные частные методики. По возможности должно быть применено не менее двух независимых методов, каждый из которых основан на различных физических или химических принципах для надежной идентификации. Если потребуется обнаружить или исключить широкий круг ядов без специального задания (общий ход анализа на «неизвестное» вещество), то необходимо применить комплексный подход для систематического хода исследования, целью которого является обнаружение токсических веществ, их идентификация и количественное определение. Для этого следует провести скрининг-анализ с последующим применением подтверждающих методов, основанных на различных аналитических принципах. Результаты каждого метода сравнивают с 33 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ соответствующими данными, что позволяет ограничить круг подозреваемых веществ. В случае обнаружения какого-либо соединения для надежной идентификации последнего необходимо произвести сравнительный анализ предполагаемого токсического вещества с соответствующим стандартом подлинного вещества или применить метод добавок к биологическому материалу, а также учесть результаты контрольного опыта. 8. Каждое судебно-химическое исследование следует проводить как количественное исследование, в которое оно и может быть превращено на любой стадии работы. Объекты для всех испытаний берут по массе, а получаемые при анализе дистилляты, диализаты, фильтраты – по объему. 9. Количественное определение производят во всех случаях, где это возможно и имеются соответствующие методики определения. Количества найденных веществ относят к 100 г взятой для анализа навески объекта. 10. Все методы количественного определения должны быть апробированы на той биологической матрице, которая будет использоваться для анализа (кровь, моча, ткани органов), к которой добавляют заведомо известное количество вещества и подвергают исследованию по данной схеме анализа. При этом определяют пределы обнаружения и определения, абсолютный выход при различных концентрациях, диапазон определяемых содержаний для калибровочного графика (подчинение закону Бугера-Ламберта-Бера), селективность, воспроизводимость анализа. Для повышения точности определения обнаруживаемого вещества проводится0 не менее двух определений для каждого объекта. 11. Следует убедиться в химической чистоте используемых для анализа реактивов, при этом на чистоту реактивы проверяют в тех максимальных количествах, в которых они будут употреблены для анализа и теми же методами и реакциями, которые будут применены в ходе судебно-химического исследования. 12. Для обеспечения высокого качества производства экспертизы рекомендуется производить внутрилабораторный и внешний контроль качества, ориентированный как на метод, так и на определяемое вещество. 2.6. Помещение и оборудование для производства судебно-химических экспертиз 1. Судебно-химические экспертизы вещественных доказательств производят в специально оборудованных для химических работ помещениях, имеющих вытяжные шкафы с 34 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ вентиляционной установкой, подводкой газа и воды, хорошее естественное освещение, отопление, вентиляцию, оборудованные силовой электроэнергией, контуром заземления. Доступ в отдел должен быть ограничен для посторонних лиц. 2. Помещение должно соответствовать санитарным нормам и позволять выполнять работу на современном научном уровне. В отделе судебно-химических экспертиз должны быть обеспечены условия для работы с инфицированным и токсичным материалом. Отдел судебно- химических экспертиз включает: помещение для лабораторных мест специалистов, аппаратуры и оборудования (в том числе, холодильных установок, морозильных камер, центрифуг), кабинеты специалистов, моечную комнату, подсобные помещения для хранения реактивов, химической посуды, архива. 3. При оборудовании помещений отдела судебно-химических экспертиз должны быть учтены условия техники безопасности. 4. Отдел судебно-химических экспертиз должен быть изолирован от других отделов управления и по окончании работы запираться и опечатываться печатью. 2.7. Документация судебно-химических экспертиз Документация оформляется в соответствии с уголовно- процессуальным законодательством Республики Беларусь и инструктивно-методическими документами и приказами. Все вещественные доказательства, поступающие в лабораторию и сопроводительные документы к ним, регистрируются по строго определённой форме. Регистрация проводится в специальной книге, пронумерованной и скреплённой печатью. Каждый эксперт имеет рабочий журнал, в который вносятся все необходимые данные по производимому исследованию. Заключение эксперта оформляется по определенной форме. Оно состоит из вводной, исследовательской (описание объектов исследования и химическое исследование) частей и выводов. Во вводной части должны быть указаны: - название экспертизы и ее номер; - время и место производства экспертизы; - постановление или определение, на основании которого производится экспертиза; - фамилия, имя, отчество эксперта, занимаемая должность, образование специальность и стаж работы, квалификационная категория, ученая степень, ученое звание. 35 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ При экспертизе вещественных доказательств перечисляют объекты исследования, с указанием фамилии, имени, отчества, возраста лица, кому они принадлежали. Во вводной части указывают перечень вопросов, поставленных на разрешение экспертизы, отмечают дату начала и окончания исследования. Вводная часть также содержит обстоятельства дела и подписку государственного судебно-медицинского эксперта о разъяснении ему процессуальных прав и обязанностей и об его ответственности. В исследовательской части при экспертизе вещественных доказательств проводится подробное описание вещественных доказательств, изложение примененных методов исследования и полученных результатов с указанием используемых реагентов, аппаратуры и оборудования, процесса анализа. При составлении «Заключения эксперта» следует соблюдать определенные правила: заключение составляется на обеих страницах листа; поля нужно оставлять на нечетных страницах слева, на четных – справа, чтобы удобно было брошюровать. Пропуски прочеркивать. Нельзя сокращать слова, вводить условные обозначения, писать химические формулы. В местах исправлений следует писать: «Исправленному верить» и подпись. Выводы в заключении эксперта являются научно-обоснованным мнением эксперта, сформулированным на основании результатов произведенной им экспертизы. В выводах указывают в каких органах и в каком количестве (на 100 г органов) обнаружены или не обнаружены токсические вещества. Выводы оформляются в соответствии с поставленными вопросами. Их следует излагать ясно и конкретно. В выводах сначала пишут: обнаружено (перечислить в строчку обнаруженные вещества), затем – не обнаружено (перечислить остальные вещества, которые не обнаружены). «Заключение эксперта» должно иметь подпись государственного медицинского судебного эксперта, печать, дату окончания оформления. «Заключение эксперта» и приложение к нему (таблицы, схемы, рисунки и др.) составляются не менее, чем в двух экземплярах, один из которых передается органу, назначившему экспертизу, а другой остается на хранении в архиве. Экспертиза вещественных доказательств оформляется в процессе производства экспертных исследований записями в рабочем журнале, на основании которых после окончания экспертных исследований составляется заключение эксперта. 36 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ «Заключение эксперта» должно быть направлено органу, назначившему экспертизу, не позднее чем через три дня после окончания всех экспертных исследований. Срок проведения судебно-медицинской экспертизы со всеми экспертизами, проводимыми в лаборатории, не должен превышать одного месяца со дня получения от органа или лица, назначившего экспертизу, всех необходимых материалов и объектов исследования. В случае возможного или фактического превышения этого срока государственный медицинский судебный эксперт должен своевременно предупредить об этом орган, назначивший экспертизу, и руководителя управления, мотивированно указав причину. Запрещается подменять заключение эксперта краткими выписками и справками, а также применять неутвержденные формы и бланки. В целях единого подхода учета экспертной работы в отделе разработаны условные единицы пересчета (полные химические анализы) судебно-химических исследований неизвестных веществ в соответствии с коэффициентами пересчета судебно-химических исследований. 2.8 . Оценка результатов судебно-химического исследования Заключение эксперта-химика, как и другого эксперта, является научным методом, способствующим правильному разрешению вопросов. Так, отрицательный результат исследования биоматериала на наличие токсических веществ не всегда указывает на отсутствие ядовитых веществ (в анализе были использованы малочувствительные, неизбирательные методы). Эксперт-химик не может говорить об отсутствии веществ, он делает вывод: обнаружены или не обнаружены ядовитые вещества. Действие яда зависит от ряда факторов: 1. Доза. В зависимости от дозы одно и то же химическое вещество может быть ядом и лекарством (стрихнин, атропин, соединения мышьяка, ртути). 2. Физические и химические свойства веществ. Так BaSO 4 при приёме внутрь не ядовит, т.к. нерастворим в воде и НСl желудка, а BaCl 2 при приёме внутрь ядовит. 3. Состояние организма (возраст, пол, состояние здоровья). 4. Усиление действия ядов в присутствии других веществ (барбитураты и алкоголь) – синергизм или антагонизм (кислота– щёлочь) – действие ослабляется. Обнаружить ядовитое вещество в биоматериале весьма сложно: 37 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ 1. Разнообразие объектов исследования (кровь, моча, внутренние органы трупов, пищевые продукты, остатки лекарственных средств, технические жидкости, наркотические средства, растительные объекты). В зависимости от вида объекта исследования одно и тоже токсическое вещество изолируется разными методами. Например, атропин из органов трупа изолируют полярными растворителями (вода, этанол), а из крови атропин извлекают экстракцией органическими растворителями (хлороформ). 2. Трудность изолирования малых количеств токсических веществ из биологического материала. 3. Неравномерное распределение – одни, главным образом, попадают в кровь (этанол), другие распределяются по органам и тканям. Некоторые вещества выводятся частично с рвотными массами, мочой и другими путями. 4. Вещества вступают во взаимодействие с тканями организма. 5. Химические вещества подвергаются в организме многочисленным превращениям (метаболизм). 6. Необходимость применения высокочувствительных методов определения токсикантов. 7. Необходимо учитывать естественное содержание некоторых определяемых веществ («металлические» яды). 8. Трудность в оценке результатов, так как нет количественного выхода при изолировании. 9. Влияние сопутствующих веществ (т.е. эндогенных) на результаты качественного и количественного определения токсических веществ. Эксперт-химик, производящий анализ биоматериала, в заключении своего исследования никогда не может утверждать об отсутствии того или иного ядовитого вещества в объекте исследования. Он может говорить лишь об обнаружении или не обнаружении веществ в исследуемом материале. Вопрос, явилось ли найденное вещество причиной отравления или смерти, решают другие специалисты. 2.9 . Предварительные испытания и пробоподготовка Результаты предварительных проб имеют большое значение для составления плана судебно-химического исследования. Предложен ряд хромогенных (цветных) тестов при исследовании мочи: аналитические реакции на восстановители (спирты и другие восстановители – дихроматный тест), окислители (дифениламиновый тест), алкилгалогениды (тест Фудживара), производные фенотиазина (тест FPN ), йодоформная проба (этанол, ацетон), флуоресцентный тест на хинин, реактив Марки на производные морфинана, реакция Витали- 38 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ Морена для обнаружения атропина и скополамина, мурексидная проба на алкалоиды пуринового ряда, ферро-феррицианидный тест и др. Цветные тесты применяются и при предварительном исследовании дистиллятов и экстрактов, полученных из кислых и щелочных растворов. Предварительные пробы неспецифичны и имеют отрицательное судебно-химическое значение. В биологических объектах наряду с токсическими веществами и их метаболитами присутствуют фоновые соединения (белки, жиры, аминокислоты, пептиды, пигменты и другие). Подготовка биопроб для исследования состоит из нескольких этапов: 1. Измерение массы (объема) пробы. 2. Высвобождение токсиканта (метаболитов) из клеток пробы. 3. Добавление внутреннего стандарта. 4. Отделение белков. 5. Осветление пробы (центрифугирование, фильтрация). 6. Контроль рН или изменение рН пробы. 7. Экстракция, реэкстракция. 8. Концентрирование. 9. Химическое превращение исследуемых веществ в удобные для анализа производные. Предварительная обработка биопроб имеет решающее значение для получения правильных результатов. С одной стороны обработка должна быть как можно проще, это облегчает и ускоряет проведение анализа, а также снижает возможность ошибок, так как любая операция (даже перенос пробы из одного сосуда в другой) не может быть проведена без потерь. С другой стороны обработка должна быть достаточно полной для создания оптимальных условий анализа. При этом должны быть выполнены два условия: 1) необходимо в процессе обработки удалить все эндогенные вещества, которые могли бы мешать проведению количественного анализа; 2) обработка должна защищать аналитический прибор от веществ, которые могли бы загрязнить его (липиды, белки, взвешенные частицы). Обработка проб крови. Объем циркулирующей крови в организме человека составляет около 7% массы тела, т.е. примерно 5 л. Общий объем плазмы крови у человека – 4% от массы тела, что составляет около 3 л. Концентрация белков в плазме – 70–80 мг/мл, из них больше половины (40–50 мг/мл) – альбумины, с которыми в основном связываются лекарственные вещества в крови. Основную часть других белков (до 25 мг/мл) составляют глобулины. К ним относится и фибриноген (∼3 мг/мл) – белок, ответственный за 39 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ свертывание крови. При этом процессе фибриноген превращается в волокнистый фибрин, образующий сгусток. После отделения сгустка, захватывающего и форменные элементы, остается сыворотка крови, которая отличается от плазмы крови только отсутствием фибриногена. Основные биохимические показатели крови представлены в таблице 2.1. Таблица 2.1. Биохимические показатели крови Показатель Содержание в сыворотке. Альбумины 35- 50 г/л α 1 – глобулины 2,3- 4,2 г/л α 2 – глобулины 5,4- 10,0 г/л β – глобулины 6,0- 12,0 г/л γ – глобулины 6,0- 15,0 г/л Билирубин (прямой) 2,2- 5,1 мкмоль/л Креатинин 80- 150 мкмоль (мужчины) 53- 97 мкмоль (женщины) Холестерин (холестерол) 3,6- 5,0 ммоль/л Мочевая кислота 180- 340 мкмоль/л Мочевина 2,5- 8,3 мкмоль/л Кальций (общий) 2,15- 2,55 мкмоль Натрий 136- 145 мкмоль/л Фосфор 0,646-1,292 ммоль/л Глюкоза 3,3- 5,5 ммоль/л (капиллярная кровь) 3,5- 6,4 ммоль/л (венозная плазма) В плазме (сыворотке) крови содержится около 7,5 мг/мл минеральных солей и 4–8 мг/мл различных липидов, в том числе 2–2,5 мг/мл фосфолипидов. В сыворотке крови находится много эндогенных низкомолекулярных органических веществ, которые потенциально могут мешать проведению анализа: гормоны, биогенные амины, витамины, креатин, креатинин, билирубин, мочевая кислота, мочевина и др. В сыворотке крови имеется буферная система значительной емкости, эта система в норме поддерживает рН крови с большим постоянством (рН 7,3–7,4). Определение лекарственных веществ в цельной крови не всегда дает нужный результат, так как для многих веществ отмечено накопление их в форменных элементах крови (в большей степени в 40 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ эритроцитах). Наиболее удовлетворительным следует считать анализ сыворотки или плазмы крови. Большая часть лекарственных веществ не связывается в значительной степени с фибрином, поэтому результаты анализа сыворотки и плазмы оказываются практически одинаковыми. Для определения таких веществ удобнее работать с сывороткой крови. Как известно, получение устойчивых в отношении свертывания образцов плазмы крови требует добавления к пробе антикоагулянтов. Обычно применяются гепарин, агенты, связывающие ионы кальция, ЭДТА, соли лимонной кислоты (цитраты) или фтороводородной кислоты (фториды). Добавление растворов этих веществ создает ряд методических проблем: необходимо учитывать разбавление образца, особенно при малых объемах крови, взятой, например, из пальца; добавленные реагенты могут оказывать влияние на результаты анализов. Фториды могут служить также в качестве консервантов плазмы, в частности, фторид-ионы ингибируют сывороточную холинэстеразу, которая при хранении образцов плазмы может гидролизовать некоторые лекарственные вещества (например, кокаин, ацетилсалициловую кислоту, новокаин). Многие лекарственные вещества связываются (иногда на 90% и более) с белками сыворотки крови, в основном с альбумином, реже – с глобулинами. В то же время большинство методов определяет общую концентрацию в виде суммы связанного и несвязанного с белками лекарственного вещества в крови (плазме, сыворотке). Для веществ слабо связанных (до 30%) с белками суммарная концентрация в сыворотке близка к уровню свободного вещества. При использовании большинства методов обработки образцов сыворотки или плазмы создаются условия для разрушения комплекса определяемого вещества с белками и в результате определяется общее количество препарата (метаболита) в образце. Необходимо, чтобы высвобождение вещества из комплекса было либо полным, либо постоянным от опыта к опыту. Все операции по обработке проб должны проводиться в строго одинаковых условиях для всех стандартных (контрольных) и анализируемых проб. Одинаковым должно быть время и интенсивность перемешивания фаз при экстракции из сыворотки (плазмы), объем пробы и экстрагента, рН водной фазы, чистота экстрагирующего растворителя и даже объем и форма сосуда, в котором проводится процесс экстракции. Такие требования строгой стандартности условий относятся и к другим процессам обработки образцов – центрифугированию, процессам дериватизации и т.д. В ряде методов анализ проводится в так называемом безбелковом фильтрате крови или других тканей, т.е. после осаждения 41 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ белков тем или иным способом. Осаждение проводится тремя группами методов: 1) добавлением смешивающихся с водой органических растворителей (спирт, метанол, ацетон, ацетонитрил), как правило, используется 5–10-кратное количество растворителя по сравнению с объемом пробы; 2) добавлением химических агентов для коагуляции белков: кислот (например, трихлоруксусная или хлорная кислоты), ионов тяжелых металлов (например, бария) и т.д.; 3) термическая обработка. Осаждение белка – весьма ответственная операция, при которой есть опасность исказить результаты анализа: в случае адсорбции значительного количества определяемого вещества на скоагулированном белке или при взаимодействии этого вещества с агентами, добавленными для осаждения белка (разрушение под действием кислот, комплексообразование с солями металлов и т.д.); при анализе термолабильных веществ не целесообразно использовать для осаждения белков термическую обработку. Реагенты, добавляемые для осаждения белков, могут мешать дальнейшему проведению анализа. Разбавление органическими растворителями значительно снижает чувствительность метода, добавление кислот и солей может неблагоприятно сказаться на результатах анализа с помощью газовой хроматографии, так как может необратимо загрязнить колонку, что снизит её разделяющую способность при последующих анализах. После осаждения белков и их отделения (например, центрифугированием) применяется обычно дальнейшая обработка – упаривание добавленного растворителя в токе инертного газа или в вакууме; осаждение ионов тяжелых металлов (например, сульфат-ионом осаждают ионы бария); подщелачивание кислот, добавленных ранее для коагуляции белков; экстракция анализируемого вещества из безбелкового фильтрата и т.д. Все этапы осаждения, отделения белка и последующей обработки безбелкового фильтрата при разработке методики анализа должны быть тщательно проверены в предварительных контрольных опытах, чтобы вовремя выявить перечисленные выше неблагоприятные факторы и избежать ошибок в анализе, изменив соответствующим образом технику обработки проб. Обработка проб мочи. С мочой выделяются в разной степени почти все лекарственные вещества и их метаболиты. Во многих случаях это основной путь очищения организма от чужеродных соединений и продуктов их биотрансформации. 42 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ Таблица 2.2 Биохимические показатели мочи Вещества Содержание, ммоль/сутки Белки До 30 мг (не обнаруживаются основными лабораторными методами) Кетоновые тела 20– 50 мг (не обнаруживаются основными лабораторными методами) Глюкоза и другие моносахариды 0,3–1,1 ммоль (не обнаруживаются основными лабораторными методами) Мочевина 333– 583 ммоль Мочевая кислота 2,35–5,9 Креатинин 4,4–17,6 Аминокислоты 0,29–5,35 Аммонийные соли 30–60 Гиппуровая кислота До 5,5 Натрий 174–222 Калий 61–79 Кальций 4,02–4,99 Фосфор Около 33 Моча образуется в почках из плазмы крови и содержит лишь те вещества (эндогенные и экзогенные), которые приносятся к почкам кровью (таблица 2.2). Однако состав мочи значительно отличается от состава плазмы крови, что определяет особенности методов определения токсикантов в моче. Моча в норме практически не содержит белков, глюкозы, но в ней в 50–100 раз выше, чем в плазме, содержание мочевины, примерно вдвое выше концентрация минеральных солей, в 8–10 раз больше уровень мочевой кислоты, креатинина. За сутки с мочой выделяется 50–70 г сухих веществ. Эти растворенные вещества повышают плотность мочи в среднем до 1,015– 1,025 г/мл. В моче много минеральных веществ – за сутки выделяется примерно 20 г солей, в основном хлориды натрия и калия. Это снижает температуру замерзания мочи до -1,3–2,3 , что нужно учитывать при лиофилизации проб. Концентрация ионов водорода в моче подвержена значительным колебаниям; в норме рН мочи находится в интервале от 4,5 до 8,0. 43 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ Величина рН зависит от получаемой пищи (при белковой диете рН снижается, при растительной – повышается), от физической нагрузки (при повышенной нагрузке моча становится кислой), от принимаемых лекарственных средств, патологических процессов (при гипервентиляции, гипокалиемии происходит подщелачивание мочи, а при голодании, тяжелой диспепсии, ацидозе, напротив, отмечается кислая реакция). При определении лекарственных веществ необходимо контролировать рН мочи, а во многих случаях целесообразно менять величину рН для проведения анализа в стандартных условиях, например, подщелачивая пробу или добавляя к ней буферный раствор с большой буферной емкостью. Эндогенные вещества, растворенные в моче, могут затруднять проведение химико-токсикологического анализа. Минеральные соли и мочевина загрязняют колонки при использовании методов газожидкостной хроматографии. Некоторые эндогенные вещества в моче поглощают свет в ультрафиолетовой области, осложняя прямое применение спектрофотометрического метода определения концентрации токсиканта в моче. Поэтому перед проведением количественного определения токсикантов в большинстве случаев пробу предварительно обрабатывают. Моча часто, особенно при патологических процессах, содержит взвешенные частицы, от которых обычно избавляются фильтрацией через плотный фильтр или центрифугированием. Белки, если они есть в моче и могут мешать анализу, осаждают и отделяют теми же методами и с теми же предосторожностями, что и в случае обработки сыворотки крови. От большей части минеральных солей можно освободить мочу пропусканием образца через колонку с ионообменной смолой. Один из самых распространенных методов обработки мочи при определении липофильных веществ является экстракция органическими растворителями, не смешивающимися с водой. В большинстве случаев добиваются возможно более полного перевода определяемого вещества в органическую фазу, а соли, мочевина, мочевая кислота, аминокислоты, глюкурониды и другие гидрофильные вещества остаются в основном в водной фазе. Необходимо проводить экстракцию всех образцов (исследуемых и контрольных) в строго одинаковых условиях по всем параметрам. Многие гидрофильные вещества невозможно достаточно полно экстрагировать из пробы мочи. Эта проблема особенно остро встает при определении метаболитов многих лекарственных веществ, поскольку при биотрансформации полярность молекул лекарственных веществ обычно резко увеличивается – вводятся гидроксильные группы, образуются N- и S-оксиды, происходит конъюгация с такими 44 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ полярными группировками, как остатки глюкуроновой и серной кислот и т.д. Обработка проб при анализе таких полярных соединений зависит от применяемого аналитического метода. Наиболее пригодными в этом случае являются методы, позволяющие проводить исследования в водной или водно- органической фазе. К ним, в первую очередь, можно отнести высокоэффективную жидкостную хроматографию, а также полярографию, спектрофотометрию, иммунохимические методы и некоторые другие. При анализе этими методами можно избежать экстракции анализируемых веществ из мочи. При исследовании другими методами (газожидкостная и тонкослойная хроматография, адсорбционная жидкостная хроматография с использованием несмешивающихся с водой элюентов и др.), когда использование водных растворов невозможно или нежелательно, применяют особые методы перевода анализируемого вещества из мочи в органический растворитель. Если подлежащее исследованию вещество растворимо в одном из гидрофильных растворителей (метанол, этанол, ацетон, диметилформамид, диметилсульфоксид, пиридин), то можно удалить из пробы мочи воду и из сухого остатка извлечь анализируемое вещество или метаболит таким растворителем. При этом удается в значительной мере избавиться от минеральных солей, белков и некоторых других веществ, слаборастворимых в выбранном растворителе. Удаление воды из образцов мочи проводят упариванием при небольшом нагревании ( 40 ) в вакууме с применением роторного испарителя, а лучше – лиофильной сушкой замороженного образца. Другим методом обработки может быть химическая трансформация определяемого вещества (метаболита) с образованием вещества, которое можно извлечь жидкостной экстракцией. Это в первую очередь относится к определению некоторых конъюгатов (глюкурониды, сульфаты и др.). Гидролиз конъюгатов можно проводить нагреванием с кислотами (соляная, серная). Однако такая жесткая обработка может привести не только к ожидаемому гидролизу, но и более глубокой деструкции определяемого вещества, и поэтому кислотный гидролиз имеет ограниченное применение – лишь для термо- и кислотоустойчивых веществ. Более универсальным является ферментативный гидролиз с применением глюкуронидазы и сульфатазы, причем часто используется смесь ферментов для одновременного гидролиза сульфатной и глюкуронильной группы. В последние годы ферментативный гидролиз конъюгатов почти полностью вытеснил кислотную обработку проб. Для переведения исследуемых веществ в удобную для определения форму применяют также препаративные 45 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ хроматографические методы – колоночную адсорбционную, тонкослойную и бумажную хроматографию. В последних двух случаях после высушивания пластин или хроматографической бумаги определяют зоны, в которых находятся анализируемые вещества, и элюируют их специально подобранным органическим полярным растворителем. При использовании колоночной хроматографии один из таких растворителей применяют для элюирования веществ из колонки, собирают нужные фракции и, если необходимо, концентрируют элюат в вакууме. При обработке проб мочи необходимо учитывать, что некоторые патологические процессы приводят к значительным количественным и качественным изменениям мочи. Может образоваться очень мало мочи и содержание солей, мочевины и других веществ в ней может быть очень высоким. При некоторых заболеваниях или при приеме диуретиков, напротив, суточный объем мочи может значительно возрасти и поэтому концентрация определяемых веществ будет низкой, что приводит к необходимости дополнительного концентрирования. В моче больных может содержаться кровь, различные бактерии (бактериурия), белки, может резко повышаться содержание билирубина, порфиринов, что значительно изменяет оптические свойства мочи, это необходимо учитывать при использовании спектрометрических методов. Наличие бактерий в биологическом материале (или попадание их извне в пробу) создает дополнительные сложности при сборе и хранении проб. В присутствии бактерий в пробах происходит ряд биохимических процессов: гидролиз мочевины с образование аммиака, трансформация глюкозы, расщепление белков, изменение рН, возможны также процессы химической трансформации определяемых веществ – гидролиз, окислительно-восстановительные процессы и др. Для предупреждения этих процессов к пробе добавляют различные вещества: толуол, хлороформ, борную кислоту, тимол. Естественно, что всякие добавки могут быть не безразличны для последующего анализа, и их влияние должно быть тщательно проверено контрольными опытами. Целесообразно собирать пробы в стерильные сосуды и хранить их в условиях, затрудняющих бактериальное загрязнение. В общем случае образцы при необходимости лучше хранить в замороженном виде в низкотемпературной холодильной камере (-10–20 ). Близким к идеальным условиям длительного хранения является хранение образцов после лиофилизации в запаянных ампулах, заполненных инертным газом (азот, гелий, аргон и др.). Анализ органов и тканей требует предварительной обработки с целью разрушения целостности тканей и клеточных структур. Гомогенизация (измельчение) производится с помощью 46 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ гомогенизаторов, ультратураксов (высокоскоростные турбины), ультразвука. Измельчение волос проводят путем растирания в ступке с песком, стеклом. Для обезвоживания (лиофилизации) используют безводные сульфаты натрия, кальция в эксикаторах под вакуумом или лиофильные сушки. Для удаления липидов используют экстракцию, вымораживание, сепарационные и другие методы. При судебно-химических исследованиях биологических объектов проводят удаление белков с применением растворителей (этанол, ацетон, ацетонитрил), кислот и солей. Осадки белков затем отделяют центрифугированием или фильтрованием. Основными методами выделения и концентрирования токсикантов органической природы (лекарственные и наркотические вещества) являются жидкофазная и твердофазная экстракция. При определении неорганических токсикантов (тяжелые металлы, мышьяк, сурьма и др.) биологическую матрицу разрушают методами минерализации. Иммунохимические и цветные тесты не требуют сложной пробоподготовки, однако они имеют ограниченное применение. 2.10. Реактивы и посуда В зависимости от назначения различают две основные группы реактивов: общие и специальные реактивы. Общие реактивы имеются в любой лаборатории: кислоты (хлороводородная, серная, азотная), щёлочи (гидроксид натрия, гидроксид калия, раствор аммиака), оксиды кальция и бария, ряд солей, индикаторы. Специальные реактивы применяются для определенных видов работ. По чистоте реактивы бывают химически чистые (х.ч.), чистые для анализа (ч.д.а.), чистые (ч.). Кроме того, имеются реактивы квалификации: технический (техн.), очищенный (оч.), особой чистоты (ос.ч.), высшей очистки (в.о.), спектрально чистый (сп.ч.). Для реактивов каждой из категорий установлено определенное допустимое содержание примесей. Все применяемые в лаборатории методики должны снабжаться перечнем реактивов с указанием степени чистоты, необходимой для получения точных результатов. Перед тем как поместить реактив в банку для хранения, её нужно хорошо вымыть и высушить. Излишки раствора, не использованного в работе, также не рекомендуется выливать обратно в склянку, где он раньше хранился. Некоторые реактивы при продолжительном хранении изменяются или даже разлагаются. Такие реактивы перед употреблением очищают для повышения точности определения. При этом предварительно можно 47 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ проверить чистоту препарата с помощью качественных реакций. Способ очистки реактива (перегонка, фильтрование, перекристаллизация, экстракция) зависит от свойств очищаемого вещества. В отдельных случаях применяют специальные методы очистки (диализ, осаждение, комплексообразование, образование летучих соединений, зонная плавка, хроматография, ионный обмен и др.). Если при фильтровании получается мутный фильтрат, его пропускают повторно или многократно через один и тот же фильтр. Процесс фильтрования зависит от физико-химических свойств веществ, от отношения пор фильтра и размеров твердых частиц, отделяемых от жидкости, других факторов. В качестве фильтрующего материала используют фильтровальную бумагу, асбест, кварцевый песок, адсорбенты (активированный уголь, силикагель и др.), стекловолокно и т.д. Различают обычные и беззольные бумажные фильтры. На каждой пачке указана масса золы фильтра. Если после запятой стоят четыре нуля (например, масса золы одного фильтра 0,00007 г) – фильтр беззольный; при взвешивании на аналитических весах такая масса золы не скажется на результатах взвешивания после сжигания фильтра. Если после запятой три нуля (например, масса золя одного фильтра 0,0003 г) – это обычная фильтровальная бумага. Различие фильтров по плотности обозначается цветом бумажной ленты, которой оклеивают упаковку готовых фильтров. Розовая (или черная) лента (диаметр пор 10 нм) – наименее плотные, быстро распускающиеся фильтры; белая лента (3 нм) – фильтры средней плотности, применяемые для отделения большинства кристаллических осадков; синяя лента (1–2,5 нм) – баритовые, наиболее плотные и медленно распускающиеся фильтры; желтая лента – обезжиренные фильтры. При выборе фильтра руководствуются количеством отделяемого осадка – осадок должен заполнить не более половины объема фильтра, иначе возникнут затруднения с его промыванием. Ускорить фильтрование можно под вакуумом и при нагревании. При фильтровании жидкость наливают в воронку до половины её высоты, отсасывание продолжают до тех пор, пока с конца воронки не перестанет капать жидкость; выключают насос, воронку вынимают, находящееся в ней вещество выкладывают на лист фильтровальной бумаги вместе с фильтром, подсушивают, фильтр отделяют от ещё влажного осадка. Разделение смеси жидкости и твердого вещества иногда проводят с применением центрифуги. Для получения химически чистых веществ применяют процесс перегонки (дистилляции) жидкости. Прибор для перегонки состоит из колбы Вюрца, холодильника и приемника. Перегоняемая жидкость должна занимать не более 2/3 объема колбы. Для облегчения кипения в колбу вносят «центры кипения» (стеклянные трубочки, кусочки 48 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ фарфора и др.). Некоторые твердые вещества – иод, сера, хлорид аммония и др., способные возгоняться (то есть при нагревании испаряться, минуя жидкое состояние) очищают возгонкой или сублимацией. Простейшее устройство для возгонки – стакан, поставленный на песчаную баню и накрытый круглодонной колбой с холодной водой или часовым стеклом с кусочками льда. На холодной поверхности пары конденсируются в кристаллы. Технический иод (6 частей) перед возгонкой смешивают с KJ (1 часть) и CaO (2 части) и растирают. В аналитических лабораториях широко применяется экстракция как способ очистки. Экстракция – извлечение вещества из раствора другим растворителем, не смешивающимся с первым растворителем. В основе метода экстракции лежит закон распределения вещества между двумя несмешивающимися жидкостями, а также различная растворимость отдельных веществ в данном растворителе (если вещество извлекают из смеси с другими веществами). В простейшем случае экстрагирование из раствора проводят в делительной воронке. Раствор из которого нужно извлечь вещество, наливают в делительную воронку до половины ее и добавляют туда подобранный растворитель (например, диэтиловый эфир, петролейный эфир, бензин, бензол, гексан и др.) в количестве половины взятого раствора. Делительную воронку закрывают, одной рукой придерживают пробку, другой рукой – кран и воронку многократно перевертывают плавными движениями вверх и вниз, не допуская резкого взбалтывания содержимого, чтобы избежать образования стойких эмульсий. Периодически выравнивают давление, приоткрывая кран в тот момент, когда воронка находится в перевернутом состоянии – краном вверх. По окончании экстракции воронку на некоторое время ставят в высокий стакан или укрепляют в штативе до полного расслоения жидкостей и установлении четкой границы между ними. Затем через кран сливают нижний слой жидкости в один сосуд, верхний слой через горло переливают в другой. Иногда экстрагирование проводят несколько раз. Затем растворитель отгоняют в колбе для перегонки, где и остается вещество. Экстракцию эффективнее проводить несколько раз малыми порциями растворителя. Возможно проведение экстракции в пробирках с притертыми пробками или в пенициллиновых флаконах, закрытых полиэтиленовыми (полистирольными) пробками. Очистка вещества кристаллизацией из насыщенных растворов основана на неодинаковой растворимости веществ при различных температурах. Перекристаллизация используется для удаления примесей только из кристаллических веществ. Готовят насыщенный раствор вещества в небольшом количестве воды (или другого растворителя), нагретой до 90–95 °С. Горячий раствор фильтруют через 49 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ воронку для горячего фильтрования с целью отделения нерастворимых частиц. Фильтрат собирают в сосуд, охлаждаемый холодной водой или льдом. Очищаемое вещество выкристаллизовывается, а примеси остаются в растворе. Кристаллы отделяются от маточного раствора фильтрованием и сушат между листами фильтровальной бумаги. Для более тщательной очисти перекристаллизацию повторяют. При высушивании на воздухе вещество распределяют тонким слоем и периодически перемешивают, для предохранения от загрязнения его накрывают листом чистой фильтровальной бумаги. Высушивание на воздухе – операция продолжительная, его используют в том случае, если вещество не гигроскопично или если оно разлагается при нагревании. Чаще применяют высушивание в сушильных шкафах при нагревании до 65–110 °С. Сильно гигроскопичные, расплывающиеся на воздухе вещества сушат в эксикаторе, помещая их в открытом бюксе или чашке на фарфоровый вкладыш эксикатора над веществом, поглощающим влагу: хлорид кальция, концентрированная серная кислота, оксид фосфора P 2 O 5 и др. При особо точных анализах необходимо принимать во внимание возможность выщелачивания стекла и применять кварцевую посуду или посуду из стекла, не содержащего определяемый элемент. Щелочные растворы нельзя долго хранить в фарфоровой и особенно стеклянной посуде. Если точным раствором приходится часто пользоваться, его готовят большое количество при тщательном перемешивании, оттитровывают и хранят в бутылях, снабженных бюретками. При хранении растворов следят, чтобы в раствор не попадала влага, углекислота, пыль и т.п. Бутыли с такими растворами снабжают хлоркальциевыми трубками с поглотителями (для кислот трубку заполняют хлоридом кальция или ватой, для щелочей – натронной известью). При хранении некоторые растворы недостаточно стойки, они могут выделять осадки, изменяться под действием света, кислорода воздуха, примесей, содержащихся в воздухе и т.п. Поэтому концентрацию веществ в таких растворах периодически проверяют. Для проведения химико-токсикологических исследований используют посуду, изготовленную из стекла различных марок в зависимости от назначения. Используют посуду общего назначения (пробирки, химические стаканы, воронки простые и делительные, плоскодонные и конические колбы, кристаллизаторы, промывалки, холодильники, сифоны для переливания жидкостей и др.), посуду специального назначения (аппарат Киппа, эксикаторы, капельницы, колбы для определения азота по Кьельдалю, колбы Вюрца и другие для перегонки жидкостей, хлоркальциевые трубки и др.) и мерную посуду (мерные цилиндры, пипетки Мора, градуированные пипетки, микропипетки, бюретки объемные, мерные колбы и др.). При 50 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ исследованиях применяют также фарфоровую посуду, высокоогнеупорную посуду, металлическое оборудование (штативы, зажимы, пинцеты, щипцы, тигли и др.), инструментарий (ножницы, ножи и др.). Технику лабораторных работ, правила обращения с посудой и приборами студенты осваивают на лабораторных занятиях по аналитической химии. От чистоты химической посуды зависит точность результатов анализа. При мытье посуды необходимо соблюдать осторожность при работе с концентрированными растворами щелочей, кислот, окислителей. В зависимости от степени загрязнения лабораторную посуду моют водой, паром, органическими растворителями (эфир, спирты, ацетон, бензин, тетрахлорметан и др.), хромовой смесью и другими моющими средствами. Стеклянная посуда считается чистой, если при споласкивании водой на стеклах не образуется капель и вода стекает тонкой равномерной пленкой. Для удаления остатков твердых загрязнений используют щетки, ерши, стеклянные палочки с кусочком резиновой трубки. После мытья водопроводной водой посуду обязательно 2–3 раза ополаскивают дистиллированной водой. Эффективным способом является мытье паром. Паром посуду обрабатывают также после предварительного мытья другими способами. В большую колбу (емкостью 3–5 л) на дно помещают стеклянные капилляры, до половины наливают ее водой, плотно закрывают пробкой, в которую вставлены высокая трубка для вывода пара и воронка для стекания конденсата. На трубку надевают предназначенный к мытью сосуд. Наиболее часто для мытья посуды применяют хромовую смесь, содержащую дихромат калия и серную кислоту. Для ее приготовления в концентрированную серную кислоту вносят измельченный порошок бихромата калия и осторожно нагревают в фарфоровой чашке до растворения бихромата калия. На 100 мл концентрированной серной кислоты берут 9,2 г кристаллического K 2 Cr 2 O 7 . При мытье хромовой смесью посуду ополаскивают водой, прибавляют хромовую смесь до 1/3–1/4 объема сосуда и смачивают внутренние стенки сосуда. Затем хромовую смесь выливают в склянку, в которой она хранится, посуду смывают 5–7 раз водопроводной водой и ополаскивают 3 раза дистиллированной водой. Сильно загрязненную посуду моют хромовой смесью 2–3 раза или оставляют стоять с хромовой смесью несколько часов. Используют хромовую смесь в лаборатории длительное время, до изменения ее окраски из темно-оранжевого в темно-зеленый. С хромовой смесью необходимо обращаться очень осторожно, при мытье пипеток и трубок пользоваться резиновой грушей. Посуду после крови, молока, жира, перед тем как обрабатывать хромовой смесью, моют в растворе щелочи (до 40%). 51 Глава 2. Методология химико-токсикологического анализа ____________________________________________________________________________ При загрязнении посуды воском, парафином, минеральными маслами, посуду моют паром или органическими растворителями. Хорошее моющее средство (например, для бюреток) – смесь концентрированной серной кислоты и пергидроля (30%-ный раствор Н 2 О 2 ) в объемном соотношении 5:1. Такая смесь используется многократно. После мытья посуду высушивают на воздухе. 52 |