Монография исследование водорослей.. Во́доросли. Аутентичного материала
 Скачать 2.99 Mb.
|
|
ПО Способы выделения и очистки полисахаридов из бурых водорослей В основе существующих способов переработки бурых водорослей лежат экстракционные технологии, усовершенствование которых позволят расширить список существующих в настоящее время извлекаемых природных соединений, их чистоту и количество. В настоящее время для переработки бурых водорослей применяют две технологические схемы. Первая основана на экстракции веществ водоросли водными растворами, вторая включает в себя последовательность экстракций органическими растворителями и водными растворами. Для выделения основных компонентов бурых водорослей — полисахаридов используют, в основном, экстракцию водными растворами в следующей последовательности: свежие водоросли после промывки опресненной водой сушат и измельчают для более эффективного экстрагирования. Водорастворимые полисахариды экстрагируют из водоросли горячей (Nishino. et al., 1989) или холодной водой (Hemmingson et al., 2006), водными растворами кислот при комнатной или повышенной температурах (Ponce et al., 2003; Имбс и др., 2009), 2% водным раствором хлорида кальция (Finch et al., 1986; Bilan et al., 2006; Билан и др., 2007). Из остатка водоросли альгиновые кислоты в виде солей извлекают раствором соды (Облучинская, 2002). Предложен способ экстракции фукоиданов водным этанолом в концентрациях до 50% (Облучинская, Воскобойников и др., 2002). Для облегчения экстракции полисахаридов используют протеолитические ферменты (Rocha et al., 2005; Silva et al., 2005). Экстракты, полученные с помощью перечисленных экстрагентов, как правило, содержат смесь полисахаридов (ламинараны, фукоиданы, альгинаты), а также низкомолекулярные вещества (пигменты, фенольные соединения, маннит, олигосахариды, белки и минеральные вещества). В некоторых работах показана возможность фракционирования фукоиданов, имеющих различное строение полисахаридной цепи, на стадии экстракции, используя различные технологические режимы (Ponce et al., 2003; Имбс и др., 2009). На количественный выход и однородность фракций полисахаридов кроме рН среды, влияют температура, время и кратность экстрагирования (Пономарев, 1976). Как правило, интенсификация процесса экстракции приводит к повышению выхода экстрактивных веществ и одновременно снижению селективности экстракции. Химическая природа экстрагента в значительной мере определяет химический состав и выход экстрактивных веществ, поэтому значительная доля исследований связана с расширением круга используемых экстрагентов — выявлением различий в составе веществ в зависимости от природы используемых экстрагентов или их смесей, а также от последовательности 111 их воздействия на водоросли. Немаловажными характеристиками потенциального экстрагента служат рентабельность (доступность и стоимость, возможность его регенерации) и экологичность (допустимость контакта потребительских продуктов, содержащих остатки экстрагента, с живыми организмами, охрана труда на производстве). Для получения при водной экстракции более чистых фракций полисахаридов рядом авторов предложена предварительная обработка водорослей органическими растворителями: 80—85%-ным водным этанолом (Percival et al., 1983; Nagaoka et al., 1999) или 85%-ным водным метанолом (Dobashi et al., 1989), или смесью хлороформ-метанол-вода (2:4:1) (Bilan et al., 2006; Bilan et al, 2002), или последовательно смесью хлороформ-метанол-вода и 80%-ным водным этанолом (Chizhov et al., 1999), или смесью метиленхлорида с этанолом (Облучинская, 2004). Такая обработка водорослей позволяет эффективно извлекать как полярные, так и неполярные низкомолекулярные вещества, но оставлять не извлеченными биополимеры. Информация о составе водно-этанольных экстрактов некоторых видов бурых водорослей имеется в работах (Имбс и др., 2009; Репина, 2005; Коровкина, 2007). Низкомолекулярные вещества почти полностью можно извлекать, обрабатывая водоросли последовательно водным этанолом и водным формальдегидом (Хотимченко и др., 2001, Пат. РФ 2135518). В результате использования последнего, пигменты остаются связанными с белково-целлюлозно-формалиновым комплексом (Барашков, 1972), однако, в последние годы санитарные власти запретили сброс в канализацию и прибрежные воды стоков, содержащих формальдегид. Таким образом, в результате предварительной обработки водорослей растворами органических растворителей можно получить суммарные экстракты биологически активных веществ разного химического состава. Последующей экстракцией водой и/или водными растворами кислот и щелочей можно извлекать из водоросли полисахариды. В целом, на основе экстракционных технологий получают многокомпонентные композиции биологически активных веществ с ненормируемым составом. Одновременно с развитием экстракционных подходов фракционирования экстрактов, содержащих полисахариды и низкомолекулярные вещества, и технологии тонкой очистки индивидуальных полисахаридов. Для выделения полисахаридов из водных растворов используют метод многократного осаждения этанолом. Этот метод позволяет очищать растворы полисахаридов от балластных веществ. Потери целевых компонентов при использовании этого метода достигают 112 30%. Очистить растворы полисахаридов от балластных веществ можно методом диализа или электродиализа через целлофановую полупроницаемую мембрану. Процесс диализа обычно протекает при комнатной температуре в течение длительного времени от 12 часов до 3 суток (Усов и др., 2001). Использование метода ультрафильтрации позволяет одновременно проводить диализ и концентрирование водных растворов полисахаридов (Пат. РФ 2240816). Разделение ламинарана и фукоидана проводят либо осаждением фукоидана в виде комплексов его с цетавлоном (Bilan et al., 2002), либо ступенчатым осаждением полисахаридов разными объемами этилового спирта. Разделение водных растворов фукоиданов и ламинарана проводят также с помощью гидрофобных сорбентов, таких как «Полихром 1» (политетрафторэтилен), на которых сорбируется ламинаран, а полианионные полисахариды остаются в растворе (Zvyagintseva et al., 1999). В некоторых случаях возможно разделение ламинаранов и фукоиданов и фракционирование последних дробным осаждением полисахаридов этиловым спиртом разной концентрации в присутствии поливалентных металлов (Bernardi, Springer, 1962). В ряде случаев ступенчатое растворение осадка позволяет затем получить фракции фукоиданов, различающиеся по химической структуре (Ponce et al., 2003). Известно, что даже один вид водоросли может содержать несколько структурных типов сульфатированных полисахаридов (Bilan et al., 2010). Для выделения более однородных по заряду фракций используют ани-оннобменную хроматографию. Этот метод используют также для разделения фукоидана и ламинарана. Наиболее популярными анионитами служат ДЭАЭ-сефадекс (Chizhov et al., 1999), ДЭАЭ-сефацель (Bilan et al., 2002), ДЭАЭ-целлюлоза (Шевченко и др., 2007) и ДЭАЭ-сефароза (Hemmingson et al., 2006). Водорастворимые альгинаты можно высадить из экстрактов раствором хлорида магния в этиловом спирте (Medcalf, Larsen, 1977) или подкислением экстрактов (Шевченко и др., 2007). Очевидно, что для успешных структурных и фармакологических исследований необходимо получать однородные по составу фракции фукоидана. Ранее были предложены условия для наиболее полного извлечения фукоидана из Silveciacanaliculataи Fucusvesiculosusраствором соляной кислоты (Black, 1952), а также из Eckloniakuromeгорячей водой (Nishino, 1989). Усов с соавторами предложили дополнительно фракционировать полисахариды на стадии выделения (Усов, Чижов, 1989). Как правило, в большинстве работ определяли влияние условий экстракции на общий выход фукоидана, и лишь некоторые исследователи учитывали изменение структурных характеристик фукоидана 113 при изменении условий экстрагирования (Ponce et al., 2003). Влияние технологических режимов на структурные характеристики продемонстрированы на примере экстракции и очистки фукоидана из бурых водорослей Costariacostataи F. evanescens(Имбс и др., 2009). Свежезаготовленные водоросли июльского сбора предварительно экстрагировали этанолом, затем остаток водоросли последовательно экстрагировали 3 часа раствором соляной кислоты (рН 2) при 20°С (холодная экстракция, фракции F1), и при 60°С (горячая экстракция, фракции F2). Из предварительных исследований известно, что F. evanescensотличается более высоким содержанием фукоидана по сравнению с представителями порядка Laminariales, поэтому провели дополнительную горячую экстракцию при 60°С в течение 12 часов (фракция F3). Характеристика полученных фракций фукоиданов приведены в таблице 1. Для С. costata(Cc) выход фракций фукоидана CcFl, полученной при 20°С, был примерно в 2 раза выше, чем фракции CcF2, полученной при 60°С. Для F. evanescens(Fe), напротив, наибольший выход был получен при горячей экстракции. Было отмечено высокое содержание уронанов и пониженное содержание белка во фракции F2 для обеих водорослей. По моносахаридному составу и содержанию сульфатных групп фракции фукоиданов FeFl и FeF2 были очень близки (табл. 5.1). Таблица 5.1 Характеристика фракций фукоиданов, выделенных из водорослей С. costataи F. evanescensраствором соляной кислоты (рН 2) последовательно при 20°С (F1) и 60°С (F2 и F3)
114
* — % от веса сухой обезжиренной водоросли; ** — % от веса фракции. Таким образом, из F. evanescensпри разных температурах были выделены сульфатированные фуканы (фракции FeFl и FeF2), практически не отличающиеся по моносахаридному составу, содержанию сульфатов и молекулярным массам. Аналогичные сульфатированные фуканы из этой водоросли были выделены ранее при 85°С (продолжительность экстракции 5 часов) (Bilan et al., 2002) и при 60°С (продолжительность экстракции 5 часов) (Zvyagintseva et al, 2003). Дополнительной экстракцией с небольшим выходом была получена фракция фукоидана FeF3 с высоким содержанием маннозы (26% от суммы нейтральных моносахаридов) и уроновых кислот (50% от фракции) (табл. 5.1). Наличие глюкозы в составе моносахаридов указывало на присутствие во фракциях F1 и F2 ламинарана. Можно отметить, что исходное содержание ламинарана в обеих водорослях невелико. Фракцию FeFl из F. evanescensразделяли дробным осаждением этанолом на фукоидан (FeFl-f) и ламинаран (FeFl-1), характеристика фракций представлены в таблице 5.2. Доля глюкозы в моносахарид ном составе фракции FeFl-f в результате дробного осаждения уменьшилась в 3,9 раза и возросла доля фукозы. Ранее было показано, что ламинаран из F. evanescensпредставляет собой 1,3;1,6-(3-В-глюкан с очень высоким содержанием (3-1,6-связанных (до 35%) остатков глюкозы (Звягинцева и др., 1994). Таблица 5.2 Характеристика фукоидана (FeFl-f) и ламинарана (FeFl-1), полученных осаждением этанолом из фракции FeFl, выделенной из F. evanescens экстракцией при 20°С
115
* — % от веса сухой обезжиренной водоросли; ** — % от веса фракции, и.о.- не определяли Сравнительный анализ полисахаридов фракций CcFl и CcF2, выделенных из С. costataпоследовательно при 20°С и при 60°С показал, что фракция CcFl из С. costataсодержала значительную долю глюкозы по сравнению с фракцией CcF2. Можно предположить, что почти весь ламинаран извлекался из С. costataпри холодной экстракции (табл. 5.1). Молекулярно-массовое распределение фукоиданов во фракциях CcFl и CcF2 из С. costataбыло неоднородным и находилось в интервале от 20 до 600 кДа с главным максимумом при 300 кДа и двумя пиками меньшей интенсивности с максимумами при 80 и 560 кДа. Фракция CcF2 содержала полисахариды с меньшей молекулярной массой, с максимумом при 70 кДа. Определение молекулярной массы полисахаридов выполняли методом ВЭЖХ. Разделение фукоиданов проводили на последовательно соединенных колонках Shodex Asahipak GS-520 HQ и GS-620 HQ (7,5 мм x 300 мм) при 50°С, элюируя Н20 (0,8 мл/мин). Колонки калибровали, используя как стандарты пуллуланы с молекулярными массами от 180 до 667000 Да и голубому декстрану Сравнительная оценка содержания сульфатных групп в фукоиданах CcFl и CcF2 проводилась путем сравнения величин отношений значений интенсивностей валентных колебаний при 1260—1264 см-1 (0=S=0 группы) и при 1082 см * (углеродный скелет сахарного кольца) относительно локальной базовой линии в области 1580—880 смл(рис. 5.1). Сравнение полученных величин (0,92 и 0,67 соответственно) показало, что содержание сульфатных групп во фракции CcFl было на 25% больше, чем во фракции CcF2, т.е. при холодной экстракции был получен более сульфатированный фукоидан. Кроме того, фракция фукоиданов (CcF2) содержала меньше Gal, но больше Man, чем фракция CcFl (табл. 5.1). При последовательной экстракции С. costataбыли получены фракции фукоиданов разные по составу и молекулярной массе.Тогда как анало- | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||