1 Жебентяев Александр Ильич
 Скачать 5.46 Mb.
|
|
6.4 .Отбор и подготовка биологического материала для минерализации Анализ биологических объектов на содержание металлических токсикантов состоит из двух фаз: А) предварительная фаза, состоящая из отбора пробы, перемещения в лабораторию, хранения, гомогенизации пробы, взятия аликвоты; Б) аналитическая фаза, включающая обработку образца, измерение, статистическую оценку. Распределение соединений металлов по ткани никогда не бывает равномерным, величина образца должна быть максимально большой, и в лучшем случае образцом должен служить весь орган целиком. Было найдено, например, что содержание Cd в человеческой почке варьирует в широком интервале: больше всего Cd в коре, меньше – в сердцевине почки, однако различия и в самой коре тоже наблюдались. 120 Глава 6. Вещества, изолируемые методом минерализации _______________________________________________________ К образцам тканей не добавляют предохраняющие их от разложения вещества. Образцы помещают в соответствующие очищенные контейнеры и охлаждают возможно скорее, для того чтобы предотвратить разложение и потерю воды. Жидкие образцы, такие, как кровь и моча, требуют мер предохранения; их хранят при +4 °С, причем они должны быть проанализированы в течении трех недель. Если необходимо хранить образцы дольше, указанные образцы следует охладить до -20 °С. Потери соединений металлов могут происходить вследствие образования нерастворимых продуктов, сильно сорбируемых на стенках контейнера; из-за соосаждения главных составляющих (неорганических и органических) матрицы; в результате образования летучих соединений, способных проникать в пластик контейнера; из-за образования соединений для проведения аналитической процедуры. Большинство из этих мешающих эффектов может быть уменьшено или устранено путем добавления достаточного количества предохраняющего вещества. Определение ртути даже в присутствии предохраняющих веществ, является наиболее трудным. Ртуть может восстанавливаться до элементного состояния самой биологической матрицей, и в этом состоянии она способна проникать в пластик, что обуславливает большие потери. С другой стороны, её сульфиды нерастворимы, и если они образуются в процессе разложения биологического материала при хранении, то из-за их адсорбции на стенках контейнера следует ожидать больших потерь. Образцы, предназначенные для определения металлорганических соединений и Hg, нельзя держать в пластиковых тубах, поскольку указанные вещества способны внедряться в пластик, а это приводит к значительным потерям; в таких случаях предпочтительнее стеклянные или кремнийорганические контейнеры. Состав мочи как конечного продукта метаболизма варьирует в широких пределах не только в отношении главных компонентов, но также и по содержанию следовых элементов. На состав мочи влияют физиологические факторы, а также питание, состояние здоровья, психические и физические стрессы. Чтобы предотвратить осаждение и тем самым не дать моче гетерогенизоваться, её обычно подкисляют; подкисление важно для предохранения от разложения бактериями. Часто прибавление минеральных кислот (HNO 3 , HCl, HClO 4 , все – самой высокой степени чистоты) рекомендуется до значений рН не более 2; но рН должен быть выбран в соответствии с требованиями последующей аналитической обработки. Целью пробоподготовки является переведение пробы в физическую и химическую форму, пригодную для выбранного метода 121 Глава 6. Вещества, изолируемые методом минерализации _______________________________________________________ определения, удалить мешающие вещества. Типичными процедурами пробоподготовки являются разбавление, солюбилизация, кислотная экстракция, экстракция растворителями после комплексообразования, обычная экстракция, фильтрация, центрифугирование мешающих элементов, ионообмен, окисление, отгонка, минерализация. При подготовке объекта к минерализации объект исследования (желудок, печень, почки, либо пищевой продукт) раздельно измельчают и подвергают исследованию. Если объект консервирован этанолом, его подщелачивают карбонатом натрия (для разложения летучих хлоридов As, Hg и пр.), помещают в фарфоровую чашку и спирт отгоняют на водяной бане. Количество объекта, которое берут для разрушения, зависит от общей массы объекта исследования, обстоятельств дела и других факторов (обычно 100 г). При значительных количествах объектов, подлежащих разрушению (400–500 г внутренних органов трупа, 50–100 г муки или хлеба), навеску необходимо делить на 2–3 порции, провести минерализацию, а затем минерализаты объединить. Если на исследование поступают жидкости (моча и др.), то пробу упаривают до небольшого объема, т.е. удаляют основную массу воды. При упаривании могут улетучиваться летучие соединения мышьяка и ртути. Для разложения летучих соединений к объектам, содержащим большие количества жидкостей, прибавляют раствор карбоната натрия и упаривают. При поступлении малых количеств биологического материала для исследования на наличие «металлических» ядов может быть использован биологический материал, из которого методом перегонки с водяным паром были отогнаны летучие яды. В этом случае из объекта исследования удаляют основную массу воды упариванием на водяной бане, так как при большом количестве воды в исследуемом объекте трудно создать необходимую концентрацию кислот-окислителей для проведения минерализации. Меры предосторожности при минерализации. При работе с концентрированными кислотами возможно выбрасывание горячих кислот из колб. Поэтому необходимо пользоваться защитными очками и разрушение биологического материала необходимо проводить в вытяжном шкафу с хорошей тягой. Кислоты и другие реактивы не должны содержать примесей определяемых элементов. Если степень чистоты кислот и реактивов неизвестна, то проводят контрольный опыт. 122 Глава 6. Вещества, изолируемые методом минерализации _______________________________________________________ 6.5. Классификация и характеристика методов минерализации Наиболее часто применяемой процедурой для пробоподготовки биоматериала при определении металлов и других неорганических токсикантов является минерализация. Во многих случаях минерализация помогает перевести пробы из тканей в гомогенные растворы, необходимые для взятия аликвот, равно как и для удаления органической составляющей, мешающей определению соединения металлов. Вольтамперометрические методы, такие, как полярография, катодная и анодная вольтамперометрия, требуют полного удаления органических компонентов, которые зачастую способны подвергаться реакциям на электроде, мешая определению металлов. Минерализация – это процесс разрушения органических веществ под действием физических и химических факторов с целью выделения металлов в форме, удобной для анализа. Иногда не происходит полного разрушения органических веществ до образования СО 2 , воды и других простых веществ, но в результате минерализации сложные соединения металлов с белком разрушаются. При этом образуются более простые и менее прочные комплексы, которые разлагаются при дальнейшем химическом исследовании, что позволяет обнаружить искомые элементы с помощью качественных реакций и провести их количественное определение. При оптимальной схеме минерализации необходимо следовать трем главным принципам: 1) органические компоненты матрицы должны быть полностью удалены; 2) содержание соединений металлов не должно изменяться ни за счет потерь, ни за счет загрязнений; 3) ионы элементов должны быть полностью солюбилизированы и находиться в химической форме, пригодной для определения. Первое требование довольно легко выполнимо, другие требования трудно или вообще невозможно выполнить. Потери будут возникать и от летучести элементов или их соединений; возможно образование нерастворимых соединений с реагентами, материалом сосуда или ионами биологического материала; не исключена адсорбция на поверхности сосуда или умеренное осаждение главного элемента. Загрязнения происходят от материала сосуда и аппаратуры, из окружающей среды лаборатории, но особенно от реагентов (реактивов). Потери летучих соединений, а также потери в результате разбрызгивания можно предотвратить, используя замкнутые системы при пробоподготовке. Методы минерализации должны удовлетворять следующим требованиям: 123 Глава 6. Вещества, изолируемые методом минерализации _______________________________________________________ • биоматериал должен быть разрушен полностью; • остатки после озоления необходимо растворять в минимальном количестве растворителя; • для минерализации необходимо применять минимальное количество реактивов; • необходимо снизить до минимума попадание посторонних веществ в пробу в процессе минерализации; • необходима минимальная продолжительность контакта озоленного образца и стенок сосуда, в котором проводится минерализация; • по возможности необходимо, чтобы температура и продолжительность минерализации были минимальными; • должен быть полный переход элементов из пробы в растворенное состояние. В настоящее время известно много методов разрушения биоматериала. Широко применяемые методы минерализации (мокрая минерализация и сухое озоление) не полностью удовлетворяют некоторым требованиям: возможны потери элементов вследствие улетучивания, минерализация проб осуществляется в течение длительного времени, возможно загрязнение проб в ходе минерализации, не все объекты окисляются полностью. Главным недостатком метода сухого озоления является неконтролируемая высокая температура, при которой возможны потери элементов из-за улетучивания. Недостатком такого метода является и невозможность минерализовать большие количества пробы, т.к. пробу необходимо распределять тонким слоем для обеспечения реакции с кислородом. Наиболее полно удовлетворяет сформированным требованиям метод озоления проб в герметичных сосудах (аналитические автоклавы). Применение аналитических автоклавов ускоряет разложение биологических объектов и уменьшает расход реагентов. При температуре 150–200 ºС в сосуде повышается давление до 10–15 атм. В таких условиях в присутствии сильных окислителей озоление большинства типов биологических проб происходит за 45–60 мин. Во время минерализации уже не требуется постоянный контроль за процессом озоления, сокращается расход реагентов и ускоряется разложение. По технике выполнения методы минерализации делят на методы «мокрой» минерализации и методы сухого озоления. Методы «мокрой» минерализации выполняют с применением кислот – окислителей и других реагентов. При сухом озолении пробы сжигают или сплавляют с карбонатами, нитратами. В некоторых случаях мокрая 124 Глава 6. Вещества, изолируемые методом минерализации _______________________________________________________ минерализация имеет преимущество перед сухой, так как уменьшаются потери летучих форм определяемых элементов (ртуть, цинк, кадмий и др.). Различают также общие и частные методы минерализации (классификация по назначению). Общие методы минерализации применяют при общем анализе биоматериала на большую группу «металлических» ядов. В качестве реагентов применяют различные окислители (азотная, серная, хлорная кислоты, пероксид водорода, хлорат калия). Частные методы минерализации применяют при направленном анализе. Это – методы сплавления, сжигания биоматериала, деструктивный метод изолирования ртути. В литературе имеется также деление методов минерализации на химические («мокрая» минерализация) и физические (сжигание). Однако минерализация путем простого сжигания происходит в присутствии кислорода, хотя специальные реагенты не добавляются. 6.6. Методы мокрой минерализации Из методов «мокрой» минерализации практическое значение имеет минерализация с помощью различных окислителей в присутствии H 2 SO 4 и особенно разрушение биоматериала смесью H 2 SO 4 и HNO 3 В развитие метода минерализации определенный вклад внес А.П. Нелюбин (1785–1858 гг.). Он предложил для разрушения биоматериала нагревание его с азотной кислотой до получения бесцветной жидкости и разработал метод определения мышьяка в виде AsH 3. М.Ж. Орфила в 1821 г. предложил смесь концентрированных серной и азотной кислот для разрушения органических веществ. В 1902 г. для количественного определения фосфора в объектах растительного и животного происхождения Мейллер предложил при разрушении серной и азотной кислотами применять гидросульфат калия в качестве катализатора. Метод применялся при изолировании As, Hg, Pb и Ba. В 1908 г. П.К. Равданикис детально изучил метод Мейллера и показал нецелесообразность введения гидросульфата калия, установил соотношение кислот H 2 SO 4 : HNO 3 (1:4) на 100 г биоматериала и применил метод к химико-токсикологическому анализу. Недостатком метода являлось длительное удаление оксидов азота из минерализата. Концентрированная серная кислота как окислитель практически не применяется (длительный процесс, улетучивается ртуть, образуются не разлагающиеся обугленные остатки). 125 Глава 6. Вещества, изолируемые методом минерализации _______________________________________________________ Применение смеси конц. H 2 SO 4 и нитрата аммония было предложено А.В. Степановым. Кааном в 1934 г. была предложена смесь HClO 4 , H 2 SO 4 и HNO 3 , но конц. HClO 4 взрывоопасна, сильным окислителем является нагретая конц. HClO 4 При применении смеси H 2 O 2 , H 2 SO 4 и HNO 3 вначале к биоматериалу приливают серную, затем азотную кислоты, а потом пероксид водорода. При взаимодействии H 2 O 2 с некоторыми органическими веществами может произойти взрыв. Поэтому вначале частично окисляют органические вещества смесью концентрированных серной и азотной кислот, а затем прибавляют пергидроль. Для удаления избытка пергидроля в минерализат прибавляют сульфит натрия или сульфат гидразина. Применяют пероксид водорода в щелочной среде (скорость окисления органических веществ выше, чем в кислых растворах), хлорную кислоту в присутствии катализатора (молибдат аммония). В химико-токсикологическом анализе применялся метод разрушения хлором в момент выделения (реагенты – хлорат калия и хлороводородная кислота). Метод длительный и в ряде случаев минерализация биоматериала не доходит до конца. При мокрой минерализации используются три группы реактивов: 1) окислители : HNO 3 , H 2 O 2 , HClO 4 и т.д.; 2) солюбилизаторы и нейтрализаторы : H 2 SO 4 , HCl, NH 3 ; 3) катализаторы : H 2 SO 4 , Fe 2+ , Ag + Расходы на реагенты уменьшаются в следующем ряду: окислитель >солюбилизатор > катализатор. При выборе реагента руководствуются следующими факторами: 1) чистота реагента и его расход; это определяет возможные загрязнения. Цены на реактивы составляют немаловажный критерий применимости аналитического метода; 2) возможное образование мешающих веществ, реагирующих с биологическим материалом. Так, например, материал с высоким содержанием Са не следует минерализовать в присутствии H 2 SO 4 , поскольку образующийся плохорастворимый сульфат кальция вызовет потерю определяемых элементов в результате абсорбции или соосаждения; 3) пригодность для данного метода определения и легкость, с которой его избыток может быть удален. Например, H 2 SO 4 не следует использовать, если в дальнейшем измерение проводят методом электротермической ААС, поскольку H 2 SO 4 образует аэрозоль, мешающий определению; 126 Глава 6. Вещества, изолируемые методом минерализации _______________________________________________________ 4)возможность опасных реакций. При определенных условиях использование конц. HClO 4 и H 2 O 2 может привести к сильному взрыву. При обработке биологического материала концентрированными кислотами, например HNO 3 , поверхность материала становится гидрофобной и число реакционноспособных мест падает, а это сказывается на увеличении расхода реагента и на продолжительности минерализации. Поэтому по мере возможности мокрую минерализацию биоматериала следует начинать с прибавления разбавленной кислоты. Окисление биологической матрицы можно описать уравнением: ( Орган.материал)(МХ)(МY) → (CO 2 )(NO x )(SO 2 )(H 2 O)(MX)(MY) (6.4) где M – катионы, X – анионы из реагента, Y – анионы, происходящие из матрицы. Равновесие сдвигается вправо, поскольку происходит удаление летучих продуктов из реакционной смеси. Кинетика реакции зависит от температуры реакции. Выполнение «мокрой» минерализации возможно следующими способами: 1) открытая система; 2) открытая система с дефлегматором; 3) закрытая система. В первом способе используют чашку или другую круглодонную посуду, покрытую часовым стеклом; максимальная температура ограничена точкой кипения самого низкокипящего компонента, который и определяет продолжительность разложения. Расход окислителя типа HNO 3 или H 2 O 2 регулируется главным образом их потерями при дистилляции. Этим способом можно разлагать и большие пробы, при этом органический материал разлагается полностью. Однако в этом способе имеется большой риск загрязнения не только от вносимых реактивов, но и от окружающей лабораторной среды. Летучие металлы типа ртути частично теряются. Описанная процедура очень недорогая, но редко используется при следовых количествах элементов. В открытых системах с дефлегматором к круглодонным колбам присоединяют воздушный обратный холодильник. Расход реагентов снижается более чем на порядок по сравнению с открытой системой без дефлегматора, а это сильно снижает опасность загрязнения. Закрытая система для мокрой минерализации состоит из реактора повышенного давления, имеющего отдельный нержавеющий корпус, к стенкам которого изнутри приварен сосуд из подходящего незагрязняющего материала (тефлон или оксид кремния). После того как проба и необходимый окислитель (обычно конц. HNO 3 ) помещены 127 Глава 6. Вещества, изолируемые методом минерализации _______________________________________________________ во внутренний сосуд, реактор для проведения минерализации плотно закрывается и нагревается. Такая система снабжена приспособлением безопасности для предотвращения взрыва. Расход реагентов сравним с расходом в открытой системе с дефлегматором, полностью исключаются потери и загрязнения из лабораторного воздуха. Основные источники погрешностей при минерализации: разбрызгивание, потери летучих соединений, адсорбция микрокомпонентов на стенках посуды, десорбция ионов при повторном использовании посуды. Использование замкнутых систем уменьшает потери определяемых элементов. |