|
|
Методы аналитической биохимии. 1. Правила проведения работ в лаборатории при проведении биохимического анализа с использованием лабораторных животных
30. Понятие о ПЦР: принцип, компоненты.
В настоящее время предложены различные модификации ПЦР, показана возможность создания тест-систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечных мутаций, описаны десятки различных применений метода. Таким образом, открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе).
Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы и должны отвечать ряду критериев:
Быть специфичными. Особое внимание уделяют 3'-концам праймеров, так как именно с них Taq-полимераза начинает достраивать комплементарную цепь ДНК. Если их специфичность недостаточна, то высока вероятность, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить процессы неспецифического связывания, и синтеза фрагментов различной длинны, отличных от искомых. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.
Не должны образовывать димеры и петли, то есть не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига (комплементарного присоединения) праймеров самих на себя или друг с другом.
Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной специфичности, взятой в качестве критерия при выборе праймеров. При попадании на такую зону, отжиг праймеров не происходит, и, как следствие, возникает ложноотрицательный результат.
Taq-полимераза – термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание З'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) – дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) – «строительный материал», используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.
Буфер – смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающей оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.
Анализируемый образец – подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, например, ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.
1.1.2. Дополнительные компоненты
Для удобства детекции или контроля эффективности амплификации в состав реакционной смеси могут быть включены дополнительные компоненты.
Внутренние контроли – гетерологичный специфическому фрагмент ДНК, как правило, большего размера, ограниченный (фланкированный) специфическими праймерами. Фактически, представляет собой альтернативную матрицу ПЦР и позволяет контролировать эффективность амплификации в каждой конкретной пробирке.
ДНК-зонды – искусственно синтезированные олигонуклеотиды небольшого размера (около 30 нуклеотидов), комплементарные специфическим ампликонам (продуктам реакции). Благодаря прикрепленным к ним изотопным или флуоресцентным меткам ДНК-зонды могут использоваться для детекции продуктов реакции.
1.2. Циклический температурный режим
Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, которые обеспечиваются определенными температурными циклами. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов:
1. Денатурация – это переход ДНК из двухнитевой формы в однонитевую при разрыве водородных связей между комплементарными парами оснований под воздействием высоких температур (рис. 2).
2. Отжиг – это присоединение праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры подбирают так, что они ограничивают искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа. Если это условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит.
3. Элонгация (синтез). После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с 3'-конца праймера.
Температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы, которая с максимальной эффективностью начинает синтез второй цепи ДНК от 3'-конца праймера, связанного с матрицей, и движется в направлении от 3' к 5' концу (рис. 3).
Иногда в случае близкого значения температуры отжига праймеров и температуры оптимума работы фермента, становится возможным использовать двухэтапный ПЦР, совместив отжиг и элонгацию. Температурный цикл амплификации многократно повторяется (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается (рис. 4).
Результатом циклического процесса является экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента ДНК, которое можно описать формулой:
А = М*(2n- n-1)
2n , где
А – количество специфических (ограниченных праймерами) продуктов реакции амплификации;
М – начальное количество ДНК-мишеней;
n – число циклов амплификации.
Реальное значение эффективности отдельных циклов амплификации составляет по некоторым данным 78-97%. Если в пробе присутствуют ингибиторы реакции это значение может быть намного меньше, поэтому фактическое количество специфических продуктов амплификации лучше описывает формула:
А = М*(1+Е)n , где
Е – значение эффективности реакции.
Следует заметить, что в процессе амплификации на исходной цепи синтезируются и длинные фрагменты, однако их накопление происходит лишь в арифметической прогрессии по формуле:
К = М*n , где
К – количество длинных продуктов амплификации.
Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.
31. Стадии ПЦР. Термоциклер. (смотреть документ пцр)
ПЦР-анализ состоит из трех стадий
2.1. Подготовка пробы биологического материала
Для подготовки пробы к постановке ПЦР используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки реакции амплификации.
Иногда достаточным бывает кипячение образца в течение 5–10 минут, однако в большинстве случаев требуются более трудоемкие методы.
Следует отметить, что из-за большого количества стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, так как возможна перекрестная контаминация между пробами образующейся аэрозолью ДНК.
Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, предложенная Marmur. Она включает в себя ферментативный протеолиз клеток с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Однако это метод довольно трудоемкий и предполагает работу с такими токсичными веществами, как фенол и хлороформ.
Популярным в настоящее время является метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавт. Он основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента – гуанидина изотиоционата (GuSCN) высокой молярности (5М) с последующей сорбцией ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко» и т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен и технологичен для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок, что имеет большое значение при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР, поэтому при использовании этого метода важны правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологии.
Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а примеси, ингибирующие ПЦР. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца, в результате которого клеточные стенки разрушаются, а нуклеиновые кислоты выходят в раствор; и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом.
Тем не менее, встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, клеточные стенки некоторых микроорганизмов не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.
При массовом скрининге, когда важно получить статистические данные, допускается использование простых методов с применением детергентов или обработки биологического материала щелочами с последующей их нейтрализацией. В то же время, использование подобных методов пробоподготовки для клинической диагностики может приводить к ложноотрицательным результатам, вследствие использования в реакционной смеси некачественного препарата ДНК. Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.
2.2. Способ постановки ПЦР(к примеру)
На данный момент разработаны варианты постановки ПЦР, направленные на решение следующих задач: увеличение эффективности реакции и снижение риска образования неспецифических продуктов; реализацию возможности проведения как качественного, так и количественного анализа искомых участков молекулы ДНК/РНК.
ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR) – модификация, суть которой состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров.
Для этого полимеразная активность фермента в момент постановки ПЦР блокируется антителами или имитирующими антитела небольшими молекулами типа Affibody до наступления первой денатурации (проводится при 95 °C в течение 10 минут).
Кроме того, для предотвращения преждевременного взаимодействия фермента с компонентами реакционной смеси и, как следствие, образования неспецифических продуктов реакции до момента полного прогрева, используется легкоплавкий парафин или специальные масла, отделяющие полимеразу от реакционной смеси.
В зависимости от ГЦ-состава и размера, праймеры имеют определенную температуру плавления Тm, при которой образование водородных связей нестабильно. Если температура системы превышает Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, то есть температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двуцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и таким образом обеспечивает специфичность реакции.
Даже если неспецифический отжиг произошел до начала температурного циклирования, в отсутствии фермента элонгации не происходит, а при нагревании комплексы праймер-ДНК денатурируют, поэтому неспецифические продукты не образуются. В дальнейшем температура в пробирке не опускается ниже температуры плавления, что обеспечивает образование специфического продукта амплификации.
Таким образом, ПЦР с «горячим» стартом позволяет минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и возможность получения ложноположительных результатов анализа.
ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR) – используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности РНК. На первом этапе с помощью ревертазы (обратной транскриптазы), используя в качестве матрицы мРНК, проводят синтез одноцепочечной молекулы ДНК (кДНК), которая используется для последующей ПЦР. Для этого применяют обратную транскриптазу, выделенную из двух вирусов: Avian myeloblastosis virus и Moloney murine leukemia virus.
Использование ревертазы связано с некоторыми трудностями. Прежде всего, данный фермент термолабилен и поэтому может быть использован при температуре не выше 42°С. Так как при такой температуре молекулы РНК легко образуют вторичные структуры, то эффективность реакции заметно снижается и по разным оценкам приблизительно равна 5%. Этот недостаток может быть устранен при использовании в качестве обратной транскриптазы термостабильной полимеразы, проявляющей активность в присутствии ионов Мn2+. Это единственный известный фермент, способный проявлять как полимеразную, так и транскриптазную активность.
Для проведения реакции обратной транскрипции в реакционной смеси так же, как и в ПЦР, в качестве затравки должны присутствовать праймеры и смесь 4-х дНТФ.
Возможность использования РНК в качестве мишени для ПЦР существенно расширяет спектр применения этого метода, например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирусы гриппа, ВИЧ и т.д.) представлены именно РНК.
2.3. Детекция результатов ПЦР
На сегодняшний день существует несколько основных способов детекции результатов ПЦР:
Электрофоретический (в агарозном или полиакриламидном геле)
Гибридизационно – ферментный
Гибридизационо – флуоресцентный:
– регистрация продукта после окончания реакции амплификации
– «анализ по конечной точке»;
– детекция продукта в режиме «реального времени».
Метод вертикального электрофореза (к примеру)
Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламид и специальную камеру для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК с точностью до одного нуклеотида. Однако приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного, кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в рутинной работе этот метод не используют.
Оба варианта электрофоретической детекции позволяют осуществлять только качественный анализ и сопряжены с рядом проблем:
Большие затраты времени на стадию детекции
Невозможность автоматизации
Сложность и субъективность трактовки результатов
Высокий риск контаминации и большие затраты на ее устранение:
– повышенные требования к организации лаборатории;
– максимальное удаление зоны детекции от других зон проведения ПЦР;
– выделение отдельного сотрудника на стадию детекции;
– постоянный контроль смывов;
– большое количество К- для контроля контаминации ампликонами и, как следствие, увеличение объема расходных материалов и времени для подготовки к проведению детекции.
Метод гибридизации после амплификации
Другой способ детекции продуктов амплификации основан на гибридизации олигонуклеотидных зондов с продуктами амплификации. Зонды представляют собой искусственно синтезированные участки ДНК, содержащие ту или иную метку, детектируемую специальными приборами.
Для детекции продуктов ПЦР после окончания реакции амплификации необходимо специальное оборудование – детектор флуоресценции (например, приборы «Джин» или «Джин-4» производства НПФ «ДНК-Технология»).
В процессе своей работы прибор регистрирует флуоресцентное излучение, возникающее в реакционной смеси при освещении образца источником возбуждающего света. Регистрация производится последовательно для каждой из пробирок при её позиционировании относительно оптического блока с помощью шагового двигателя.
Флуорофоры для каждой из мишеней (например, для специфического искомого участка ДНК и внутреннего контроля) имеют свою длину волны, это позволяет регистрировать одновременно несколько сигналов по соответствующим каналам, что повышает производительность метода.
Такой подход позволяет свести к минимуму риск контаминации продуктами амплификации. Детекция результатов проводится в закрытых пробирках, что позволяет осуществлять ПЦР-исследования в одной комнате и обходиться меньшим количеством персонала. Кроме того, регистрация, интерпретация и хранение полученных результатов проводятся автоматически.
В результате указанный способ детекции существенно сокращает время проведения анализа и исключает возможность субъективной оценки полученных результатов, что повышает качество работы лаборатории. Тем не менее необходимо помнить, что реализация данного подхода позволяет проводить только качественный анализ.
Различные варианты детекции по конечной точке позволяют оценить количество исходной ДНК методом серийных разведений, определяя количество работающих разведений и сравнивая их с контрольными образцами с известной концентрацией ДНК. Однако данный подход является слишком трудоемким и практически не применяется в условиях диагностических лабораторий.
Термоциклер
Амплификатор — прибор, обеспечивающий периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C и необходимый для проведения полимеразной цепной реакции. Современные амплификаторы позволяют задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждой процедуры цикла. Амплификатор используется в молекулярной биологии для амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции.
Основной принцип
Прибор производит определенное количество попеременных нагревов и охлаждений (термоциклов) в зависимости от используемого метода и повторяет их множество раз, добавляя в конце праймер ДНК. Копирование участков ДНК происходит тысячи раз. Для получения лучшего результата изменения температурных уровней должны совершаться в течение минимального промежутка времени. С помощью амплификатора температура цикла может быть достигнута за считанные секунды, даже начиная с удаленных значений последней установленной точки. Данные изменения происходят с поддержанием идеальной однородности между различными точками блока. Систему также можно запрограммировать так, чтобы создать условия линейно и градиентно изменяющейся температуры по ширине блока. Таким образом, достигается определение и оптимизация точек с наивысшим уровнем производительности.
Строение прибора
Амплификатор ДНК состоит из внутренней системы крышки с нагревательным элементом и регулировкой высоты для того, чтобы адаптировать прибор к размерам образцов. Таким образом, предотвращается конденсация в верхней части образцов. Прибор работает на основе системы нагревания, получающей непрерывное питание от источника электрического тока и состоящей из нескольких термоэлектрических модулей с эффектом Пельтье, радиатором с низкими теплопотерями и системой вентиляторного конвектора. Все элементы амплификатора составляют один блок. Благодаря этому система позволяет увеличивать производительность процесса, а также быстро определять и изменять температуру блока, переходя от высшего предела температуры к низшему в течение минимального времени. Каждый блок включает в себя коннектор, который определяет блок и позволяет амплификатору ДНК также определить его. Контрольный микропроцессор позволяет выполнять мониторинг текущего состояния процесса и отображать информацию на дисплее с помощью графиков в реальном времени. Детально проработанное полезное программное обеспечение для организации процесса, управляемое с помощью клавиатуры и ЖК-дисплея с высоким разрешением. Блок также имеет ручку, облегчающую его извлечение.
Усовершенствования и дополнительные возможности
Возможность проведения ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Амплификатор оснащается детектором флуоресценции, регистрирующим флуоресцентный сигнал от реакционной смеси для построения графика накопления продукта ПЦР. Детектор флуоресценции может быть как дополнительной оснасткой, так и базовым оснащением. В приборах с твердотельным термоблоком детекция производится сверху через крышку пробирки, на качество могут влиять особенности реакционных сосудов, в амплификаторах с роторным термоблоком через нижнюю часть пробирки, что является предпочтительным ввиду минимальной толщины и повышенной прозрачности стенки пробирки. Амплификаторы с роторным термоблоком, как правило, выпускаются только в исполнении для ПЦР в реальном времени;
Сменный термоблок. Единый модуль термоблока, включающий собственно термоблок, элементы Пельтье и радиатор, оснащается быстросъёмными фиксаторами и электрическим разъёмом для смены пользователем. Возможность смены термоблока пользователем позволяет использовать на одном базовом шасси термоблоки под различные типы реакционных ёмкостей, в том числе для ПЦР в реальном времени. Существуют сменные модули, состоящие из нескольких (2-3) уменьшенных термоблоков и термоциклеры с возможностью установки нескольких модулей термоблоков, позволяющие одновременно запускать несколько независимых ПЦР на одном амплификаторе;
Температурный градиент. Возможность задания температурного градиента облегчает поиск оптимального температурного режима для наиболее эффективного прохождения ПЦР;
Калькулятор температурных режимов на основе нуклеотидной последовательности праймеров. Помогает при подборе оптимального температурного режима;
Возможность эмуляции поведения приборов предыдущих поколений, прежде всего скорости изменения температуры. Позволяет избежать дополнительной адаптации и повысить воспроизводимость при использовании тест-систем, оптимизированных на «медленных» амплификаторах предыдущих моделей;
Электрифицированное открывание крышки термоблока позволяет использовать автоматизированные системы пробоподготовки с механизированной установкой и извлечением реакционных планшетов.
Голосовое управление позволяет меньше касаться прибора перчатками, что снижает риск контаминации
|
|
|
Скачать 1.66 Mb.