Мікроба екз. 1. Медична мікробіологія та предмет її вивчення
![]()
|
Реакції імунної сироватки при вірусних захворюваннях (нейтралізації, зв'язування комплементу).В основі цієї реакції лежить здатність специфічної ан-тітоксіческой сироватки нейтралізувати екзотоксин. Антитіла імунної сироватки здатні нейтралізувати шкідливу дію мікробів або їх токсинів на чувст¬вітельние клітини і тканини, що пов'язано з блокадою мікробних антигенів антитілами, т. Е. Їх нейтралізацією. Реакцію нейтралізації (РН) проводять шляхом введення суміші антиген-антитіло тваринам або в чутливі тест-об'єкти (культуру клітин, ембріони). За відсутності у тварин і тест-об'єктів шкідливого дії мікро¬організмов або їх антигенів, токсинів говорять про нейтралізу¬ющем дії імунної сироватки і, отже, про спе¬ціфічності взаємодії комплексу антиген-антитіло. Для прове¬денія реакції досліджуваний матеріал, в якому передбачається наявність екзотоксину, змішують з антитоксической сироваткою, витримують в термостаті і вводять тваринам (морським свін¬кам, мишам). Контрольним тваринам вводять фільтрат досліджуються-емого матеріалу, що не оброблений сироваткою. У тому випадку, якщо відбудеться нейтралізація екзотоксину антитоксической сиво¬роткой, тварини дослідної групи залишаться живими.
Імунофлюоресцентний метод (РІФ, реакція імунофлюоресценції, реакція Кунса) - метод виявлення специфічних Аг за допомогою Ат, кон'югованих з флюорохромом. Володіє високою чутливістю і специфічністю. Застосовується для експрес-діагностики інфекційних захворювань (ідентифікація збудника в досліджуваному матеріалі), а також для визначення Ат і поверхневих рецепторів і маркерів лейкоцитів (иммунофенотипирование) та ін. Клітин. Виявлення бактеріальних і вірусних антигенів в інфек¬ціонних матеріалах, тканинах тварин і культурах клітин за допомогою флуоресцентних антитіл (сироваток) отримало широке застосування в діагностичній практиці. Приготування флюоресцирующих сироваток засноване на спо¬собності деяких флюорохромів (наприклад, ізотіоціанати флюоресцеіна) вступати в хімічний зв'язок з сироватковими білками, не порушуючи їх імунологічної специфічності. Розрізняють три різновиди методу: прямий, непрямий, з комплементом. Прямий метод РІФ заснований на тому, що антигени тканин чи мікроби, оброблені імунними сироватками з антитілами, міченими флюорохромами, здатні світитися в УФ-променях люмінесцентного мікроскопа. Бактерії в мазку, оброблені такий люминесцирующей сироваткою, світяться по периферії клітини у вигляді облямівки зеленого кольору. Непрямий метод РІФ полягає у виявленні комплексу антиген - антитіло за допомогою антіглобуліновой (проти антитіла) сироватки, міченої флюорохромом. Для цього мазки з суспензії мікробів обробляють антитілами антимікробної кролячій діагностичної сироватки. Потім антитіла, не пов'язаних антигенами мікробів, відмивають, а що залишилися на мікроби антитіла виявляють, обробляючи мазок антіглобуліновой (антикроличьих) сироваткою, міченої флюорохромами. В результаті утворюється комплекс мікроб + антимікробні кролячі антитіла + антикроличьих антитіла, мічені флюорохромом. Цей комплекс спостерігають в люмінесцентному мікроскопі, як і при прямому методі. ![]() Твердофазних ІФА - варіант тесту, коли один з компо¬нентов імунної реакції (антиген або антитіло) сорбирован на твердому носії, напр., В лунках планшеток з полістиролу. Компоненти виявляють додаванням мічених антитіл або анті¬генов. При позитивному результаті змінюється колір хромоге¬на. Щоразу після додавання чергового компонента з лунок видаляють Незв'язана реагенти шляхом промивання, При визначенні антитіл (лівий малюнок) в лунки планшеток з сорбованих антигеном послідовно додають си¬воротку крові хворого, антіглобуліновой сироватку, ме¬ченную ферментом, і субстрат / хромоген для ферменту. При визначенні антигену (правий малюнок) в лунки з сорби-рова антитілами вносять антиген (напр., Сироватку кро¬ві з шуканим антигеном), додають діагностичну сиво¬ротку проти нього і вторинні антитіла (проти діагностіче¬ской сироватки), мічені ферментом, а потім субстрат / хро¬моген для ферменту. Конкурентний ІФА для визначення антигенів: шуканий антиген і мічений ферментом антиген конкурують один з одним за зв'язування обмеженої кількості антитіл імунної сироватки. Інший тест - Конкурентний ІФА для визначення антитіл: шукані анті¬тела і мічені ферментом антитіла конкурують один з дру¬гом за антигени, сорбованих на твердій фазі. Імуноблотинг - високочувстві¬тельний метод виявлення білків, заснований на поєднанні електрофорезу та ІФА або РІА. Імуноблотинг іс¬пользуют як діагностичний метод при ВІЛ-інфекції та ін. Антигени збудника розділяють з допомогою електрофоре¬за в поліакриламідному гелі, потім переносять їх з гелю на активовану папір або нітроцелюлозну мембрану і виявляють за допомогою ІФА. Фірми випускають такі смужки з «блот» антіге¬нов. На ці смужки наносять сироватку хворого. Потім, після інкубації, відмивають від несвязавшихся антитіл боль¬ного і наносять сироватку проти імуноглобулінів челове¬ка, мічену ферментом. Утворився на смужці комплекс [антиген + антитіло хворого + антитіло проти Ig людини] виявляють додаванням хромогенного субстрату, що змінює забарвлення під дією ферменту.
До алергічних реак¬ціям відносять два типи реагування на чужорідну речовину: гіперчутливість негайного типу (ГНТ) і гіперчутливість сповільненого типу (ГСТ). До ГНТ відносяться алергічні реакції, які проявляються вже че¬рез 20-30 хв після повторної зустрічі з антигеном, а до ГЗТ - реакції, що виникають не раніше ніж через 24-48 ч. Механізм і клі¬ніческіе прояви ГНТ і ГЗТ різні. ГНТ пов'язана з ви¬работкой антитіл, а ГЗТ - з клітинними реакціями. ГЗТ вперше описана Р. Кохом (1890). Ця форма прояву не пов'язана з антитілами, опосередкована клітинними механізма¬мі за участю Т-лімфоцитів. До ГЗТ відносяться наступні фор¬ми прояви: туберкулінова реакція, уповільнена алергія до білків, контактна алергія. На відміну від реакцій I, II і III типів реакції IV типу не свя¬зани з антитілами, а обумовлені клітинними реакціями, насамперед Т-лімфоцитами. Реакції сповільненого типу можуть виникати при сенсибілізації організму: 1. Мікроорганізмами і мікробними антигенами (бактеріальни¬мі, грибковими, протозойними, вірусними); 2. гельмінтів; 3. Природними і штучно синтезованими гаптенами (лікарські препарати, барвники); 4. Деякими білками. Отже, реакція уповільненого типу може визивать¬ся практично всіма антигенами. Але найбільш яскраво вона про¬является на введення полісахаридів, низькомолекулярних пеп¬тідов, т. Е. Малоіммуногенних антигенів. При цьому реакцію викликають малі дози антигенів і найкраще при внутрішньошкірне введення. Механізм алергічної реакції цього типу полягає в сен-сібілізаціі Т-лімфоцитів-хелперів антигеном. Сенсибілізація лімфоцитів викликає виділення медіаторів, зокрема інтерлейкіну-2, які активують макрофаги і тим самим вов¬лекают в процес руйнації антигену, що викликав сенсибілізацію лімфоцитів. Цитотоксичність виявляють також і самі Т-лімфоцити. Про роль лімфоцитів у виникненні аллер¬гій клітинного типу свідчать можливість передачі ал¬лергіі від сенсибілізованої тварини несенсибілізованих за допомогою введення лімфоцитів, а також придушення реакції за допомогою антилімфоцитарну сироватки. Морфологічна картина при алергіях клітинного типу но¬сіт запальний характер, обумовлений реакцією лімфо¬цітов і макрофагів на утворений комплекс антигену з сен-сібілізірованнимі лімфоцитами. Алергічні реакції клітинного типу проявляються у вигляді туберкулінової реакції, сповільненої алергії до білків, кон¬тактной алергії. Туберкулінова реакція виникає через 5-6 год після внутрішньошкірного введення сенсибілізованим туберкульозної палоч¬кой тваринам або людині туберкуліну, тобто. Е. Антигенів тубер¬кулезной палички. Виражається реакція у вигляді почервоніння, прі¬пухлості, ущільнення на місці введення туберкуліну. Сопровож¬дается іноді підвищенням температури тіла, лимфопенией. Раз¬вітіе реакції досягає максимуму через 24-48 ч. Туберкулі¬новая реакція використовується з діагностичною метою для ви¬явленія захворювань на туберкульоз або контактів організму з туберкульозною паличкою. Уповільнена алергія виникає при сенсибілізації мали¬мі дозами білкових антигенів з ад'ювантом, а також кон'- гатамі білків з гаптенами. У цих випадках алергічна реак¬ція виникає не раніше ніж через 5 днів і триває 2-3 тижнів. Мабуть, тут грають роль уповільнене дію кон'югованих білків на лімфоїдну тканину і сенсибілізація Т-лімфо-цитов. Контактна алергія виникає, якщо антигенами є низькомолекулярні органічні та неорганічні речовини, які в організмі з'єднуються з білками, утворюючи кон'юга-ти. Кон'юговані з'єднання, виконуючи роль гаптенов, ви¬зивают сенсибілізацію. Контактна алергія може виникати при тривалому контакті з хімічними речовинами, в тому числі фармацевтичними препаратами, фарбами, косметічес¬кімі препаратами (губна помада, фарба для вій). Прояв¬ляется контактна алергія у вигляді всіляких дерматитів, т. Е. Поразок поверхневих шарів шкіри. Значення. Всі реакції гіперчутливості, у тому числі і ГЗТ мають велике значення. Їх механізми лежать в основі запалення, яке сприяє локалізації інфекційного агента чи іншого антигену в межах певних тканин і формуванню повноцінної імунної реакції захисного характеру. Гіперчутливість негайного типу (ГНТ) - ги-перчувствітельность, обумовлена антитілами (IgE, IgG, IgM) проти алергенів. Розвивається через ¬ сколько хвилин або годин після дії алергену: рас¬шіряются судини, підвищується їх проникність, развівают¬ся свербіж, бронхоспазм, висип, набряки. Пізня фаза ГНТ дополня¬ется дією продуктів еозинофілів і нейтрофілів. До ГНТ відносяться I, II і III типи алергічних реакцій (по Джеллу і Кумбсу): I тип - анафілактичний, обусловлен¬ний головним чином дією IgE; II тип - цитотоксичний, обумовлений дією IgG, IgM; III тип - імунокомплексний, що розвивається при утворенні імунного комплексу IgG, IgM з антигенами. В окремий тип виділяють антірецепторние реакції. Основні типи реакцій гіперчутливості I тип - анафілактичний. При первинному контакті з ан¬тігеном утворюються IgE, які прикріплюються Fc- фрагментом до огрядним клітинам і базофілам. Повторно вве¬денний антиген перехресно зв'язується з IgE на клітинах, викликаючи їх дегрануляцію, викид гістаміну та інших медіа¬торов алергії. Первинне надходження алергену викликає продук¬цію плазмацітамі IgE, IgG4. Синтезовані IgE прикріплюються Fc- фрагментом до Fc-pe цепторов (FceRl) базофілів в крові і огрядних клітин в слизових оболонках, сполучної тканини. При повторному поступ¬леніі алергену на тучних клітинах і базофілів образуюто комплекси IgE з алергеном (перехресна зшивання FceRl анті¬геном), що викликають дегрануляцію клітин. Клінічні прояви гіперчутливості I типу. Клінічні прояви гіперчутливості I типу можуть протікати на тлі атопії. Атопія - спадкова схильність до розвитку ГНТ, обумовлена пови¬шенной виробленням IgE-антитіл до алергену, підвищеною кількістю Fc-рецепторів для цих антитіл на огрядних клет¬ках, особливостями розподілу огрядних клітин і пови¬шенной проникністю тканинних бар'єрів. Анафілактичний шок - протікає гостро з розвитком колапсу, набряків, спазму гладкої мускулатури; часто заканчі¬вается смертю. Кропив'янка - збільшується проніцае¬мость судин, шкіра червоніє, з'являються пухирі, свербіж. Бронхіальна астма - розвиваються запалення, бронхо-спазм, посилюється секреція слизу в бронхах. тип - цитотоксичний. Антиген, розташований на клітці «впізнається» антитілами класів IgG, IgM. При взаімо¬действіі типу «клітина-антиген-антитіло» відбувається актіва¬ція комплементу і руйнування клітини за трьома напрямками: комплементзавісімий цитолиз; фагоцитоз; антитілозалежна клітинна цитотоксичність. Час реакції - хвилини або години. До II типу гіперчутливості близькі антірецепторние реакції (так званий IV тип гіперчутливості), основою яких є антірецепторние антитіла, ¬ приклад антитіла проти рецепторів до гормонів. Клінічні прояви II типу. За II типу гіперчувствітельнос¬ті розвиваються деякі аутоімунні хвороби, обуслов¬ленние появою аутоантитіл до антигенів власних тканин: злоякісна міастенія, аутоіммун¬ная гемолітична анемія, вульгарна пухирчатка, синдром Гудпасчера, аутоімунний гіпертиреоїдизм, інсулінозаві-сімий діабет II типу. Аутоіммунну гемолітичну анемію викликають анті¬тела проти Rh-антигену еритроцитів; еритроцити разруша¬ются в результаті активації комплементу і фагоцитозу. Ле¬карственно-індуковані гемолітична анемія, гранулоцитопенія і тромбоцитопенія супроводжуються появле¬ніем антитіл проти ліки - гаптена і цитолизом кле¬ток, що містять цей антиген. тип - імунокомплексний. Антитіла класів IgG, IgM утворюють з розчинними антигенами імунні комплекси, які активують комплемент. При надлишку антигенів або недоліку комплементу імунні комплекси откладивают¬ся на стінці судин, базальних мембранах, т. Е. Структурах, що мають Fc-рецептори. Первинними компонентами III типу гіперчутливості є розчинні імунні комплекси антиген-анті¬тело і комплемент (анафілатоксин С4а, СЗа, С5а). При із¬битке антигенів або недоліку комплементу імунні комплекси відкладаються на стінках судин, базальних мем¬бранах, тобто структурах, що мають Fc-рецептори. Поврежде¬нія обумовлені тромбоцитами, нейтрофілами, імунними комплексами, комплементом. Залучаються прозапальні цитокіни, включаючи TNF-a та хемокіни. На пізніх стаді¬ях в процес залучаються макрофаги. Реакція може бути загальною (наприклад, сироваткова бо¬лезнь) або залучати окремі органи, тканини, включаючи ко¬жу (наприклад, системний еритематозний вовчак, реакція Артюса), нирки (наприклад, вовчаковий нефрит), легкі (наприклад, аспергільоз) або інші органи. Ця реакція може бути обумовлена багатьма мікроорганізмами. Вона розвивається через 3-10 годин після експозиції антигену, як у реакції Артюса. Антиген може бути екзогенні (хро¬ніческіе бактеріальні, вірусні, грибкові або прото-зойние інфекції) або ендогенний, як при системній Ері- тематозной вовчак. Клінічні прояви III типу. Сироваткова хвороба відбувається при введенні високих доз антигену, наприклад кінської протиправцевої си¬вороткі. Через 6-7 днів у крові з'являються антитіла про¬тів кінського білка, які, взаємодіючи з даним антигеном, утворюють імунні комплекси, откладивающіе¬ся в стінках кровоносних судин і тканинах. Розвиваються сі¬стемние васкуліти, артрити (відкладення комплексів в суста¬вах), нефрит (відкладення комплексів в нирках). Реакція Артюса розвивається при повторному внутрішньошкірне введення антигену, який локально утворює іммун¬ние комплекси з раніше накопиченими антитілами. Проявляется набряком, геморагічним запаленням і некрозом. Алергічні проби - біологічні реакції для діагностики ряду захворювань, засновані на підвищеній чутливості організму, викликаної алергеном. При багатьох інфекційних захворюваннях за рахунок активації кле-точного імунітету розвивається підвищена чутливість організму до збудників і продуктів їх життєдіяльності. На цьому засновані алергічні проби, використовувані для діагно¬стікі бактеріальних, вірусних, протозойних інфекцій, міко¬зов і гельмінтозів. Алергічні проби володіють спеціфічно¬стью, але нерідко вони бувають позитивними у перехворілих і щеплених. Всі алергічні проби поділяють на дві групи - про¬би in vivo і in vitro. До першої групи {in vivo) відносяться шкірні проби, осуществ¬ляемие безпосередньо на пацієнті і виявляють алергію негайного (через 20 хв) та уповільненого (через 24 - 48 год) типів. Алергічні проби in vitro засновані на виявленні сенсібі¬лізаціі поза організмом хворого. Їх застосовують тоді, коли з тих чи інших причин не можна провести шкірні проби, або в тих випадках, коли шкірні реакції дають неясні результати. Для проведення алергічних проб використовують алергени - діагностичні препарати, призначені для виявлення специфічної сенсибілізації організму. Інфекційні ал¬лергени, використовувані в діагностиці інфекційних заболева¬ній, являють собою очищені фільтрати бульйонних куль¬тур, рідше суспензії убитих мікроорганізмів або АГ, виділені з них. Шкірні проби. Інфекційні алергени вводять, як правило, внутрішньошкірно або нашкірному, шляхом втирання в скаріфіціровать ділянки шкіри. При внутрикожном способі в середню третину передньої поверхно¬сті передпліччя спеціальною тонкою голкою вводять 0,1 мл аллерге¬на. Через 28 - 48 год оцінюють результати реакції ГЗТ, визначаючи на місці введення розміри папули. Неінфекційні алергени (пилок рослин, побутовий пил, харчові продукти, лікарські та хімічні препарати) вводять в шкіру уколом (прик-тест), накожно шляхом скарификации і втирання або внутрішньошкірної ін'єкцією розведеного розчину алергену. В якості негативного контролю використовують їхн, в якості позитивного - розчин гістаміну. Результати учі¬тивают протягом 20 хв (ГНТ) за величиною папули (іноді до 20 мм в діаметрі), наявності набряку та свербежу. Внутрішньошкірні проби ставлять у випадку негативного чи сумнівного результату прик-тесту. У порівнянні з останнім, дозу алергену зменшують в 100-5000 разів. Шкірні проби на наявність ГЗТ широко застосовують для вияв¬ленія інфікованості людей мікобактеріями туберкульозу (проба Манту), збудниками бруцельозу (проба Бюрне), лепри (реакція Мітсуди), туляремії, сапа, актиномикоза, дерматомікозів, токсоплазмозу, деяких гельмінтозів та ін. Проби in vitro. Ці методи дослідження безпечні для хворого, достаточ¬но чутливі, дозволяють кількісно оцінити рівень алергізації організму. В даний час розроблені тести для визначення сенсі¬білізаціі, засновані на реакціях Т- і B-лімфоцитів, ткане¬вих базофілів, виявленні загальних специфічних IgE в сиворот¬ке крові та ін. До них відносяться реакції гальмування міграції лейкоцитів і бласттрансформации лімфоцитів, специфічне розеткоутворення, базофільний тест Шеллі, реакція дегрануляції тканинних базофілів, а також аллергосорбентние методи (визначення специфічних IgE в сироватці крові). Реакція гальмування міграції лейкоцитів (РТМЛ). РТМЛ ос¬нована на придушенні міграції моноцитів та інших лейкоцитів під дією медіаторів, що виробляються сенсібілізірован¬нимі лімфоцитами, у присутності специфічного алергену. Реакція бласттрансформації лімфоцитів (РБТ). В основі цієї реакції лежить здатність нормальних лімфоцитів періфері¬ческой крові вступати в мітоз і перетворюватися на бластні форми при культивуванні їх in vitro під дією специфічних фак¬торов - алергенів і неспецифічних стимуляторів мітогенез - митогенов (фитогемагглютинин, конканавалін А, ліпополісахариди та інші речовини) . Реакція специфічного розеткоутворення. Розетки - харак-терни утворення, що виникають in vitro в результаті пріліпа¬нія еритроцитів до поверхні імунокомпетентних клітин. Розеткоутворення може відбуватися спонтанно, оскільки Т-лімфоцити людини містять рецептори до еритроцитів барана. Спон-танное розеткоутворення здорових людей становить 52 - 53% і служить показником функціонального стану Т-лімфоцитів. Цей феномен відтворюється також і в тому випадку, якщо використовують еритроцити, на яких фіксовані соответствую¬щіе алергени. Реакція дегрануляції тканинних базофілів. Методика основа¬на на тому, що під дією алергену відбувається дегрануляція тканинних базофілів щури, попередньо сенсібілізірован¬них цітофільнимі AT з сироватки крові хворого. Базофільний тест Шеллі. Відомо, що базофільні гранулоцити людини або кролика також дегранулюють в прісут¬ствіі сироватки хворого і алергену, до якого чутливий даний пацієнт. Визначення антитіл класу IgE in vitro. Лабораторна діагно¬стіка захворювань, в основі яких лежить ГНТ, заснована на визначенні аллергенспецифических IgEанті-IgE. При іспользо¬ваніі радіоактивної мітки метод носить на¬званіе радіоаллергосорбентний тесту (PACT), але частіше в каче¬стве мітки використовують фермент або флюоресцирующєє речовина (ФАСТ). Час аналізу - 6 - 7 годин. Принцип методу: фіксіро¬ванний на твердій основі відомий алерген інкубують з си¬вороткой крові хворого; знаходяться в сироватці спеціфічес¬кіе IgEанті-IgE зв'язуються з алергеном і, таким чином, залишаються фіксованими на основі і можуть вступати в спеці¬фіческое взаємодію з додаються міченими анти-IgE. 87. Вакцинопрофілактика, типи вакцин. Методи введення. Побічна дія вакцинних препаратів. Вакцина - медичний препарат, призначений для створення імунітету до інфекційних хвороб. Класифікації вакцин: Живі вакцини - препарати, діючим початком в яких є ослаблені тим чи іншим способом, що втратили свою вірулентність, але зберегли специфічну антигенность штами патогенних бактерій. Прикладом таких вакцин є БЦЖ і вакцина проти натуральної віспи людини, в якості якої використовується непатогенних для людини вірус віспи корів. Інактіивовані(убиті) вакцини - препарати, як діючого початку включають вбиті хімічним або фізичним способом культури патогенних вірусів чи бактерій, (клітинні, віріони) або ж витягнуті з патогенних мікробів комплекси антигенів, що містять у своєму складі проективні антигени (субклітинні, субвіріонні вакцини). В препарати іноді додають консерванти і ад'юванти. Молекулярні вакцини - в них антиген знаходиться в молекулярній формі або навіть у вигляді фрагментів його молекул, що визначають специфічність т. Е. У вигляді епітопів, детермінант. Корпускулярні вакцини - містять у своєму складі протективний антиген Анатоксини відносяться до числа найбільш ефективних препаратів. Принцип отримання - токсин відповідної бактерії в молекулярному вигляді перетворюють на нетоксичну, але зберегла свою антигенну специфічність форму шляхом впливу 0.4% формальдегіду при 37t протягом 3-4 тижнів, далі анатоксин концентрують, очищають, додають ад'юванти. Синтетичні вакцини. Молекули епітопів самі по собі не мають високу імуногенність для підвищення їх антигенних властивостей ці молекули зшиваються з полімерним крупномолекулярні нешкідливим речовиною, іноді додають ад'юванти. Асоційованівакцини - препарати, що включають кілька різнорідних антигенів. Вимоги, що пред'являються до сучасних вакцин: імуногенність; Низька реактогенність (алергенність); Не повинні володіти тератогенністю, онкогенні; Штами, з яких приготовлена вакцина, повинні бути генетично стабільні; Тривалий термін зберігання; Технологічність виробництва; Простота і доступність у застосуванні. |