Методы аналитической биохимии. 1. Правила проведения работ в лаборатории при проведении биохимического анализа с использованием лабораторных животных
 Скачать 1.66 Mb.
|
|
1. Правила проведения работ в лаборатории при проведении биохимического анализа с использованием лабораторных животных К работе, с использованием лабораторных животных, допускаются студенты, ознакомленные с правилами и под контролем преподавателя. Перед началом работы нужно проверить наличие необходимых для работы с животными инструментов и оборудования, оценить психологическое состояние животного. Запрещается работать: если не соблюдены санитарно-гигиенические нормы; лицо, ответственное за работу с животным, отсутствует; оставлять животных без присмотра. При работе процедуры, которые могут вызвать у животного боль, проводить при обезболивании; фиксировать дозы и время введения препаратов. Основное положение, которое обязаны соблюдать сотрудники, работающие с животными, не причинять животным ненужные страдания и боль. Вывод животных из эксперимента должен быть гуманным и этически обоснованным. Планирование экспериментов с соблюдением принципов «трех R»: замещение/replacement – использование экспериментальных методов, без участия животных; совершенствование/refinement – внесение изменений в содержание животных или дизайн эксперимента для улучшения состояния животных, или для устранения боли и дистресса; сокращение/reduction – использование минимального количества животных в эксперименте, но достаточного для получения необходимого объема информации [9]. В лабораторной практике применяют различные способы заражения экспериментальных животных: пероральное, подкожное, внутримышечное, внутрикожное, внутривенное, интраперитонеальное, интракардиальное, интраназальное и др. При планировании исследования с заражением животных ПБА следует учитывать следующие моменты: видовая восприимчивость животных к патогенам; способность микроорганизмов вызывать инфекционный процесс аналогичный у человека; выбор способа заражения при котором достигаются необходимые клинические признаки заболевания При выборе того или иного вида животного также следует учитывать возможность его содержания в рамках лаборатории микробиологии. Так, проведение экспериментов на мелких лабораторных животных (мыши, крысы, хомяки, песчанки, морские свинки) в ИВК-системе в лаборатории микробиологии является менее трудозатратным и экономически выгодным в сравнении с аналогичными исследованиями на крупных животных (карликовые свиньи, собаки, кролики). Умершие или эвтаназированные животные подлежат обязательному вскрытию сразу после смерти, во избежание контаминации. Манипуляции с трупами проводятся ветеринарным врачом/патоморфологом в стерильных условиях в ламинарном боксе. По окончании работ трупы животных, а также весь отработанный биологический материал подвергают обеззараживанию одним из доступных способов: автоклавирование или пересыпание хлорной известью. Для оценки показателей в соответствии с целями и задачами исследований проводят забор биологического материала. Образцы биологического материала от зараженных лабораторных животных собирают в одноразовые стерильные контейнеры с плотно закрывающимися крышками (первичные контейнеры). Первичные контейнеры изолируют друг от друга с помощью подставки или штатива, чтобы предотвратить контакт между ними. Вокруг них укладывают абсорбирующий материал. При приеме первичных контейнеров с образцами биоматериала их помещают на поднос или лоток, покрытый многослойной марлевой салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором 2. Классификация химической посуды, используемая для биохимических исследований: характеристики, требования. Выделяют посуду общего (пробирки, колбы), специального назначения (дефлегматоры, специальные холодильники) и мерную (мерные цилиндры, бюретки). Пробирки – цилиндрические сосуды с закругленным дном, применяют для проведения аналитических работ. Бывают также градуированные, центрифужные, пробирки тина эппендорф (хранения реактивов). Воронки служат для переливания жидкостей, фильтрования, разделения. Химические стаканы – тонкостенные цилиндры различной емкости, предназначенные для приготовления реактивов. Бывают стеклянные и пластиковые. Химические колбы – стеклянные сосуды, используемые при проведении титрования, фильтрования под вакуумом (колбы Бунзена), для хранения дистиллированной воды. Холодильники – приборы, применяемые для охлаждения и конденсации паров. Конденсант, образующий при охлаждении паров, либо отводиться в приемник – прямые (холодильник Либиха), либо возвращается в сосуд, в котором проводили нагревание – обратные. Чашки Петри – пластиковые и стеклянные – предназначены для работы с культурами клеток. Ступки с пестиками служат для измельчения биологических тканей и растирания химических реагентов. Сосуд для хроматографии нужен для проведения хроматографического исследования па бумаге или пластинках. Снабжен крышкой для предотвращения испарения. Капельницы предназначены для хранения и дозированного использования красителей и индикаторов. Мерные цилиндры – стеклянные толстостенные сосуды с нанесенными на наружной стенке делениями, указывающими объем в миллилитрах. Пипетки служат для точного отмеривания определенного объема жидкости. Требования. Химическая инертность. Посуда для лабораторий должна быть пригодна к работе с материалами различного химического состава – кислотами, щелочами, растворителями. Долговечность, стойкость к возникновению царапин, помутнений, потертостей. Оператор активно пользуется лабораторной посудой на протяжении всего рабочего дня. Интенсивная работа не должна оставлять следов на поверхности изделия. Качественная посуда сохраняет идеальный внешний вид в течение всего срока эксплуатации. Стойкость к воздействию повышенных температур. Для работы с образцами, нагретыми до критически высоких температур, подходят сосуды, изготовленные из специальных термостойких материалов. Степень термостойкости указывается в технических характеристиках продукции. Прочность, устойчивость к хрупкому разрушению, стойкость к ударным нагрузкам. Работая в условиях лаборатории, оператор не застрахован от непредвиденных ситуаций. Качественные колбы и пробирки не должны разбиваться от непреднамеренного неосторожного обращения. Ударопрочность материала – залог безопасности работ в условиях лабораторий. Небольшой вес. На протяжении всего цикла исследований оператор может брать в руки исследуемый материал неограниченное количество раз, поэтому лабораторная посуда должна иметь минимальный вес. Маркировка объема. Удобство проведения эксперимента повышается, если на стенках сосуда указан его объем. Наличие градуированной шкалы. Наличие контрастной измерительной шкалы – обязательно требование для мерных сосудов. Для остальных типов сосудов данный фактор является дополнительным преимуществом. 3. Мытье лабораторной посуды. Сушка. Хромовая смесь. Новая посуда перед использованием должна быть вымыта горячей водой. Сразу же после освобождения использованной посуды необходимо обезвредить и удалить из нее остатки веществ. При обезвреживании и мытье посуды непременно нужно надевать защитные очки, перчатки, фартук; посуду следует обезвреживать в вытяжном шкафу. Всегда желательно иметь лабораторную мойку под вытяжкой или моечный вытяжной шкаф со столом, обитым свинцовыми листами, с подводкой горячей и холодной воды и большой фаянсовой или стальной эмалированной раковиной. Подобные шкафы производятся для оснащения комплектных лабораторий стационарного типа. В крайнем случае приходится удовлетвориться тумбой с лабораторной раковиной. Для мытья большого количества лабораторной посуды следует выделять изолированные помещения — моечные, — которые должны быть, по возможности, расположены в центре обслуживаемых ими лабораторных помещений. Способы очистки и моющие средства Для выбора способа мытья в каждом отдельном случае необходимо знать свойства загрязняющих посуду веществ, их растворимость в холодной и горячей воде, в растворах щелочей и кислот, способность окисляться с образованием водорастворимых соединений. Мытье горячей водой с помощью ершей эффективно в тех случаях, когда загрязняющие посуду вещества растворимы в воде. При мытье ершом необходимо следить, чтобы неосторожным нажатием не проткнуть стенку или дно сосуда. Вынимая ерш из узких сосудов, не следует спешить, так как быстро выпрямляющаяся щетина может обрызгать и моющего посуду, и человека, стоящего рядом. Вымытую посуду споласкивают два-три раза дистиллированной водой. Стеклянная посуда считается чистой только в том случае, если вода равномерно смачивает всю внутреннюю поверхность по» суды и не оставляет капель на внутренних стенках. Если после ополаскивания в сосуде сохраняются обуглившиеся массы, то следует попытаться удалить их путем встряхивания с кусочками влажной фильтровальной бумаги. Мыть посуду струей водяного пара — процесс трудоемкий, но когда требуется особенно чистая посуда, ее предварительно моют обычным способом и затем пропаривают с помощью специальных приспособлений (рис. 58). Для равномерного и спокойного кипения в колбу с водой (налитой до половины) следует положить «кипятильные камешки». После пропаривания посуду, не перевертывая, высушивают. В исключительных случаях для удаления смолистых, жировых и других органических веществ, нерастворимых в воде, иногда используют органические растворители (эфир, изопропиловый спирт, бензин и др.). При этом следует учитывать огнеопасность органических растворителей и работу с ними проводить вдали от огня, в вытяжном шкафу, а загрязненные растворители собирать каждый в отдельности для последующей регенерации перегонкой. Посуду, промытую органическими растворителями, затем моют водой с мылом (или другими моющими средствами), а потом чистой водой, после чего обрабатывают хромовой смесью или другим окислителем. В последние годы для мытья лабораторной посуды стали применять ультразвук, который оказывает диспергирующее действие на загрязнения; последние легко отстают от стекла и смываются струей воды. В присутствии моющих средств действие ультразвука усиливается. В качестве моющих средств применяют поверхностно-активные вещества, способные адсорбироваться на поверхности раздела фаз и вследствие этого понижать адгезию (прилипание) загрязнения. Синтетические моющие средства бытового назначения находят широкое применение для мытья лабораторной посуды. Моющими свойствами обладают также соли, гидролиз которых сопровождается образованием щелочной среды: фосфат натрия Na3PO4, гексаметафосфат натрия Na6P6O18. Хорошим моющим средством является раствор 75-100 г Na2CO3 в 1 л воды. Для удаления коксовых остатков рекомендуют посуду помещать в раствор, содержащий 53 г Na3PO4 и 28,5 г олеината натрия в 470 мл воды. Для очистки посуды, загрязненной органическими остатками, используют сильные окислители: соли хромовой и марганцовой кислот, перекись водорода, «царскую водку», азотную и серную кислоты и др. Труднорастворимое загрязнение можно перевести в водорастворимое. Так, BaSO4 при обработке конц. H2SO4 переходит в растворимое соединение Ba(HSO4)2; AgCl, малорастворимый в воде, при обработке водным раствором аммиака образует комплексное соединение [Ag(NH3)2]Cl, хорошо растворимое в воде. Загрязнения основного характера отмывают разбавленными кислотами, а кислотные — водными растворами аммиака, карбонатов щелочных металлов или щелочей. Для мытья посуды чаще всего используют растворы солей хромовых кислот в серной кислоте (хромовую смесь). Существует много рецептов приготовления хромовой смеси. При этом предпочтение отдают натриевым солям хромовой и двухромовой кислот, обладающим большей растворимостью в воде, чем калиевые соли. Ниже приводим некоторые рецепты приготовления хромовой смеси. а. К раствору 92 г измельченного Na2CrO4-2H2O в 458 мл воды при непрерывном перемешивании постепенно добавляют 800 мл конц. H2SO4. Получаемую красно-коричневую жидкость можно использовать многократно, до перехода окраски в зеленый цвет — окраска ионов хрома (III). б. К 100 мл конц. H2SO4 при энергичном перемешивании постепенно добавляют 9,9 г тонкоизмельченного K2Cr2O7. в. К 100 мл конц. H2SO4 при энергичном перемешивании постепенно добавляют 10 г 50% водного раствора Na2Cr2O7. г. Растворяют 15 г тонкоизмельченного K2Cr2O7 в 100 мл горячей воды. Раствор охлаждают и при непрерывном помешивании по каплям прибавляют к 100 мл конц. H2SO4. д. Растворяют 200 г тонкоизмельченного K2Cr2O7 в 1 л конц. HNO3. Азотнокислая хромовая смесь более стойка, чем обычная, а по моющим свойствам превосходит ее. Хромовую смесь следует хранить в широком толстостенном сосуде, который плотно закрывают толстой стеклянной пластинкой, чтобы избежать выделения крайне едкого и летучего CrO3 и поглощения влаги из воздуха. Обработку посуды хромовой смесью следует проводить под тягой, в защитных перчатках и очках, поверх халата надеть резиновый фартук. Сначала механически удаляют грубые загрязнения: моют ершами, встряхивают с 2-5% раствором NaOH и обрезками фильтровальной бумаги. Не очень загрязненную малогабаритную посуду хорошо промывают водой и после возможно более полного удаления воды вносят во взболтанную хромовую смесь. Большей частью достаточно оставить очищаемый сосуд в холодной смеси на 15-30 мин. Возможен и другой вариант обработки. Очищаемый сосуд наполовину наполняют горячим (около 60°С) раствором хромовой смеси и, осторожно вращая, смачивают внутренние стенки сосуда. Через 10-15 мин хромовую смесь сливают обратно в сосуд, где она хранится, а очищаемый сосуд тщательно промывают водопроводной водой, а затем споласкивают несколько раз дистиллированной водой. При работе с хромовой смесью (и другими сильными окислителями) следует избегать попадания в нее легко окисляющихся метилового и этилового спиртов, так как это приводит к потере окислительных свойств смеси. Сушка Вымытая посуда должна быть высушена, если только она не предназначена для работы с водными растворами. Самый распространенный холодный способ — сушка на колышках или на решетках. Вымытую посуду надевают на колышки доски или опрокидывают на решетку, установленную над моечной раковиной и оставляют до тех пор, пока она не высохнет. При наличии в лаборатории проводки сжатого воздуха вымытую посуду можно высушить струей нагретого воздуха, профильтрованного через слой стеклянной ваты. В отдельных случаях посуду высушивают, ополаскивая этиловым спиртом и диэтиловым эфиром, либо ацетоном и эфиром. Для этого обтирают сосуд снаружи полотенцем, ополаскивают вначале этиловым спиртом или ацетоном, а затем диэтиловым эфиром; остатки эфира удаляют продуванием чистым сухим воздухом вдали от источников огня. Остатки спирта и эфира сливают отдельно и сохраняют для последующей регенерации. Мелкие стеклянные сосуды можно высушить в вакуум-эксикаторе, заполненном высушенным силикагелем. Горячая сушка проводится в сушильном шкафу при 100-120 °С. Посуду помещают в шкаф после того, как она некоторое время постояла перевернутой. Чтобы посуда не загрязнилась, на выдвижные полки сушильного шкафа следует положить чистую фильтровальную бумагу. После отключения сушильного шкафа от сети посуду оставляют медленно охлаждаться, не вынимая из шкафа, чтобы она не запотела. При возникновении срочной надобности малогабаритные сосуды можно вынуть из сушильного шкафа и поместить в эксикатор, где процесс остывания завершится быстрее. Для ускорения остывания посуды можно также ее продуть струей сухого воздуха.  4. Выражение концентрации растворов. Массовая доля растворенного вещества (процентная концентрация) (w) – это отношение массы (объема) растворенного вещества (m1) к общей массе (объему) раствора (m): Массовую долю растворенного вещества принято выражать на 100 г раствора. Следовательно, 5 % раствор содержит 5 г вещества в 100 г раствора или 5 г вещества и 95 г растворителя. Массовая доля растворенного вещества определяется в процентах.  Молярная концентрация (М) – это отношение количества растворенного вещества в молях (мю) к определенному объему этого раствора (V): Объем раствора обычно выражается в литрах. Для того чтобы установить, какое количество граммов данного вещества находится в 1 л раствора заданной концентрации, необходимо знать его молярную массу. Молярная концентрация выражается в моль/л. Нормальная концентрация (эквивалентная масса) – это число эквивалентов растворенного вещества в 1 л раствора. Эквивалентная масса кислоты равна ее молярной массе, деленной на основность кислоты. Например, для азотной кислоты эквивалентная масса равна ее молярной массе. Для серной кислоты эквивалентная масса равна 98/2 = 49. Эквивалентная масса основания равна его молярной массе, деленной на степень окисления металла. Например, эквивалентная масса гидроксида натрия (NaОН) равна его молярной массе, а эквивалентная масса гидроксида магния (Мg(ОН)2) равна 58,3/2 = 29,2. 5. Реактивы для биохимических исследований: сведения, выбор реактивов. Биохимические реактивы предназначены для определения изменений химического состава и обмена веществ в организме человека в динамике течения патологического состояния, диагностики и их лечения. С помощью биохимических реактивов определяются в биологических жидкостях (кровь, моча, слюна, желудочный сок, спинномозговая жидкость, желчь, сперма и др.) различные вещества, для показателей которых установлены нормы или границы. Используются различные биохимические реактивы, позволяющие определять: белок, эритроциты, гемоглобин, лейкоциты, глюкозу, кетоновые тела, нитриты, билирубин и др. показатели. В качестве биохимических реактивов используются тест-полоски, которые в отличие от других методов исследования не требуют использования дополнительно специальной аппаратуры. Существуют реактивы, при взаимодействии друг с другом которые способны взрываться или устраивать пожар. Для этого необходимо знать такие реактивы и хранить отдельно. Во всех коробках с реактивами есть инструкция по хранению данных веществ. Также следует уделить внимание и тем регентам, которые относятся к какому-либо классу опасности, дабы избежать отравления или даже летального исхода. Реактивы, которые нельзя хранить в стеклянных тарах (например, плавиковая кислота и щелочи), должны хранится в пластиковых бутылях. Вещества, которые разлагаются или меняют свои свойства под действием света, хранятся в темных или желтых стеклянных тарах. Некоторые реактивы нуждаются в герметичном хранении, добиться этого можно с помощью промазывания пробок парафином. На каждой таре необходимо указывать название, концентрацию и срок годности данного реактива. Сливать отработанные реактивы нужно в специально отведенные для этого склянки для последующей переработки или утилизации. |