Монография исследование водорослей.. Во́доросли. Аутентичного материала
 Скачать 2.99 Mb.
|
|
116 м I I III I II R = ABS„„ / ABS„j = 0,923  гичные фракции фукоиданов FeFl и FeF2 из F. evanescens практически не различались (табл. 5.1). Интересно отметить, что, при дополнительном экстрагировании Е evanescensв более жестких условиях (60°С, 12 ч) была получена фракция фукоидана FeF3, свойства которой (высокое содержание альгиновых кислот и значительная доля Man в составе моносахаридов, низкое содержание сульфатов) были близки к свойствам фракции CcF2 из С. costata(табл. 5.1). Возможно, фракции фукоиданов CcF2 и FeF3 извлекаются при разрушении клеточных стенок, Рис. 5.1. ИК-спектры фракций CcFl (А) и CcF2(B), причем для p. evanescens ЭТОТ выделенных из С. costataэкстракцией при темпе- ппопесс TDe6veT более жестких ратуре 20 и 60°С соответственно условий. Была показана воз- можность фракционирования фукоиданов, используя разные технологические режимы экстракции. При комнатной температуре из С. costataэкстрагировали преимущественно галактофуканы, а из F. evanescens— сульфатиро-ванные фуканы. При более жестких условиях экстракции (60°С) из С. costataвыделили фукоидан преимущественно аскофилланового строения. Для F.evanescens, имеющего более жесткий таллом, фукоидан аскофилланового строения был получен при экстрагировании в течении 12 часов при 60°С (фракция FeF3). Приведенные примеры показали, что технологии выде-  6 200 300 Объем элюции, мл Рис. 5.2. Хроматография фракции CcFl-f на DEAE-целлюлозе (3,5 X 14 см) линейным градиентом Н20- 2М NaCl 117 ления водорастворимых полисахаридов из водорослей разных порядков должны быть индивидуальными. Для дальнейшей детальной характеристики состава полисахаридов фракцию CcFl, выделенную из С. costataхолодной экстракцией, очистили гидрофобной хроматографией на ПХ-1 от примеси ламинарана, получили фракция CcFl-f, которую дополнительно фракционировали ионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе. Сорбированные на DEAE-целлюлозе полисахариды элюировали линейным градиентом Н20—2М NaCl (рис. 5.2). Получили подфракций CcFl-f-0,5 и CcFl-f-1,5, характеристика этих фракций приведена в таблице 5.3. Таблица 5.3 Характеристика подфракций CcFl-f-0,5 и CcFl-f-1,5, полученных хроматографией на DEAE-целлюлозе фракции фукоидана CcFl-f из С. costata
* — % от веса фракции фукоидана; н.о. — не определяли. Подфракция CcFl-f-0,5 содержала низкосульфатированный гетерогенный по моносахаридному составу фукоидан с высоким содержанием маннозы и глюкуроновой кислоты (табл. 5.3). В этой подфракций присутствовали примерно в равных количествах фукоиданы с молекулярными массами от 20 до 200 и от 200 до 800 кДа (рис. 5.3). Высокосульфатированная подфракция CcFl-f-1,5 составляла около 70% от исходного фукоидана (CcFl-f) (табл. 5.3). Около 90% от суммы моносахаридов этой подфракций были представлены Fuc и Gal в соотношении 1,0:0,28. Основную часть подфракций CcFl-f-1,5 составили фукоиданы со средней молекулярной массой 160 кДа, в меньшем количестве — 70 кДа. 118  ю.о 15.0 20.0 мин Рис. 5.3. Молекулярно-массовое распределение подфракций CcFl-f-0,5 (а) и CcFl-f-1,5 (б) фукоидана из водоросли C.costata. (Колонки (7,5 мм х 300 мм) Shodex Asahipak GS-520 HQ и GS-620 HQ) Следовательно, фракция CcFl содержала, как минимум, фукоиданы двух структурных типов — слабозаряженный уро-нофукоманнан и высо-косульфатированный галактофукан в весовом соотношении 1:2. Наличие различных структурных типов в составе общих фракций фукоиданов было отмечено для других видов водорослей. При фракционировании сульфа-тированного полисахарида, выделенного из F. vesiculosus(Sigma), авторы получили фукоиданы различного строения. Как основной компонент был выделен типичный фукан, содержащий только сульфатированную фукозу, как минорный компонент — низкосульфатированный гетерополисахарид, содержащий кроме фукозы другие моносахариды и высокий процент уроновых кислот (Nishino et al., 1994, Fitton, 2005). При экстрагировании водоросли Adenocytisutricularisраствором соляной кислоты при 20°С получили галактофукан, который показал высокое ингибирующее действие против вирусов герпеса HSV-1 и HSV-2. Продукты экстракции при температуре 70°С содержали уронофукан, который противовирусной активности не проявлял. Фракция уронофу-кана, кроме фукозы, характеризовалась высоким содержанием уроновых кислот и маннозы, другие моносахариды находились в ней в минорных количествах. Фракция отличалась сравнительно низкими молекулярными массами (Ponce et al, 2003). Hemmingson с соавторами (Hemmingson et al., 2006) выделили из Undariapinnatifida(цельное растение, в котором спорофиллы составляли 30% от общего веса) при комнатной температуре с выходом 4,5% суммарный полисахарид, который показал высокое ингибирующее действие против вирусов герпеса HSV-1 и HSV-2. При фракционировании полисахарида ионообменной хроматографией были получены 2 фракции F1M и F2M в соотношении 1,0:3,5, которые показали разное противовирусное действие. Более сульфатированная фракция галактофукана (F2M) показала высокое ингибирующее действие 119 против вируса герпеса HSV-1, практически аналогичное исходному образцу. Авторами также было установлено, что полисахарид продолжал показывать высокую активность против вируса герпеса HSV-1 при соотношении фракций F1M и F2M как 1:3, так и 1:1. При изменении соотношения фракций, равное 3:1, ингибирующее действие смеси полисахаридов против вируса герпеса HSV-1 уменьшилось вдвое. Оптимизация условий выделения фукоиданов из дальневосточной бурой водоросли Fucusevanescens Извлечение веществ из растительного сырья является сложным физико-химическим процессом, на протекание которого влияют несколько факторов. При разработке технологии необходимо определять оптимальные условия для экстракции с максимальным выходом однородного по составу продукта. Оптимизацию условий экстракции фукоидана проводили на примере бурой водоросли F. evanescens. В дальневосточных морях эта водоросль является наиболее перспективным сырьем для получения фукоидана, представляющего собой сульфатированный фукан. В качестве сырья использовали сухую, предварительно обработанную органическими растворителями, водоросль, которая содержала до 14% фукоидана (далее по тексту — сырье). В предварительных экспериментах были выбраны следующие условия экстракции фукоидана из сырья: средний размер частиц сырья — 5 мм, кислотность экстракционной среды рН 2,5, отношение водоросль: экстрагент — 1:15, температура — 50°С, кратность экстракций — 2 (Имбс и др., 2012). Для проверки степени влияния каждого из этих факторов на процесс экстракции фукоидана был проведен оптимизационный эксперимент по типу дробной реплики с двумя уровнями пяти переменных (25 2) с определяющими контрастами (Пономарев, 1976). Задача оптимизации сводилась к определению значений условий экстракции, обеспечивающих максимальный выход фукоидана и минимальное содержание сопутствующих веществ. План и результаты факторного эксперимента приведены в таблице 5.4. Таблица 5.4 План и результаты факторного эксперимента (с двумя уровнями пяти переменных) по оптимизации экстракции фукоидана из F.evanescens
120
Выход процесса Y (функция отклика) определяли, как Y — выход фукоидана (% от содержания в сырье); Y2 — выход экстрактивных веществ (% от веса сырья); Y3 — выход водорастворимых полисахаридов (% от веса экстрактивных веществ); Y4 — выход фукоидана (% от веса водорастворимых полисахаридов). Независимыми переменными (X) были: Х0 — соотношение сырье: экстрагент; X — значение рН; Х2 — кратность экстракции, раз; Х3 — продолжительность экстрагирования, ч; Х4 — температура, °С; Х5 — степень измельчения сырья, мм. Для определения ошибки эксперимента было поставлено 4 опыта в нулевых условиях (опыты 9-12, табл. 5.4). По результатам факторного эксперимента описание функции отклика в виде линейных уравнений регрессии имели вид: Y1= 59,6 - 2,1 Х1 + 10,7 Х2 + 5,8 Х3 + 9,9 Х4 + 7,1Х5 (1) Y2= 19,9 - 0,8^ + 4,3 Х2 + 0,6 Х3 + 1,7 Х4 + 0,8 Х5 (2) Y3= 69,8 + 13,1 Xj + 4,3 Х2 + 0,8 Х3 + 2,5 Х4 + 6,5 Х5 (3) Y4= 62,4 - 12,8 Xj + 3,3 Х2 + 2,2 Х3 + 3,3 Х4 - 2,8Х5 (4) Проверка значимости коэффициентов при факторах X в уравнениях (1-4) по критерию Стьюдента (с надежностью 95%) показала, что в уравнении (1) и (2) значимо отличны от нуля только коэффициенты при Х2, Х4 и Х5, а в уравнениях (3) и (4) - при Хг Это означает, что в выбранном диапазоне величин фукторов увеличение кратности (Х2) и температуры экстракции (Х4) должно приводить к увеличению выхода фукоидана (Y ) и экстрактивных веществ (Y ). При увеличении рН среды (Х:) следует ожидать повышения доли полисахаридов в экстрактивных веществах (Y ) и уменьшения доли фукоидана во фракции полисахаридов (Y4). Поскольку уменьшение размера частиц сы- | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||