аттестационная работа. Ушакова ЛА 2009-2011. Аттестационная работа на подтверждение высшей квалификационной категории Врача бактериолога Централизованной бактериологической Лаборатории Ушаковой Л. М якутск 2020 г
 Скачать 0.56 Mb.
|
|
Таксономия и общая характеристика. Бактерии рода Corinobacterium входят в группу коринеформных, то есть «дубинкообразных» бактерий – аэробных, грамположительных, неспорообразующих полиморфных палочек, ранее называющихся дифтероидами. В настоящее время род Corinobacterium состоит из 67 видов, 40 из которых, включая 2 таксономические группы, имеют клинические значение. Corinobacterium diphteriae представляют собой тонкие слегка ветвящиеся полиморфные палочки размером 0,3 – 0,8 х 1,5 – 8,0 мкм, располагающиеся или под углом, или параллельно («палисадом»); нередко на концах и в середине клеток имеются утолщения за счет зерен полиметафосфата (волютина), окрашивающихся метахроматично. Corinobacterium diphteriae являются факультативными анаэробами или аэробами нуждающиеся в богатых питательных средах, содержащих аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, с добавлением сыворотки или крови. Вид обладает каталазой. Обитают в носоглотке, а также на пораженных участках кожи. Токсигенные штаммы Corinobacterium diphteriae вызывают дифтерию. У лиц, обладающих уровнем антитоксина, достаточным для нейтрализации действия токсина (благодаря искусственной или естественной иммунизации), при заражении Corinobacterium diphteriae патологический процесс не возникает, но возбудитель может длительное время бессимптомно вегетировать в месте входных ворот – на слизистой зева и носа, что считается носительством. Corinobacterium diphteriae встречается только у человека. Внутри вида обычно выделяют 4 биотипа: gravis, mitis, belfanti, intermedius. Данное подразделение рекомендовано ВОЗ, несмотря на о, что биотип не подразумевает выделение в подтип и биотипирования недостаточно при проведении эпидемиологических исследований. Изначально разделение на биотипы было основано на морфологии колоний и биохимических свойствах. Однако только биотип intermedius может быть идентифицирован на основании морфологических свойств (маленькие, серые или полупрозрачные липофильные колонии) и ферментации декстрина. Другие биотипы дают рост колоний большего размера (до 2мм после 24 инкубации), белого цвета или непрозрачные, которые не отличаются друг от друга. Преаналитический этап. Материалом для исследования служат отделяемое пораженных участков слизистой оболочки носоглотки, кожных поражений. При обследовании здоровых лиц на дифтерийное бактерионосительство двумя различными тампонами берется мазок из зева (миндалины, дужки) и носа (нижние носовые ходы). При наличии пленок их также рекомендуется направить на бактериологическое исследование, хотя из них не всегда возможно выделение Corinobacterium diphteriae . Материал доставляется в лабораторию не позднее, чем через 2 часа после взятия. При невозможности доставить материал в этот срок используют погружение ватного тампона с материалом в пробирку с транспортной средой. Пробирки в вертикальном положении доставляются в лабораторию. Возможно использование транспортных сред Эймса или Стюарта. Транспортная теллуритовая среда для транспортировки готовится на базе 0.1% полужидком агаре (на высокопитательном триптическом переваре белка – триптиказосоевом, рыбном, казеиновом, мясном по Хотингеру), разлитому в пробирки по 5,0мл, перед употреблением асептично добавляют по 0,5мл нормальной сыворотки и 0,05мл (1каплю) 2% раствора теллурита калия. Тампоны с материалом из зева и носа сразу после взятия погружают в среду; по доставке в лабораторию пробирки помещают в термостат на ночь для обогащения. На другой день тампоном, слегка отжатым о стенки пробирки, делают посевы на один из вариантов кровяного теллуритового агара. Все коринебактерии относительно устойчивы к высыханию и незначительным температурным колебаниям. Лабораторная диагностика. Материал полученный с дифтерических пленок, можно окрасить в метиленовым синим по Нейссеру или Леффлеру, однако необходимо отметить, что чувствительность микроскопии ограничена. В окрашенных по Граму мазках можно увидеть грамположительные мелкие, беспорядочно разбросанные палочки, что позволяет предположить наличие коринебактерии. Культуральные методы. Средой для выделения и культирования Corinobacterium diphteriae служит кровяной агар на основе бараньей крови и одна из селективных сред (например, цистин-теллуритовый кровяной агар или свежеприготовленная среда Тинсдаля). Учет результатов проводится через 18-24 часов после инкубации при температуре 37С, предпочтительна инкубация в атмосфере с 5% содержанием СО2. Теллурит подавляет рост многих некоринеформных бактерий, но даже некоторые штаммы Corinobacterium diphteriae чувствительны к теллуриту калия и поэтому не дают роста на цистин-теллуритовом кровяном агаре, но могут расти на кровяном агаре. Необходимо отметить, что рост на цистин-теллуритовом кровяном агаре и восстановление теллурита не являются специфичными для Corinobacterium diphteriae , поскольку многие другие коринеформные бактерии могут также давать рост черных, хотя и меньшего размера, колоний. Недостатками среды Тинсдаля является малый срок хранения (<4 недель) и необходимость добавления лошадиной сыворотки. На среде Тинсдаля наблюдается как восстановление теллурита (черный цвет колоний), так и цистиназная активность (коричневый круг вокруг колоний). При недоступности цистин-теллуритового кровяного агара и среды Тинсдаля рекомендуется использовать кровяной агар с добавлением колистина и налидиксовой кислоты для выделения Corinobacterium diphteriae и других коринебактерий. Неселективный скошенный агар Леффлера в настоящее время не рекомендуется для выделения чистой культуры, поскольку на нем дают рост другие бактерии. Коринеформные бактерии не растут на агаре Мак-Конки. Тем не менее, если определяется рост таких бактерий на этой среде, их необходимо тщательно исследовать на предмет исключения быстрорастущих микобактерий. При невозможности использования промышленных сухих питательных основ для коринебактерий применяют среды на основе триптического гидрализата мяса по Хоттингеру, поскольку питательные основы должны содержать продукты триптического перевариварения белка (мяса, рыбы, казеина, сои). В качестве основы можно использовать препарат «Аминопептид для микробиологических целей», разведенный 1:4, с добавлением 5% ЭКД (экстракт кормовых дрожжей). Аминный азот в готовых основах – 1,5 г/л рН 7,4-7,6. Для первичного посева материала с целью выделения дифтерийных бактерий используют агаровые среды, содержащие гемолизированную кровь (барана, лошади, кролика, донора) и 0,03-0,04% теллурита калия, подавляющего рост сопутствующей флоры. Бактерии дифтерии восстанавливают металлический теллур из его солей, что способствует окрашиванию их колоний в черный цвет. Наиболее распространенные среды – кровяной теллуритовый агар и один из его вариантов – среда Клауберга – 2. Кровяной теллуритовый агар. К расплавленному и охлажденному до 45-50С питательному агару добавляют 7-10% дефибринированной гемолизированной крови животных или донора. Гемолиз достигается путем двух-трехкратного попеременного замораживания и оттаивания. Можно использовать кровь для переливания с истекшим сроком годности. Для этого кровь отстаивают, удаляют надосадочную жидкость; к эритроцитарной массе добавляют дистиллированную воду в объеме, равном объему осадка. К смеси агара и крови добавляют теллурит калия в конечной концентрации 0,03-0,04%. Для этого готовят 2% раствор теллурита калия путем растворения его навески в воде на кипящей водяной бане в течении 30 минут. Раствор сохраняют в холодильнике не дольше 1 месяца. Перед употреблением, в случае образования в растворе осадка, его основа прогревают в водяной бане вплоть до исчезновения хлопьев. К кровяному агару добавляют 1,5-2,0% 9по объему) 2% теллурита калия. Пример : к 90,0мл расплавленного и остуженного питательного агара добавляют 10,0мл препарата крови и 2,0 мл 2% раствора теллурита калия. После тщательного перемешивания среду разливают в чашки Петри и используют для первичного посева материала из зева и носа, а также для высева из транспортной среды Среда Клауберга – 2. Учитывая значительное разбавление агаровой основы жидкими ингредиентами, для приготовления этой среды питательную основу готовят на 35 агар-агаре; в случае прменения «Аминопептида» его разводят 1:3. Если основа готовится на сухом питательном агаре, то величнну навески, указанную на этикетке, увеличивают в 1,6 раза. Пример расчета: на этикетке флакона с сухим птательным агаром указана навеска для приготовления 1л среды – 30,0г. Для приготовления 1л питательной основы среды Клауберга-2 следует взять навеску 48,0г. Приготовление основных ингредиентов среды Клауберга-2: - Глицериновая смесь. К 40,0мл дефибринированной крови добавляют 20,0мл химически чистого глицерина, стерилизованного при 110С- 30минут. - Лаковая кровь. К 34,0мл. стерильной дистиллированной воды добавляют 16,0мл дефибринированной крови. Приготовление готовой среды Клауберга-2. В 100,0мл агаровой питательной основы, расплавленной и остуженной до 40С, добавляют 2,0мл 2% раствора теллурита калия, 10.0мл глицериновой смеси и 50,0мл «лаковой» крови. Изучение посевов и отсев колоний, выросших при первичном посеве материала. Колонии дифтерийных бактерий на теллуритовых агаровых средах с кровью изучают не ранее, чем через 24 часа инкубации при 37С. При отсутствии роста «подозрительных» колоний чашки инкубируют еще одни сутки. Выросшие колонии окрашены в черный цвет, суховаты и по консистенции напоминают застывшие сливочное масло, легко снимаются петлей. При сплошном росте заметны границы между отдельными колониями. Колонии биотипа gravis – матовые, аспидно-черные, 1,0-2,0мм в диаметре; благодаря уплощенному центру и фестончатому краю 48-часовые колонии напоминают цветок маргаритки. Колонии биотипа mitis – лаково-черные, круглые, выпуклые, с ровными краями, 0,5-1,0мм в диаметре. Колонии биотипа intermedius – слегка конусообразны, круглые, 0,5-1,0мм в диаметре, с серо-черным центром и зернистой поверхностью. С каждого посева отбирают 4-5 подозрительных колонии. Каждую из них отсевают одновременно на три среды: в пробирку с сывороточным агаром (для получения чистой культуры и изучения ее морфологических и биохимических свойств), на агаровую среду для определения токсигенности и уколом – в столбик среды Пизу (для определения фермента цистиназы). Через 24 часа инкубации исследуют появившиеся на агаре колонии, окрашенные в черный цвет благодаря восстановлению металлического теллура из его соли. Дифтерийные колонии суховаты, легко снимаются петлей. При сплошном росте заметны границы между колониями (рост в виде «шагреновой кожи»). Выросшие колонии рассматривают под лупой или в стереоскопическом микроскопе. Через 48 часов кровяных теллуритовых средах четко выявляются различия между колониями разных биотипов. Колонии биотипа gravis – аспидно-черные 1,0-1,5мм в диаметре; через 48 часов благодаря фестончатому краю, радиальной исчерченности и приподнятому к центру напоминают цветок маргаритки. Колонии биотипа mitis черные круглые слегка выпуклые, мельче, чем колонии биотипа gravis (0,5-1,5мм в диаметре), с ровными краями; к концу вторых суток инкубации бывают окружены валиком. Колонии биотипа intermedius – слегка конусообразные круглые 0,5-1,0мм в диаметре, с серо-черным центром и зернистой поверхностью. Не дожидаясь формирования различий, на второй день исследования (чаще через 24 часа, реже через 48 часов) отбирают несколько подозрительных колоний. Из каждой делают отсев в пробирку со скошенным сывороточным агаром и одновременно – на среды для определения токсигенности и цистиназы. Отсев нескольких одинаковых колоний обязателен, так как одно и то же лицо может быть инфицировано и токсигенным, и нетоксигенным штаммами одновременно. Отсев на среду для определения токсигенности делают из каждой колонии в виде отдельной «бляшки». Фермент цистиназу определяют путем посева части колонии уколом в столбик агаровой среды Пизу, содержащей нормальную сыворотку, цистин (субстрат искомого фермента) и уксусно-кислый свинец. Последний играет роль индикатора, который при соединении с Н2S, образующимся при расщеплении цистина, переходит в сернистый свинец – соединение темно-коричневого цвета. Посев на среду Пизу делают даже в том случае, если колония была снята со среды Тинсдейла и обладала коричневым ореолом. Третий день. Через сутки у выросшей чистой культуры изучают морфологические и тинкториальные свойства, юиохимическую активность – фермент цистиназу, отсутствие уреазы, а также учитывают результаты посева на среду для определения токсигенности. Из выросшей на сывороточном агаре культуры готовят препараты-мазки, окрашенные щелочным метиленовым синим Леффлера, убеждаются в чистоте культуры и изучают ее морфологию. Цистиназу определяют по чернению среды по ходу укола и вокруг него в виде коричневого «облачка». Дифтерийные бактерии никогда не образуют уреазу, расщепляющую мочевину до СО2 и NH3, в отличие от некоторых других коринебактерий. Для ее выявления взвесь испытуемой культуры вносят в каплю (0.1мл) реактива Заксе, содержащего спиртовой раствор мочевины и феноловый красный (в нейтральной среде – желтого цвета). Через 30 минут инкубации при 37С под влиянием образовавшегося гидрата аммония (NH4OH) смесь краснеет, что говорит о наличии уреазы. Если выросшая культура представляет собой типичные палочки, иногда с метахроматическими зернами, обладает характерным («сухим», иногда кремовым) ростом на сывороточном агаре. Расщепляет цистин и не имеет уреазы, то она может быть отнесена к виду Corinobacterium diphteriae. В случае выявления у штамма одновременно и цистиназы, и уреазы культура может быть заподозрена как Corinobacterium ulcerans. Чтобы окончательно подтвердить (или отвергнуть) эти диагнозы, а также установить биотип культуры, признанной дифтерийной, выделенную коринебактерию засевают на среды для определения сбраживания углеводов – глюкозы, мальтозы, сахарозы, крахмала и декстрина. В этот же день иногда удается определить и токсигенность по появлению линий преципитации на специальной среде с антитоксической сывороткой, куда был сделан посев в предыдущий день. Четвертый день. Учитывают результаты посевов на средах с углеводами и определяют культурально-биохимический тип выделенной культуры (или подтверждают выделение Corinobacterium ulcerans). Устанавливают наличие токсигенности (если это не было сделано на третий день) или, в случае отсутствия линий преципитации, относят изучаемую культуру к нетоксигенным. Если питательные среды приготовлены правильно, то в большинстве случаев на третий день исследования (т.е. через 48ч с момента его начала) возможна выдача окончательного ответа о выделении токсигенных дифтерийных бактерий (без указания биотипа). В случаях, если рост колоний при первичном посеве задерживается до 2 суток и /или токсигенность не выявлена через 24ч после посева на соответствующую среду, то выдача окончательного ответа задерживается еще на 1-2 сут. (т.е. до 72-96ч с момента начала исследования). В случае применения транспортной среды обогащения выдача окончательного ответа задерживается на 1 сутки. При необходимости сохранения выделенной дифтерийной культуры ее отсевают на столбик полужидкого агара с 10% нормальной сыворотки и хранят в холодильнике. Постановка теста на токсигенность дифтерийных культур in vitro иммуно-диффузным методом После 30-минутного подсушивания приготовленной чашки со средой и наложенной на ее поверхность фильтрованной бумажки с антитоксической сывороткой приступают к посеву испытуемых культур. Посев делают непосредственно с кровяного теллуритового агара из отобранных колоний, подозрительных на Corinobacterium diphteriae. Через 20-22ч посевы просматривают на предмет появления тонких линий преципитации. Если преципитаты не появились, то посевы сохраняются на 24ч в термостате. Наиболее четко феномен слияния наблюдается через 48 часов посева. Контрольный токсигенный штамм выделяют в лаборатории самостоятельно или получают из ГИСК имени Л.А. Тарасевича МЗ и СР РФ. Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам Чувствительность к пенициллинам, тетрациклинам, макролидам определяется диско-диффузионным методом. Методы экспресс – диагностики дифтерии При подозрении на заболевание дифтерией возможна бактериоскопия окрашенного мазка, приготовленного из фибринозного налета (пленки). Имеется быстрый культуральный метод по Леффлеру. При посеве на среду Ру или среду Леффлера уж через 6-8 часов формируются макроскопически заметные колонии в виде «шагреновой кожи», в отличие от посторонней флоры,рост которой еще незаметен к этому сроку. Полимеразная цепная реакция для выявления в материале дифтерийного токсина в настоящее время не рекомендуется в практических условиях по причине возможных ложноположительных реакций за счет неполноценного гена tox+ у нетоксигенных штаммов. Серологическая диагностика Серологические методы могут оказаться полезными при необходимости дифференциации стертых или атипичных форм дифтерии и неспецифических ангин с сопутствующим носительством токсигенных штаммов. В этих случаях определяют титр антитоксина (реакция нейтрализации по Йенсену) в первые 1-3 дня с начала болезни, клинически напоминающей дифтерию. Отсутствие антитоксина (титр<0,01МЕ/мл) говорит в пользу диагноза начавшейся дифтерии. Обнаружение антитоксина в «защитном» титре не имеет диагностического значения, так как может трактоваться двояко: или у больного был изначально повышенный уровень антитоксина, или титр антитоксина поднялся в течение первых дней инфекции потому, что больной был в прошлом привит (или инфицирован) и ответил быстрым подъемом антител по типу «бустер»- эффекта на заражение токсигенным штаммом. Определение титра антитоксина с диагностической целью можно проводить только до введения лечебной сыворотки. Полуколичественные серологические реакции с использованием анатоксина в качестве антигена (РНГА, ИФА) для дифференциальной диагностики дифтерии и ангины недостаточно точны. Таблица 14 |