Методы аналитической биохимии. 1. Правила проведения работ в лаборатории при проведении биохимического анализа с использованием лабораторных животных
 Скачать 1.66 Mb.
|
|
6. Весы: виды, правила взвешивания. Весы являются основным прибором в химическом анализе. Приступая к определению качественного или количественного состава образца, сначала берут его навеску. К взвешиванию прибегают при приготовлении растворов, при нахождении массы осадка и т.д. Технические весы. Особенностью является наличие арретира, поддерживающего чашки весов в нерабочем состоянии. Чтобы на весах можно было взвешивать, нужно опустить арретир при помощи имеющейся спереди рукоятки. При взвешивании: 1. Сначала следует проверить равновесие весов, при этом стрелка должна совершать колебания около нулевой отметки шкалы. 2. Взвешиваемый предмет следует класть на левую чашку, а разновесы – на правую. 3. Класть тело и разновесы на чашки весов можно только при арретированых весах. Затем весы освобождают от арретира и проверяют состояние равновесия. Перед перекладыванием разновесов весы следует вновь арретировать. 4. Разновесы следует брать пинцетом. 5. Погрешность весов определяется их классом. Приближенно она равна минимальной величине перегрузке, вызывающей видимое нарушение равновесия. Торсионные весы. Предназначены для быстрого и точного взвешивания малых грузов до 500 мг. Чувствительным элементом таких весов служит спиральная пружина или упругая нить. Взвешивание: 1. При закрытой дверце установите горизонтальное положение торсионных весов, вращая регулировочные винты. 2. При закрытой дверце отблокируйте весы. Отблокирование заключается в повороте головки на 180 градусов. 3. Вращайте левой головкой шкалу до тех пор, пока подвижная стрелка не займёт положение на красной черте, определяющей равновесие рычага. Правой головкой наведите неподвижную стрелку на нулевое деление шкалы. 4. Положите на чашку весов фильтр и закройте дверцу, Вращайте левую головку до тех пор, пока подвижная стрелка не достигнет красной черты равновесия. 5. После отсчёта результата шкалу установите в исходное положение с помощью головки. Снимите фильтр, закройте дверцу и заблокируйте весы. Аналитические весы. Приступая к взвешиванию, необходимо помнить, что аналитические весы один из самых точных и важных измерительных приборов в лаборатории количественного анализа. Правила работы: 1. Перед каждым взвешиванием проверяют состояние весов. Аккуратно очищают пыль, проверяют нулевую точку. 2. При обнаружении неисправности весов ни в коем случае не следует исправлять весы самому. 3. Нельзя допускать никаких прикосновений к неарретированным весам. Опускают и поднимают арретир осторожным и плавным поворотом рукоятки. 4. Нельзя сдвигать весы с занимаемого места. 5. Не перегружать весы сверх предельной нагрузки (в большинстве случаев 200 г). 6. Категорически запрещается взвешивать вещество непосредственно на чашке весов – взвешиваемое вещество помещают в бюкс, тигель, на часовое стекло или в пробирку. 7. Прибавляют или убавляют взвешиваемое вещество только вне футляра весов. 8. Нельзя взвешивать горячие или слишком холодные предметы. Взвешиваемые предметы должны иметь температуру весовой комнаты. 9. Все взвешивания данного анализа проводят на одних и тех же весах, пользуясь одним и тем же разновесом. 10. По окончании взвешивания необходимо убедиться, что весы арретированы, нагрузка снята, дверцы футляра полностью закрыты. Электронные весы. Предназначены для взвешивания сухих реактивов с точностью до 0,01 г. Максимальная масса навески – 200 г. Порядок работы: 1. включить весы ы сеть, нажать клавишу on/off. Дождаться появления на экране устойчивого значения 0,00. 2. поставить на чашку весов тару для взвешивания реагента, снять с экрана показания массы тары. Обнулить весы. 3. не снимая тару с чашки весов, постепенно насыпать в нее взвешиваемый реагент, наблюдая за значениями массы на экране. 4. выключают весы нажатием off. 5. после работы весы нужно очистить от возможных загрязнений. 7. Классификация растворов. Техника приготовления растворов, их фильтрование и хранение. Растворы – это гомогенные (однофазные) системы переменного состава, состоящие из двух или более веществ (компонентов). По характеру агрегатного состояния растворы могут быть газообразными, жидкими и твердыми. В зависимости от размеров частиц растворы делятся на истинные и коллоидные. В истинных растворах (часто называемых просто растворами) растворенное вещество диспергировано до атомного или молекулярного уровня, частицы растворенного вещества не видимы ни визуально, ни под микроскопом, свободно передвигаются в среде растворителя. Техника приготовления растворов По точности выражения концентрации растворы делят на приблизительные, точные и эмпирические. Если растворителем служит вода, то нужно применять только дистиллированную или диминерализованнную воду. Предварительно приготавливают соответствующий емкости посуды, в которой будут готовить и хранить получаемый раствор. Посуда должна быть чистой. Если есть опасения, что водный раствор может взаимодействовать с материалом посуды, то посуду внутри следует покрыть парафином или другими химически стойкими веществами. Перед приготовлением растворов нужно подготовить по возможности 2 одинаковых сосуда: один – для растворения, а другой – для хранения раствора. Вымытый сосуд предварительно проградуировать. Для растворения следует применять чистые вещества. Готовые растворы обязательно проверяют на содержание нужного вещества и, если это будет необходимо, поправляют раствор. Нужно применять меры для защиты приготовленных растворов от попадания в них пыли или газов, с которыми могут реагировать некоторые растворы. Во время приготовления и во время хранения растворов, бутыли или другая посуда обязательно должны быть закрыты пробками. При особо точных анализах следует принимать во внимание возможность выщелачивания стекла и применять, если это допустимо, кварцевую посуду. При этом растворы лучше оставлять в фарфоровой посуде, а не в стеклянной. Сосуды для хранения растворов оснований должны быть снабжены хлоркальциевыми трубками, заполненными аскаритом или натронной известью, чтобы защитить раствор от СO2. В некоторых случаях растворы следует хранить в атмосфере инертного газа (N2, СO2). Растворы веществ, разлагающихся под действием света, например AgNO3, следует хранить в сосудах из коричневого стекла или покрытых черным лаком (в крайнем случае обернутых в черную бумагу). Фильтрование – процесс разделения неоднородных (дисперсных) систем (например, суспензия, аэрозоль) при помощи пористых перегородок, пропускающих дисперсионную среду и задерживающих дисперсную твёрдую фазу. Известно несколько способов фильтрования: 1) при обыкновенном давлении; 2) под вакуумом; 3) при нагревании; 4) при охлаждении; 5) при повышенном давлении. 8. Дозирование жидкостей, использование пипеточных дозаторов переменного объёма, возможные источники погрешностей. Дозатор пипеточный предназначен для забора и дозирования точных объемов жидкостей. Дозаторы пипеточные работают на принципе воздушного смещения/вытеснения с использованием съемных разовых наконечников. Автоматические пипеточные дозаторы разделяются на два вида: 1) с постоянным (фиксированным) и с переменным объемами дозирования. Если ограничители хода поршня жестко зафиксированы, то такой дозатор позволяет дозировать только один фиксированный объем. 2) Дозаторы с переменным объемом дозирования имеют шкалу объемов, на которой устанавливается требуемое значение. В современных моделях задаваемый объем отображается в цифровом окне, а возможность регулировать объем дозы достигается тем, что один из упоров делается подвижным и может перемещаться специальным устройством, увеличивая или уменьшая длину хода поршня. Вообще поршень имеет две ступени фиксации: первый для дозирования требуемого объема, второй – для забора/сброса неконтролируемого объема жидкости. Возможная причина погрешности - Неровное увлажнение пластиковых стенок - Наконечник с плохими абсорбционными свойствами - Наконечник сидит неплотно. - Используемый наконечник не подходит к дозатору. - Работа с жидкостью с высоким давлением паров. Для дозаторов 500-5000 мкл - Пипетирование проводится слишком быстро. - Слишком быстро убираете носик из жидкости - Дозатор протекает, потому что загрязнен поршень. - Поврежден поршень. - Повреждена прокладка. - Нижняя часть дозатора сидит свободно. - Загрязнен поршень. - Загрязнена прокладка. - В дозатор попали пары растворителя. - Жидкость попала в носовой конус и засохла. 9. рН. Измерение рН и использование индикатора. В кислой среде [Н+] > [ОН-], а в щелочной среде, напротив, [ОН-] > [Н+]. Для выражения концентрации водородных ионов была введена величина pH, численно равная отрицательному десятичному логарифму концентрации ионов водорода в единицах нормальности: рН=-lg[H+] Величина pH получила название водородного показателя. Для грубой оценки концентрации водородных ионов широко используются кислотно-основные индикаторы – органические вещества-красители, цвет которых зависит от pH среды. К наиболее известным индикаторам принадлежат лакмус, фенолфталеин, метиловый оранжевый (метилоранж) и другие. Их преимуществом является дешевизна, быстрота и наглядность исследования. Для расширения рабочего интервала измерения pH используют так называемый универсальный индикатор, представляющий собой смесь из нескольких индикаторов. Универсальный индикатор последовательно меняет цвет с красного через жёлтый, зелёный, синий до фиолетового при переходе из кислой области в щелочную. Использование специального прибора – pH-метра – позволяет измерять pH в более широком диапазоне и более точно (до 0,01 единицы pH), чем с помощью индикаторов. Ионометрический метод определения pH основывается на измерении милливольтметром ионометром ЭДС гальванической цепи, включающей специальный стеклянный электрод, потенциал которого зависит от концентрации ионов H+ в окружающем растворе. Аналитический объёмный метод – кислотно-основное титрование – также даёт точные результаты определения кислотности растворов. Раствор известной концентрации (титрант) по каплям добавляется к исследуемому раствору. При их смешивании протекает химическая реакция. Точка эквивалентности – момент, когда титранта точно хватает, чтобы полностью завершить реакцию, - фиксируется с помощью индикатора. Далее, зная концентрацию и объём добавленного раствора титранта, вычисляется кислотность раствора. 10. Буферные растворы. Приготовление буферных растворов. Буферные растворы организма. Буферными называют растворы, рН которых практически не изменяется при добавлении к ним небольших количеств кислот и оснований или при их разбавлении. Буферные растворы могут быть четырех типов: 1. Слабая кислота и ее соль. Например, ацетатный буферный раствор СН3СООН + CH3COONa. 2. Слабое основание и его соль. Например, аммиачный буферный раствор NH4OH + NH4C1. 3. Раствор двух кислых солей. Например, фосфатный буферный раствор NaH2PO4 + Na2HPO4. В этом случае соль NaH2PO4 играет роль слабой кислоты. 4. Аминокислотные и белковые буферные растворы. рН и рОН буферных растворов зависят от величины константы диссоциации кислоты или основания и от соотношения концентраций компонентов. Эта зависимость выражается уравнениями: pH = pKk – lg C (кислота/соль) рОН = рК0 - lg С(основание/соль) где рКк и рК0 - показатели константы диссоциации соответствующей кислоты и основания; С(кислота) - концентрация кислоты; С(основание) - концентрация основания. При приготовлении буферного раствора с одинаковой концентрацией кислоты (основания) и соли рН или рОН такого раствора численно равняется рКк или рК0, так как С(кислота)/С(соль) = 1 или С(основание) / С(соль) = 1. Изменяя соотношение между концентрациями кислоты (основания) и соли, можно получить серию растворов с различной концентрацией ионов водорода, т.е. с различными значениями рН. Буферные растворы или буферные системы обеспечивают постоянство рН биологических жидкостей и тканей. Главными буферными системами в организме являются гидрокарбонатная, гемоглобиновая, фосфатная и белковая. Действие всех буферных систем в организме взаимосвязано. Поступившие извне или образовавшиеся в процессе обмена веществ ионы водорода связываются в слабо диссоциируемые соединения одним из компонентов буферных систем. Однако при некоторых заболеваниях может происходить изменение значения рН крови. Смещение значения рН крови в кислую область от нормальной величины рН 7,4 называется ацидозом, в щелочную область – алкалозом. Ацидоз возникает при тяжелых формах сахарного диабета, длительной физической работе и при воспалительных процессах. При тяжелой почечной или печеночной недостаточности, или при нарушении дыхания может возникнуть алкалоз. 11. Буферная емкость. Использование буферных растворов в биохимическом анализе. Количественной мерой буферного действия является буферная емкость. Она определяется числом молей эквивалента сильной кислоты или щелочи, которое необходимо добавить к 1 л буферного раствора, чтобы сместить его рН на единицу. Буферная емкость зависит от соотношения конц-ий компонентов и их абсолютных концентраций, а также от разбавления. Максимальная буферная емкость при добавлении сильных кислот и оснований достигается при соотношении компонентов буферного р-ра, равным единице, когда рН=рК. Наиболее важным буфером организма явл гидрокарбонатная буферная система, обеспечивающая около 55% буферной емкости крови. Поддержание постоянства конц-ии гидрокарбонатов в циркулирующей крови обеспечивается почками. Приведем некоторые случаи использования их в целях анализа: Ацетатный буферный раствор (СНзСООН + СН3СООNa; рН = 5) применяют при осаждении осадков, неосаждаемых в кислых или щелочных растворах. Вредное влияние кислот подавляет ацетат натрия, который вступает в реакцию с сильной кислотой. Например: НС1 + СН3СООNа > СН3СООН + NaС1 или в ионной форме Н++ СН3СОО > СН3СООН. Аммиачно - аммонийный буферный раствор (NН4ОН + NН4С1; рН = 9) применяют при осаждении карбонатов бария, стронция, кальция и отделения их от ионов магния; при осаждении сульфидов никеля, кобальта, цинка, марганца, железа; а также при выделении гидроокисей алюминия, хрома, бериллия, титана, циркония, железа и т.п. Формиатный буферный раствор (НСООН + НСООNа; рН = 2) применяют при отделении ионов цинка, осаждаемых в виде ZnS в присутствии ионов кобальта, никеля, марганца, железа, алюминия и хрома. Фосфатный буферный раствор (Nа2НРО4 + NаН2РО; рН = 8) использует при проведении многих реакции окисления-восстановления. 12. Гомогенизация тканей и клеток. Выбор среды суспензирования. 1. Растирание клеток с твердыми материалами. Метод состоит в растирании клеток с песком или абразивным порошком в ступке при помощи пестика. Желательно, чтобы абразивные частицы были как можно более острыми и имели такой же размер, что и разрушаемые клетки. Недостаток метода заключается в том, что при разрушении клеток может нарушаться структура наиболее крупных органелл, таких, например, как хлоропласты. 2. Разрушение клеток в жидких средах. Разрушение клеток, находящихся в суспензии, происходит либо при вращении лопастей или поршня (блендеры), либо при поступательном движении вверх и вниз поршня или шаров (гомогенизаторы). Большинство гомогенизаторов представляют собой прибор, состоящий из пестика с ручным (гомогенизаторы Даунса и Тёнбрэка) или механическим (гомогенизатор Поттера--Эльвегёйма) приводом. 3. Прочие методы. К ним относятся: разрушение клеток методом осмотического шока, переваривание клеточных стенок ферментами, например, лизоцимом. Объективных критериев для выбора той или иной среды суспендирования при гомогенизации не существует. Обычно для создания в среде необходимого осмотического давления, предохраняющего частицы от набухания и разрыва, применяют сахарозу. Если сахароза затрудняет исследование свойств ферментов, ее заменяют маннитом. Существует целый ряд индивидуальных прописей по сохранению целостности частиц и защите ферментов от инактивации. Рекомендуемые растворы различаются по концентрации сахарозы или присутствию таких веществ, как ЭДТА, глутатион, р-меркаптоэтанол и т. д. Иногда вместо солевых растворов используют неионные среды, так как, например, в гомогенатах печени солевые растворы вызывают агглютинацию полиморфно-ядерных лейкоцитов и органелл. Для выделения ядер и хромосом пользуются лимонной кислотой, которая обладает способностью подавлять активность «нейтральных» дезоксирибонуклеаз. Для выделения ядер применяют растворы глицерина и этиленгликоля. Хлоропласты обычно выделяют в средах, содержащих не сахарозу, а маннит и сорбит. Анализ ферментов в растительных экстрактах иногда значительно усложняется в силу того, что в процессе гомогенизации выделяется большое количество фенолов, которые образуют водородные связи с карбонильными группами, участвующими в образовании пептидных связей белков, а это, по-видимому, вызывает инактивацию многих ферментов. Во избежание этого к экстрактам добавляют поливинилпирролидон, образующий с фенолами нерастворимый комплекс, который затем удаляют из экстракта фильтрованием. 13. Способы разрушения тканей и клеток. Способы разрушения клеток можно разделить на следующие группы: 1. Мягкое воздействие, которое включает лизис клеток с помощью осмотического шока, разрушение под действием ферментов (лизоцима и др.), химическую солюбилизацию (например, экстракция толуолом дрожжей, при которой частично растворяется клеточная стенка), гомогенизацию вручную (клетки продавливают через зазор). 2. Воздействие средней силы, при котором используют лопастной гомогенизатор или растирание с абразивом (песком, стеклянными шариками). 3. Сильное воздействие с помощью пресса, ультразвука или шаровой мельницы. Выбор раствора для экстракции зависит от особенностей белка. Для растворимого белка используют буферные растворы. Обычно объем раствора в 2-3 раза превышает объем ткани. После экстракции белка массу центрифугируют при 10000-20000 об/мин на центрифуге с охлаждением. Смесь до центрифугирования называют «гомогенатом».
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||