ответы 50-99. 50. Окислювальне фосфорилювання
 Скачать 370.05 Kb.
|
|
96.Принцип методу визначення холестеролу в сироватці крові Методи визначення загального холестерину поділяються на: 1) колориметрические. Налічується близько 150 колориметрических методів, що грунтуються на реакціях утворення кольорових комплексів; 2) нефелометрические методи, засновані на порівнянні ступеня каламутності стандартного і досліджуваного розчину; 3) титрометричні методи; 4) флюоріметріческіе методи, що дозволяють визначати холестерин в мікрооб'ємах сироватки крові (наприклад, в 0,01 мл її); 5) Газохроматографічні і хроматографічні методи; 6) гравіметричні методи. Метод визначення загального холестерину в сироватці крові, заснований на реакції Лібермана-Бурхарда (метод Ілька) Принцип методу У сильнокислой безводному середовищі ХС взаємодіє з сумішшю сірчаної, оцтової кислот і оцтового ангідриду. У ході реакції ХС послідовно окислюється. При цьому кожна стадія реакції супроводжується утворенням молекули ХС, яка має на одну подвійну зв'язок більше, ніж з'єднання, з якого вона утворилася. В результаті кінцевого окислення іона 3,5-холестодіена виходить забарвлене з'єднання, розчинена в сірчаної кислоти і дає максимум абсорбції при 410 і 610 нм. Через нестійкості забарвлення сполуки час фотометрірованія має бути точно витримано. Реакційна суміш зі стандартним розчином ХС має смарагдовий колір. Однак проби сироватки можуть давати зелений, блакитний, бурий кольору. Це пов'язано з тим, що в результаті утворення ендогенного тепла в реакцію вступають багато компонентів сироватки крові. Крім того, в реакції Лібермана-Бурхарда вільний ХС і його ефіри утворюють кольорові комплекси з різним коефіцієнтом молекулярного поглинання. У разі високого вмісту ефірів ХС оптична щільність виявляється більш високою. Оскільки на пряме визначення ХС впливають багато факторів, реакцію ХС з сумішшю Лібермана-Бурхарда не можна вважати специфічною. Прямий метод визначення ХС відносно простий у виконанні і недорогий. Однак токсичність і здатність викликати корозію системи в сучасних аналізаторах обмежують застосування методу. У великих лабораторіях перевагу віддають ферментативним методів визначення ХС. Референтні величини: холестерин 4,65-6,46 ммоль/л (180-250 мг/дл). При концентрації холестерину в пробі вище 16 ммоль/л сироватку розводять фізіологічним розчином у співвідношенні 1: 1 (результат). Реакція чутлива на зміну температури, тому необхідно особливо дотримуватися охолодження реакційної суміші після добавки сірчаної кислоти. Білірубін в концентрації вище 50 мкмоль/л впливає на результат аналізу. Інтерференцію білірубіну можна виправити розрахунком. Зміст 17 мкмоль/л білірубіну призводить до завищення вмісту холестерину в сироватці приблизно на 0,1 моль/л. Сироватка повинна бути негемолізірованной. Необхідні реактиви 1. Крижана оцтова кислота. 2. Концентрована сірчана кислота. 3. Оцтовий ангідрид. 4. Абсолютний етиловий спирт. 5. Кислотна суміш: в суху колбу наливають 10 мл крижаної оцтової кислоти і 50 мл оцтового ангідриду, потім при постійному перемішуванні і охолодженні додають 10 мл концентрованої сірчаної кислоти. Суміш повинна бути безбарвною або злегка жовтуватою. Зберігати в холодильнику в темній склянці з притертою пробкою. 6. Калібрувальний розчин: 232 мг холестерину розчиняють в 2-3 мл хлороформу і доводять до об'єму 100 мл абсолютним етиловим спиртом. Приготований розчин містить холестерин в концентрації 6 ммоль/л. Хід визначення До 2,1 мл кислотної суміші повільно по стінці пробірки додають 0,1 мл плазми або сироватки без ознак гемолізу, перемішують струшуванням і ставлять на 20 хв у термостат або водяну баню при температурі 37 ° С, потім фотометрують в кюветі з довжиною оптичного шляху 0,5 см проти реактиву при довжині хвилі 625 нм. Побудова калібрувальної кривої і розрахунок. До 0,05-0,2 мл калібрувального розчину додають таку кількість кислотної суміші, щоб загальний обсяг був 2,2 мл, перемішують і витримують 20 хв при температурі 37 ° С, так само як і досвідчені проби, а потім фотометрують. Забарвлення калібрувальної проби, в яку взято 0,05 мл калібрувального розчину, відповідає змісту холестерину в плазмі 3 ммоль/л, проби, в яку взято 0,1 мл, - змістом 6 ммоль/л тощо Примітки 1. Попадання води призводить до помутніння розчину. 2. Сліди гемолізу або жовтушність досліджуваної плазми або сироватки служать причиною завищених результатів. 3. Можна використовувати для фотометрії та кювети з довжиною оптичного шляху 1 см, тоді кількість кислотної суміші подвоюють, а кількість досліджуваного матеріалу залишається колишнім. Метод визначення вмісту холестерину в сироватці крові, заснований на холестеролоксідазной реакції Принцип методу Холестерин і його ефіри виділяються з ліпопротеїнів детергентами. Холестерінестераза гидролизует ефіри. У результаті подальшого ферментативного окислення холестерину холестеріноксідазой утворюється Н2О2. Ефір холестерину + Н2О2? холестерин + жирні кислоти; Холестерин + О2? холеста-3-ОН + Н2О2; Н2О2 + n-хлорфенол + 4-аміноантипірину? хіноніміновий барвник + Н2О2. Рівні норми ХС, виявлені при обстеженні "загалом здорового населення", відносно високі. З точки зору ризику розвитку ішемічної хвороби серця рівні ХС бажані: 1) рекомендований - менш 5,18 ммоль/л; 2) помірний ризик - 5,18-6 , 19 ммоль/л; 3) високий ризик - більш 6,22 ммоль/л. Клініко-діагностичне значення Збільшення концентрації ХС спостерігається при полігенною гиперлипопротеидемии типу II А і II Б, III, гиперлипопротеидемии I, IV, V типів, вторинної, придбаної гиперлипопротеидемии, відзначається також при захворюваннях печінки, внутрішньо-і внепеченочном холестазе, гломерулонефриті, нефротичному синдромі, ХНН, злоякісних пухлинах підшлункової залози, простати, гіпотиреозі, подагрі, ІХС, вагітності, діабеті, алкоголізмі, анальбумінеміі, дісглобулінеміі, гострої переміжної порфірії. Зниження концентрації холестерину виявлено при дефіциті?-ліпопротеїду (хвороба Танжера), гіпо-та а-?-ліпопротеїдемія, некрозі печінкових клітин, злоякісних пухлинах печінки, гіпертиреозі, порушенні всмоктування, порушенні харчування, мегалобластноїанемії, сидеробластної анемії, таласемії, гострих тяжких захворюваннях, великих опіках, хронічних обструктивних захворюваннях легенів, розумової відсталості, ревматоїдному артриті, лімфангіоектазіі кишечника . Відмічені сезонні коливання рівня ХС, більш високі восени і взимку, більш низькі навесні і влітку. Повторне визначення ХС після інфаркту міокарда необхідно проводити через три місяці. Метод визначення вмісту ліпопротеїнів високої щільності в сироватці крові Ліпопротєїни дуже низької щільності (ЛПДНЩ ) і низької щільності (ЛПНЩ) в протилежність ліпопротеїнів високої щільності (ЛПВЩ) утворюють нерозчинні комплекси з гепарином в присутності іонів марганцю. У надосадової рідини, що залишилася після осадження ЛПНЩ і ЛПДНЩ, залишається?-Холестерин або ЛПВЩ. Нормальний вміст ХС ЛПВЩ в сироватці крові становить 0,9-1,9 ммоль/л. Рекомендуються наступні показники оцінки ймовірності розвитку атеросклерозу (табл. 8). Принцип методу Хіломікрони, ЛПДНЩ (ліпопротеїни дуже низької щільності) і ЛПНЩ (ліпопротеїни низької щільності) осідають додаванням фосфорно-вольфрамової кислоти і хлориду магнію. Після центрифугування супернатант містить ЛПВЩ (ліпопротеїни високої щільності) - фракцію, вміст холестерину в якій визначається ферментативно. Отримані значення достовірні, якщо: 1) в пробі немає хиломикронов; 2) концентрація триацилгліцеридів не перевищує 400 мг/100 мл; 3) в пробах не виявляється слідів III типу дисліпопротеїнемії. При вимірі на Hg 546 нм відбувається завищення кількості ЛПВЩ холестерину спектром поглинання гемоглобіну, яке можна ігнорувати при значеннях до 200 мг Нb/100 мл. Отриманий при центрифугировании супернатант повинен бути прозорий. Якщо проба містить велику кількість тригліцеридів (більше 1000 мг/100 мл), осадження ліпопротеїнів може бути неповним (каламутний супернатант) або частину осаду може плавати на поверхні. У цих випадках розвести зразок 1: 1 0,9%-ним розчином NaCl і повторити осадження. Клініко-діагностичне значення ХС-ЛПВЩ Епідеміологічні дослідження показали зворотну залежність між рівнями ХС-ЛПВЩ і поширеністю ІХС. Визначення ХС-ЛПВЩ сприяє виявленню ризику розвитку ІХС. Підвищенню рівня ХС-ЛПВЩ сприяють такі захворювання, як первинний біліарний цироз, хронічний гепатит, алкоголізм, інші хронічні інтоксикації. 97.Будова мембран та роль ліпідів, білків і вуглеводовмісних сполук в їх організації. 98.Модифікуюча та пошкоджуюча дія спиртів на біологічні мембрани 99.Будова м’язів. Механізм м’язового скорочення. Кожна скелетний м’яз являє собою активний орган руху, побудований з багатьох тканин, головною з яких є поперечнополосата м’язова тканина. Крім того, до складу м’яза входять пухка і щільна сполучні тканини, судини і нерви. Функціональне значення м’язи як органу полягає в її здатності скорочуватися і змінювати при цьому свої розміри. Це властивість м’язи обумовлено скорочувальної здатністю скелетної м’язової тканини, що в свою чергу пов’язано зі скороченням м’язових волокон в результаті укорочення міофібрил в межах кожного саркомера. М’язові волокна є основними робочими елементами м’язи. Розрізняють червоні і білі м’язові волокна. Чіткі межі між червоними і білими м’язовими волокнами відсутні, тому їх підрозділ виробляється на основі зіставлення кількісних показників їх структурних компонентів. Так, червоні м’язові волокна (нерідко позначаються міонов 1-го типу) містять більше саркоплазми і, відповідно, меншу кількість міофібрил. будову м’язів В саркоплазмі визначаються численні мітохондрії, які відрізняються високою активністю окислювальних ферментів (зокрема, СДГ – сукцинатдегідрогенази). Саркоплазма характеризується підвищеним вмістом міоглобіну. Діаметр червоних м’язових волокон дещо менше, ніж середній діаметр білих м’язових волокон. Навколо червоних міонов інтенсивно розвинена капілярна мережа. За даними гісторадіографіі, для цих м’язових волокон характерний більш високий рівень синтезу білків. На червоних м’язових волокнах деяких м’язів (наприклад очі) визначаються нетипові множинні моторні бляшки. Білі м’язові волокна (або міонов II-го типу) містять більшу кількість міофібрил, розташованих у вигляді стовпчиків, або колонок, що утворюють на поперечному зрізі широкі поля. Саркоплазма утворює вузькі прошарку між міофібріллярного колонками. У ній мало мітохондрій. Невисоко зміст і міоглобіну. Діаметр білих м’язових волокон більше, ніж червоних. На кожному білому м’язовому волокні є лише одна моторна бляшка типового будівлі. Білі міонов скорочуються швидше, ніж червоні. Між червоними і білими м’язовими волокнами є перехідні форми – проміжні волокна. М’язи людини, як правило, змішані за складом міонов різних типів, але кожна з них має свій малюнок, який визначається процентним співвідношенням числа червоних, білих і проміжних м’язових волокон. Важлива роль у побудові м’язи як органу належить сполучної тканини, яка об’єднує м’язові волокна в пучки, проводить кровоносні судини і нерви, а також забезпечує прикріплення м’яза до кісток. Пухка сполучна тканина усередині м’язових пучків називається ендомізіем. Пучки м’язових волокон з’єднуються між собою також прошарками пухкої сполучної тканини, яку називають перимизием. Зовні м’яз покрита щільною сполучнотканинною оболонкою – епімізіем, або фасцією. Внутрішньом’язова сполучна тканина забезпечує розвиток густий капілярної мережі навколо кожного м’язового волокна. Завдяки еластичним властивостям вона бере участь у процесах, що обумовлюють розслаблення м’яза після її скорочення. Виділяють кілька послідовних етапів запуску та здійснення м'язового скорочення. 1. Потенціал дії поширюється уздовж рухового нервового волокна до його закінчень на м'язових волокнах. 2. Кожненервове закінчення секретирует невелика кількість нейромедіатора ацетилхоліну. 3. Ацетилхолін діє на обмежену область мембрани м'язового волокна, відкриваючи численні керовані ацетилхоліном канали, що проходять крізь білкові молекули, вбудовані в мембрану. 4. Відкриття керованих ацетилхоліном каналів дозволяє великій кількості іонів натрію дифундувати всередину м'язового волокна, що веде до виникнення на мембрані потенціалу дії. 5. Потенціал дії проводиться вздовж мембрани м'язового волокна так само, як і по мембрані нервового волокна. 6. Потенціал дії деполяризує м'язову мембрану, і велика частина виникає при цьому електрики тече через центр м'язового волокна. Це веде до виділення з саркоплазматичного ретикулума великої кількості іонів кальцію, які в ньому зберігаються. 7. Іони кальцію ініціюють сили зчеплення між Актинові і міозіновимі нитками, що викликаютьковзання їх відносно один одного, що і складає основу процесу скорочення м'язів. 8. Через частку секунди за допомогою кальцієвого насоса в мембрані саркоплазматичного ретикулума іони кальцію закачуються назад і зберігаються в ретикулуме до приходу нового потенціалу дії. Видалення іонів кальцію від миофибрилл веде до припинення м'язового скорочення. Далі ми обговоримо молекулярні механізми цього процесу. На малюнкупоказаний основний механізм м'язового скорочення. Показано розслаблений стан саркомера (угорі) та скорочене стан (внизу). У розслабленому стані кінці Актинові ниток, що відходять від двох послідовних Z-дисків, лише незначно перекриваються. Навпаки, в скороченому стані Актинові нитки втягуються всередину між міозіновимі так сильно, що їх кінці максимально перекривають один одного. При цьому Z-диски притягуються Актинові нитками до кінцівміозінових. Таким чином, м'язове скорочення здійснюється шляхом механізму ковзання ниток. Що змушує нитки актину ковзати всередину серед ниток міозину? Це пов'язано з дією сил, що генеруються при взаємодії поперечних містків, що виходять від ниток міозину, з нитками актину. В умовах спокою ці сили не виявляються, однак поширення потенціалу дії вздовж м'язового волокна приводить до виділення з саркоплазматичної-го ретикулумавеликої кількості іонів кальцію, які швидко оточують міофі-Брілл. У свою чергу, іони кальцію активують сили взаємодії між нитками актину і міозину, в результаті починається скорочення. Для здійснення процесу скорочення необхідна енергія. Її джерелом є високоенергетичні зв'язку молекули АТФ, яка руйнується до АДФ з вивільненням енергії. У наступних розділах ми приведемо відомі деталі молекулярних процесів скорочення. Міозінових нитка. Вона складається з безлічі молекул міозину, молекулярна маса кожної становить близько 480000. На малюнку показана окрема молекула, і також - об'єднання багатьох молекул міозину в міозінових нитка, а також взаємодія одного боку цієї нитки з кінцями двох Актинові ниток. До складу молекули міозину входять 6 поліпептидних ланцюгів: 2 важкі ланцюги з молекулярною масою близько 200000 кожна і 4 легкі ланцюгиз молекулярною масою близько 20000 кожна. Дві важкі ланцюги спірально закручуються навколо один одного, формуючи подвійну спіраль, яку називають міозінових хвостом. З одного кінця обидві ланцюга згинаються в протилежних напрямках, формуючи глобулярну полипептидную структуру, звану миозиновой голівкою. Таким чином, на одному кінці подвійної спіралі молекули міозину утворюються 2 вільні головки; 4 легкі ланцюги також включені до складу миозиновой головки (по 2 в кожній). Вони допомагаютьрегулювати функцію головки під час м'язового скорочення. Міозінових нитка складається з 200 або більше окремих молекул міозину. Видно, що хвости молекул міозину об'єднуються, формуючи тіло нитки, а численні головки молекул видаються назовні по сторонам тіла. Крім того, поряд з головкою в сторону виступає частина хвоста кожної миозиновой молекули, утворюючи плечОу яке висуває головку назовні від тіла, як показано на малюнку. Виступаючі плечіі головки разом називають поперечними містками. Кожен поперечний місток може згинатися в двох точках, які називаються шарнірами. Один з них розташований в місці, де плече відходить від тіла миозиновой нитки, а інший - де головка кріпиться до плеча. Рух плеча дозволяє голівці або висуватися далеко назовні від тіла миозиновой нитки, або наближатися до тіла. У свою чергу, повороти головки беруть участь в процесі скорочення, що обговорюється в наступних розділах. Загальна довжина кожній миозиновой нитки залишається постійною і дорівнює майже 16 мкм. У самому центрі миозиновой нитки протягом 02 мкм поперечних містків немає, оскільки забезпечені шарнірами плечі відходять в сторони від центру. Сама міозінових нитка сплетена таким чином, що кожна наступна пара поперечних містків зміщена в поздовжньому напрямку щодо попередньої на 120 °, що забезпечує розподіл поперечних містків у всіх напрямках навколо нитки. АТФ-азная активність миозиновой головки. Є й інша особливість миозиновой головки, необхідна для м'язового скорочення: міозінових головка функціонує як фермент АТФ-аза. Як пояснюється далі, це властивість дозволяє голівці розщеплювати АТФ і використовувати енергію розщеплення високоенергетичної зв'язку для процесу скорочення. Актинові нитка. Актинові нитка складається з трьох білкових компонентів: актину, тропомиозина і тропоніну. Основою актиновой нитки є два ланцюги білкової молекули F-актину. Обидві ланцюга закручуються в спіраль так само, як і молекула міозину. Кожна ланцюг подвійної спіралі F-актину складається з полімеризованих молекул G-актину з молекулярною масою близько 42000. До кожної молекулі G-актину прикріплена 1 молекула АДФ. Вважають, що ці молекули АДФ є активними ділянками на Актинові нитках, з якими взаємодіють поперечні містки міозінових ниток, забезпечуючи м'язове скорочення. Активні ділянки на обох ланцюгах F-актину подвійної спіралі розташовані зі зміщенням таким чином, що вздовж всієї поверхні актиновой нитки зустрічається один активний ділянку приблизно через кожні 27 нм. Довжина кожної актиновой нитки - Близько 1 мкм. Підстави Актинові ниток міцно вбудовані в Z-диски; кінці цих ниток виступають в обох напрямках, розташовуючись у просторах між міозіновимі молекулами. Молекули тропомиозина. Актинові нитка також містить інший білок - тропомиозин. Кожна молекула тропомиозина має молекулярну масу 70000 і довжину 40 нм. Ці молекули спірально обплітають спіраль з F-актину. У стані спокою молекули тропомиозина розташовуються поверх активних ділянок Актинові ниток, перешкоджаючи їх взаємодії з міозіновимі нитками, який лежить в основі скорочення. Тропонін і його роль в м'язовому скороченні. По ходу молекул тропомиозина до них періодично прикріплені інші білкові молекули, звані тропонином. Вони являють собою комплекси трьох слабосвязанних білкових субодиниць, кожна з яких відіграє специфічну роль в регуляції м'язового скорочення. Одна з субодиниць (тропонін I) має високу спорідненість до актину, інша (тропонін Т) - до тропомиозина, третя (тропонін С) - до іонів кальцію. Вважають, що цей комплекс прикріплює тропомиозин до актину. Висока спорідненість тропоніну до іонів кальцію, як вважають, ініціює процес скорочення, про що йдеться у статті. |