Методы аналитической биохимии. 1. Правила проведения работ в лаборатории при проведении биохимического анализа с использованием лабораторных животных
 Скачать 1.66 Mb.
|
|
Конкурентный ИФА На твердой фазе иммобилизованы специфические моноклональные антитела; В лунки панелей вносят в известной концентрации антиген, меченный ферментом, и исследуемый образец. Параллельно в соседних лунках ставят положительный и отрицательный контроли. Для построения калибровки используют стандартный немеченый антиген в различных разведениях. Проводят инкубацию и отмывку; Добавляют субстрат, инкубируют, останавливают реакцию при развитии оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем; Проводят учет результатов на ИФА-ридере. Концентрация определяемого вещества обратно пропорциональна оптической плотности. Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченые ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе. Неконкурентный «сэндвич» – вариант ИФА Основным достоинством метода является высокая чувствительность, превосходящая возможности других схем ИФА. На твердой фазе иммобилизованы моноклональные антитела или аффинно-очищенные поликлональные антитела; В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положительный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различных разведениях. Инкубируют и отмывают; В лунки вносят меченные ферментом моноклональные или поликлональные антитела —конъюгат. После инкубации проводят отмывку для удаления несвязавшихся антител; Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем; Проводят учет результатов на ИФА-ридере. Концентрация определяемого вещества прямо пропорциональна оптической плотности. Качественный анализ часто используют при скрининговых исследованиях и диагностике инфекционных заболеваний. Результат исследования определяется при сравнении его оптической плотности с расчетной величиной критической оптической плотности (ОПкрит., «Cut-off»). Формулу для расчета «Cut-off» указывают в инструкции к тест-системе. В расчете «Cut-off» могут участвовать как усредненные значения оптических плотностей положительных и отрицательных контролей, так и оптическая плотность специального контрольного образца — контроля уровня среза. Если оптическая плотность образца выше, чем Cut-off, образец считается положительным на специфические антитела. Для полуколичественного варианта проведения методики рассчитывают отношение между средней оптической плотностью образца и оптической плотностью Cut-off. Образцы рассматриваются как: положительные, если отношение более 1,1; сомнительные, если отношение 0,9–1,1; отрицательные, если отношение менее 0,9. Сомнительные результаты анализа нельзя однозначно интерпретировать и для уточнения результата необходимо повторить обследование через 1–2 недели. Методом ИФА определяют: Гормоны; Онкомаркеры; Антитела (IgG, IgM) к возбудителям заболеваний — ToRCH-инфекций, туберкулеза, сифилиса, к вирусу гепатита С (ат ВГС), микоплазме, хламидиям, лямблиям, Helicobacter pylori и др.; Антигены вирусов —гепатит D, Е, А (ВГD, ВГЕ, ВГА), гепатит С (ВГСсore), гепатит В (НВs, НВе НВсore); Аутоиммунные заболевания. Преимущества, которыми располагает ИФА по сравнению с другими методами детекции антигенов и антител: высокая чувствительность, которая, составляющая 90%; стабильность при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (год и более); быстрота и удобство проведения диагностической реакции; возможность использовать минимальные объемы исследуемого материала; возможность автоматизации всех этапов проведения реакции; небольшая стоимость диагностических наборов; возможность ранней диагностики инфекции; унифицированность и пригодность для массовых обследований; легкость в отслеживании динамики развития процесса инфекционного заболевания. Вместе с тем у метода есть и определенные недостатки. Одним из них является относительно низкая чувствительность и специфичность. То есть ИФА может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Кроме того, иммуноферментный анализ будет неинформативным, если его проводить в первые несколько дней после заражения, так как уровень иммуноглобулинов повышается в течение 3–5 дней. Наконец, ИФА позволяет определить реакцию иммунной системы на присутствие в организме конкретного возбудителя, однако сам патоген выявить данным методом не получится. Именно поэтому в некоторых случаях целесообразно сочетать ИФА и ПЦР для получения достоверных и максимально полных данных об особенностях течения коронавирусной инфекции. 24. СТРУКТУРА И СВОЙСТВА АНТИТЕЛ И АНТИГЕНОВ. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕН-АНТИТЕЛО. Антиген – это вещества, несущие признаки генетически чужеродной информации для макроорганизма, индивидуальные для микроорганизма и при попадании в организм человека способны вызывать специфические иммунологические реакции. Строение антигена: носитель + эпитопы (антигенная детерминанта). Эпитоп – выпуклость на поверхности макромолекулярной глобулы, т.е. отличительная часть молекулы антигена, обуславливающая специфичность АТ и эффекторных Т- лимфоцитов при иммунном ответе. Так как молекулы большинства антигенов имеют довольно большие размеры, в их структуре определяется множество антигенных детерминант, которые распознаются разными по специфичности антителами и клонами лимфоцитов. Количество эпитопов определяет валентность АГ. Эпитоп комплементарен активному центру АТ или Т-клеточному рецептору. 1. Различают линейные (секвенциальные) антигенные детерминанты (например, первичная аминокислотная последовательность пептидной цепи) и поверхностные (конформационные), расположенные на поверхности молекулы антигена и возникшие в результате вторичной или более высокой конформации. 2. Существуют концевые эпитопы, расположенные на концевых участках молекулы антигена, и центральные. 3. Определяют также «глубинные» (скрытые) антигенные детерминанты, которые проявляются при разрушении биополимера. Детерминантные группы, отделенные от макромолекулы-переносчика, называются гаптенами. Это простые химические группировки, которые не в состоянии обеспечить развитие иммунного ответа (отсутствие иммуногенности). Гаптены приобретают иммуногенность лишь после соединения с высокомолекулярным белком-носителем. Гаптены не могут стимулировать выработку антител, но, обладая вполне конкретной специфичностью, могут вступать в реакции взаимодействия с предсуществующими к ним антителами. Антигены обладают рядом характерных свойств: 1. чужеродность, 2. специфичностью 3. иммуногенностью. По происхождению различают: - экзогенные (возникшие вне организма), - эндогенные (возникшие внутри организма) антигены. По природе: 1. биополимеры белковой (протеиды) 2. небелковой природы (полисахариды, липиды, липополисахариды, нуклеиновые кислоты и пр.). По молекулярной структуре: 1. глобулярные (молекула имеет шаровидную форму) 2. фибриллярные (форма нити). По степени иммуногенности: 1. полноценные 2. неполноценные. Антитела появляются в сыворотке иммунизированного человека или животного в результате специфической реакции организма на введение в него антигенов. Антитела или иммуноглобулины – гликопротеиды. По своим эффекторным свойствам и структурным особенностям иммуноглобулины подразделяются на пять основных классов: IgA,IgD,IgG,IgМ,IgE. Все антитела имеют общий план строения. Молекула иммуноглобулина состоит из: двух одинаковых тяжелых (Н-цепь), двух одинаковых легких (L-цепь) полипептидных цепей. Наличие дисульфидных связей в молекуле обеспечивает прочное соединение легких цепей с NH2-концевыми участками тяжелых цепей и взаимодействие свободных участков тяжелых цепей между собой. В целом структура такого комплекса схожа с латинской буквой “Y” и характерна для иммуноглобулинов классов IgD, IgG, IgМ. При действии на молекулу IgG протеолитического фермента папаина образуется три фрагмента: 2 идентичных Fab-фрагмента (fragment antigen binding), 1 Fc-фрагмент (fragment cristalline). Fab-фрагмент молекулы антитела ответственен за специфическое распознавание антигена, Fc-фрагмент ответственен за биологические функции антител (связывание с компонентами системы комплимента, взаимодействие с мембранными рецепторами и т.д). Структурная особенность легких и тяжелых цепей – наличие в их составе различных областей (доменов) – вариабельной (V) и константной (С). Легкие цепи образуют по два домена ( VL-домен и CL-домен), тяжелые – четыре или пять в зависимости от класса Ig (один VH-домен и три или четыре CH-домена, соответственно). Специфичность антител определяется изменениями в последовательности аминокислотных остатков VH-домена и VL-домена цепей иммуноглобулина, взаимодействие между которыми формирует антигенсвязывающие участки этой молекулы. В аминокислотной последовательности V-области любой легкой или тяжелой цепи имеются положения, характеризующиеся частой заменой аминокислот – гипервариабельные участки. Другой протеолитический фермент пепсин разрывает пептидную связь, расположенную ближе к СООН-концу цепи от S-S связи между Н-цепями в Fc-фрагменте. В результате образуются так называемый рFc'-фрагмент, представляющий остатки тяжелых цепей и соединенные дисульфидными связями два Fab-фрагмента, обозначаемые как F(ab')2-фрагмент. Aффинность – это свойство молекулы антитела связываться с антигеном на основе точного соответствия их взаимной комплементарности. Aвидность – это свойство антитела связываться с антигеном, но основанное не на качественной стороне связи, а на поливалентности связывающих сайтов. 25. ELISA. ИММУНОБЛОТИНГ Direct ELISA (прямой) – этот метод является наиболее простым вариантом проведения ИФА. Сущность проведения этого метода состоит в следующем: ‒ на первом этапе растворенный в буфере анализируемый антиген вносится в пластиковую лунку (твердая фаза). В качестве буфера может быть использован карбонат /бикарбонатная буферная система рН 9,6 или нейтральный фосфатный буфер (PBS). происходит инкубация антигена в лунках. Стандартная температура инкубации 37 оС. В процессе инкубации – иммобилизация антигена на твердую фазу. После инкубации проводят отмывку, чтобы удалить свободные (неиммобилизованные) молекулы антигена. Для процедуры отмывки используют нейтральный буферный раствор (например, фосфатный) (2); ‒ после этого к иммобилизованному на пластиковой поверхности антигену добавляются антитела, конъюгированные с ферментом (стадия 3), которые специфичны данному антигены и напрямую связываются с ним; ‒ после инкубации вновь проводят процедуру отмывки и вносят в лунки соответствующий ферменту субстрат. В результате происходит ферментативная реакция с появлением окрашенного соединения (5). Через определенное время после развития окраски ферментативную реакцию останавливают, добавляя ингибирующий реагент (6); ‒ последним этапом является количественное определение оптической плотности окрашенного раствора с помощью спектрофотометрического оборудования. Непрямой (Indirect ELISA) – в лунке остаются только связавшиеся иммунные комплексы антиген-антитело; ‒ на следующем этапе в лунки добавляют антивидовые антииммуноглобулиновые антитела, связанные с ферментом. Эти антитела специфически связываются не с антигеном, а с антителами, специфичными к анализируемому антигену (6). Антивидовые антитела («вторые антитела») получают против иммуноглобулинов тех видов животных, которых иммунизировали антигеном. Достоинством меченных антивидовых антител является их универсальность, что позволяет использовать одни и те же антивидовые антитела для анализа различных антигенов; ‒ заключительные этапы этого метода соответствуют direct ELISA. Они также включают в себя стадии добавления субстрата, развития окраски и определение оптической плотности раствора. Прямой сэндвич ELISA ‒ пассивное прикрепление антител на твердую фазу (1, 2); ‒ затем эти антитела (прикрепленные антитела), специфичные к одному эпитопу антигена, связывают с антигеном (во избежание неспецифического связывания с твердой фазой антиген растворен в блокирующем буфере) (3). Важно чтобы в блокирующем буфере отсутствовали любые др. антигены, способные взаимодействовать с прикрепленными антителами; ‒ послеинкубациии отмывки иммунные комплексы (прикрепленное антитело-антиген) остаютсянатвердой фазе. На следующем этапе для последующей детекции иммунных комплексов в лунки добавляют антитела, конъюгированные с ферментом (антитела, специфичные к другому эпитопу антигена); ‒ на заключительном этапе добавляют хромогенный субстрат, и после остановки реакции измеряют оптическую плотность раствора. Непрямой сэндвич ELISA ‒ начальные стадии этого метода схожи с прямым сэндвич ELISA и заключаются в: иммобилизации на твердой фазе антител, специфичных к одному эпитопу антигена (стаПолесГУ 35 дии 1 и 2); связывании этих антител с антигеном (стадия 3); инкубации и отмывки; ‒ на следующей стадии к иммунным комплексам добавляют антитела (специфичные к другому эпитопу антигена) не несущие ферментативной метки; ‒ для детектирования иммунных комплексов, как и во всех непрямых методах ИФА в лунки вносят антивидовые антииммуноглобулиновые (вторые) антитела конъюгированные с ферментом; ‒ на заключительном этапе добавляют хромогенный субстрат, и после остановки реакции измеряют оптическую плотность раствора. Блоттинг (от английского blot – пятно) – методики выявления белков, которые обеспечиваются нанесением на какой-либо носитель разделенных молекул (например, антигенов). Одним из вариантов является вестерн-блоттинг (белковый иммуноблот). Этот метод используется для определения некоторых антител для диагностики инфекционных заболеваний. Суть метода состоит в следующем: На полоску наносятся различные антигены, связанные с инфекционным агентом. Далее наносится проверяемый биологический материал (сыворотка). Если в сыворотке есть антитела к этим антигенам, они связываются с ними. После этого проводится отмывка от несвязавшихся антител. После этого полоски промываются и на них наносятся вторичные антитела (антитела к антителам). Если на первом этапе после промывки остались антитела, они связываются с вторичными антителами. После этого вновь проводится промывка. Несвязавшиеся вторичные антитела смываются. Вторичные антитела имеют специальную метку, по которой мы можем определить, связались они с антителами или нет. 26. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ: ПРИНЦИП, ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОДВИЖНОСТЬ МОЛЕКУЛ, ВЕЩЕСТВ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЕЩЕСТВ. Метод электрофореза основан на миграции заряженной частицы под действием электрического поля. Многие важные биологические молекулы, такие как аминокислоты, пептиды, белки, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, обладают ионизируемыми группами и поэтому при любом рН существуют в растворе как электрически заряженные частицы: либо в виде катионов (+), либо в виде анионов (-). Под влиянием электрического поля эти заряженные частицы будут мигрировать либо к катоду, либо к аноду в зависимости от своего результирующего заряда. Образец. Заряд. Подвижность возрастает с увеличением суммарного заряда. Величина заряда обычно зависит от рН. Размеры. Чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность, что это связано с возрастанием сил трения и электростатических взаимодействий крупных молекул с окружающей средой по сравнению с молекулами меньших размеров. Форма. Молекулы одинакового размера, но различной формы, например фибриллярные и глобулярные белки, обладают разной подвижностью; это обусловлено различиями в силе трения и электростатическом взаимодействии. Электрическое поле. Согласно закону Ома, сила тока I (в амперах), напряжение U (в вольтах) и сопротивление R (в омах) связаны следующим соотношением: I = U/R. а разделение ионов в электрическом поле влияют все три фактора. Сила тока. Длина пути, пройденного ионами, будет пропорциональна времени пропускания тока. Следовательно, для максимальной воспроизводимости результатов сила тока в процессе электролиза не должна меняться, ток должен быть постоянным. Напряжение. Скорость миграции пропорциональна градиенту напряжения в поддерживающей среде. Сопротивление. Скорость миграции обратно пропорциональна сопротивлению. Сопротивление возрастает с увеличением длины слоя носителя и уменьшается при увеличении его ширины, а также с возрастанием концентрации буферных ионов. Буферный раствор. Буфер создает и стабилизирует рН носителя, а также самым различным образом влияет на скорость миграции веществ. Состав буферного раствора. Поскольку буферные растворы служат для образца растворителями, то некоторая диффузия нанесенного образца неизбежна. Это особенно заметно для малых молекул, таких, как аминокислоты и сахара. Диффузию можно свести до минимума, если наносить образцы в виде узких полос и в умеренных количествах, использовать высокое напряжение и как можно быстрее проводить разделение, а по его завершении быстро вынимать и высушивать образцы. Концентрация буферного раствора. По мере увеличения ионной силы буфера, скорость миграции образца уменьшится. При высокой ионной силе буфера суммарный ток увеличивается, а, следовательно, возрастает и количество выделяемого тепла. При низкой ионной силе ток, обусловленный переносом ионов буфера, уменьшается, а доля, приходящаяся на ток за счет ионов образца, возрастает. Таким образом, миграция образца ускоряется. В буфере с низкой ионной силой общая сила тока и выделение тепла уменьшаются, но диффузия возрастает, вследствие чего разрешающая способность хуже, чем при высокой ионной силе. Таким образом, при выборе ионной силы буфера приходится идти на компромисс. Применяющиеся обычно буферные растворы имеют концентрацию от 0,05 до 0,10 М. рН буферного раствора. Для полностью диссоциирующих веществ, таких, как неорганические соли, рН практически не играет роли, но для органических соединений рН определяет степень ионизации. С ростом рН ионизация органических кислот возрастает, а оснований, наоборот, уменьшается, и, следовательно, меняется их электрофоретическая подвижность. На такие соединения, как аминокислоты, обладающие как кислотными, так и основными свойствами (амфолиты), рН оказывает двоякое действие. Таким образом, скорость и направление движения амфолитов зависят от рН, и для их разделения можно использовать буферы с диапазоном рН от 1 до 11. Носитель. В качестве носителей используют относительно инертные вещества, однако их состав оказывает влияние на подвижность разных веществ. Выбор носителя очень важен, при этом необходимо учесть следующие процессы: Адсорбция. Адсорбция – удерживание молекул образца носителем. Это приводит к размыванию пятен на носителе (бумаге), в результате чего образец движется не в виде четкой полосы, а имеет вид кометы; разрешающая способность метода при этом уменьшается. Адсорбция приводит также к уменьшению скорости миграции. Наибольшей способностью к адсорбции обладает бумага, однако это нежелательное ее свойство удается устранить, если использовать ацетат целлюлозы. Электроосмос (электроэндосмос). Это явление обусловлено возникновением относительного заряда между молекулами воды буферного раствора и поверхностью носителя. Ионизация групп носителя и поверхностная адсорбция ионов буфера обычно приводит к образованию из молекул воды ионов гидроксония (H3O+). Так как эти ионы заряжены положительно, они движутся к катоду, захватывая растворенные нейтральные вещества и убыстряя движение катионов, скорость движения анионов при этом падает. Обычно данными эффектами можно пренебречь, однако, если определяют изоэлектрическую точку вещества, нужно вводить соответствующую поправку. Как правило, это делают, следя за движением электрически нейтральных соединений, таких, как мочевина или глюкоза. Электроосмос менее заметен в носителе из ацетата целлюлозы или в полиакриламидном геле, чем в крахмальном геле или на бумаге. Молекулярное сито. Свойствами молекулярного сита обладает применяемый в гель-электрофорезе полужесткий носитель (гель); такие его свойства способствуют разделению смесей заряженных макромолекул, например белков, которые различаются не только по электрофоретической подвижности, но также формой и размерами. Гели состоят из беспорядочно переплетающихся молекулярных цепей, распределенных по всему объему геля и образующих ситоподобную структуру. В соответствии с конкретными требованиями разделения размер пор гелей можно варьировать в некоторых пределах. Принцип действия молекулярного сита в агаровом, крахмальном и полиакриламидном гелях заключается в том, что крупные молекулы движутся сквозь него тем медленнее, чем меньше размер пор, который определяется числом поперечных сшивок в геле. При использовании гелей типа сефадекса ситуация обратная — в соответствии со спецификой их природы миграция малых молекул тормозится сильнее, чем крупных. |