Монография исследование водорослей.. Во́доросли. Аутентичного материала

• Название: Аутентичного материала
• Анкор: Монография исследование водорослей
• Дата: 13.01.2023
• Размер: 2.99 Mb.
• Имя файла: Во́доросли.docx
• Тип: Монография; #884484
• страница: 8 из 20

Y₂ Z₂ ' X] Yj Zj Y₀ Z₀



Невосстанавливающий z

	"°Ч к
A
sr_	у	г
1™ OH

в, с,

zr—' Восстанавливающий

Рис. 3.5. Номенклатура, используемая для описания продуктов

масс-спектрометрической фрагментации гликоконьюгатов,

предложенная Домоном и Костелло

Ионы, сохраняющие заряд на агликоне (восстанавливающем конце для олигосахаридов), обозначаются в случае разрыва моносахаридного кольца — X, при разрыве Ci^O гликозидной связи — Y и при разрыве О^С_х гликозидной связи — Z. Ионы, сохраняющие заряд на невос-станавливающем кольце, обозначаются А, В, С. Численные индексы справа внизу для X, Y, Z от 0 и далее обозначают порядок моносаха-ридных остатков, начиная от агликона (восстанавливающего конца). Численные индексы слева вверху обозначают место разрыва связей в моносахаридном кольце и начинаются с наименьшего по порядку атома углерода (или кислорода) из двух разрывающихся связей, начиная с О (рис. 3.5). Напротив, численные индексы для ионов А, В, С начинаются с цифры 1 и считаются с невосстанавливающего конца (терминального моносахарида). В случае соединений с разветвленной углеводной цепью, вводятся дополнительные индексы а, (3 и т.д., причем индексом а обозначается самая длинная углеводная цепь.

Масс-спектрометрическая фрагментация сульфатированных олигосахаридов в режиме регистрации отрицательных ионов

Как уже было отмечено, особенности метода ИЭР МС позволили

обойти ограничения масс-спектрометрии МАЛДИ при анализе олигосахаридов, содержащих большое число кислотных остатков. В режиме регистрации отрицательных ионов практически не происходит отрыва лабильных кислотных групп, и формируются многозарядные ионы, дающие в режиме МС/МС наиболее интенсивные фрагментные ионы, отражающие информацию о типе связи, последовательности, разветвлениях и местах присоединения кислотных остатков и других заместителей. В связи с этим при изучении анионных поли- и олигосахаридов исполь-

67

зование тандемной ИЭР МС является предпочтительным.

Первая системная работа по изучению позиционных изомеров суль-фатированной фукозы с помощью тандемной ИЭР масс-спектрометрии, совмещенной с капиллярным электрофорезом, была выполнена группой французских ученых. Тиссо с коллегами в 2006 году, взяв за основу предыдущие работы по изучению позиционных изомеров сульфатированных гексоз (Karlsson et al., 1996; Minamisawa, Hirabayashi, 2005), установили, что, на основании данных ИЭР МС/МС, полученных в режиме регистрации отрицательных ионов, возможно различить 2-0-, 3-0- и 4-О-сульфатированные изомеры фукозы (Tissot et al., 2006). Сульфатированная фукоза (в положениях С2 и С4) дает характеристичные °'²Х- и ⁰²А-ионы, в то время как 3-О-сульфатированная фукоза дает только анион HS04- в качестве основного продукта фрагментации. На основании данных компьютерного моделирования и МС/МС экспериментов был предложен механизм образования фрагментных ионов, представленный на рисунке 3.6.

А

\------ОН OSC?

т£139Да




/f^&



В

Н ^ KSO,¹

иА97Да

0,ВСн'





С.л-

«-'-II ;

) Он

m/z183 Да

Рис. 3.6. Предполагаемые механизмы образования фрагментных ионов из сульфа-тированной фукозы в условиях ДИС МС/МС (режим регистрации отрицательных ионов). А, Б и В — схемы фрагментации 2-0-, З-О- и 4-О-сульфатированной фукозы с образованием соответственно ^0,2Х-иона с m/z139 Да, эпоксида и аниона HS0₄- с m/z

97 Да и ^0ДА-иона с m/z183 Да

68

Предложенный механизм формирования ^0,2Х- и ^0,2А-ионов включает разрыв связей между атомами С1 и 0-5, ведущий к образованию открытой кето-формы с последующей перегруппировкой МакЛафферти (McLafferty F.W. et al., 1982), характеризуемой разрывом связи между атомами С2 и СЗ пиранозного кольца фукозы (рис. 3.6., А и В).

Отсутствие ^0,2Х- и ^0,2А-ионов при внутрикольцевом разрыве для З-О-сульфатированной фукозы показывает, что атом водорода при гидроксильной группе атома СЗ играет ключевую роль в формировании ^0,2Х- и ^0,2А-ионов в процессе фрагментации, что согласуется с более ранними исследованиями (Minamisawa, Hirabayashi, 2005; Carroll et al., 1995). Отсутствие ^0,2Х- и ^0,2А-ионов также подтверждают исследования (1 ^3)-связанных сульфатированных дисахаридов, полученных из гепарина (Saad, Leary, 2004) и хондроитина (Desaire, Leary, 2000).

Таким образом, использование тандемной масс-спектрометрии в режиме регистрации отрицательных ионов позволяет определить последовательность моносахаридов в олигосахаридах. Установление типа связи и положения заместителей также доступно с помощью этого метода. Однако установить аномерную конфигурацию гликозидных связей и различить диастереоизомеры не всегда возможно без химической или химико-ферментативной модификации исследуемых объектов.

Применение масс-спектрометрии для исследования фукоиданов

Масс-спектрометрический анализ был применен нами для исследования фукоиданов, синтезируемых бурыми водорослями, обитающими в морях Дальнего Востока России.

Методы фрагментации фукоиданов

Структурные особенности сульфатированных полисахаридов, таких как хондроитинсульфаты, гепарины и каррагинаны, успешно исследуются современными МС-методами с МАЛДИ и ИЭР ионизацией.

Для МС-анализа необходимы методы фрагментации полисахаридов до олигосахаридов подходящих размеров, что достигается, в основном, благодаря наличию доступных ферментов, эффективно и специфично катализирующих расщепление сложных полисахаридных молекул (Harvey, 1999; Zaia, 2004). Для фрагментации сульфатированных полисахаридов используют также частичный кислотный гидролиз. Полученные олигоса-хариды, несущие информацию о строении исходного полимера, выделяют и анализируют. Например, Р. Даниель с коллегами использовали 0.75 мМ H₂S0₄ при 60°С для гидролиза фукоидана с последующим выделением олигосахаридов и анализом с помощью ИЭР MCⁿ (Daniel et al., 2007). Для

69

непосредственного анализа сложных реакционных смесей нами были применены как ИЭР МС, так и МАЛДИ МС, причем последний метод оказался более информативным, поскольку обладал низкой чувствительностью к нежелательным примесям и более высокой чувствительностью к полианионным компонентам в смесях за счет продуцирования только однозарядных ионов в источнике (Anastyuk et al., 2010).

Для фрагментации сульфатированных полисахаридов можно применять автогидролиз, представляющий собой, по сути, мягкий кислотный гидролиз с участием собственных сульфатных групп (находящихся в Н⁺-форме) в качестве источника кислоты. При этом структура образующихся олигомеров может зависеть от положения сульфатных групп в исходном полисахариде. Так, при исследовании сульфатированного галактана из красной водоросли Gigartinaskottsbergiiс помощью ЯМР-спектроскопии и МАЛДИ МС был использован указанный способ получения олигосахаридов (Ciancia et al., 2005). Автогидролиз проводили при концентрации полисахарида 10 мг/мл 11 часов при 60°С. При автогидролизе каррагинанов расщеплялась гликозидная связь между остатками 2-0-сульфат-3,6-ангидро-аТ)-галактозы и 4-0-сульфат-(ЗТ)-галактозы или 2,6-О-дисульфат-а-галактозы и 4-0-сульфат-(3-галактозы (Ciancia et al., 1991; Noseda, Cerezo, 1993; Stortz, Cerezo, 1987; Stortz, Cerezo, 1991). В процессе расщепления гликозидной связи наблюдалось отщепление сульфатной группы в положении С2. Гликозидные связи между остатками З.б-ангидро-а-Б-галактозы также расщеплялись, но с меньшей скоростью. Продукты фрагментации отдельного полисахарида, полученные автогидролизом и частичным кислотным гидролизом также могут различаться из-за различной чувствительности связей в условиях используемого метода.

Для сульфатированных полисахаридов широко применяется сольволиз как наиболее щадящий метод при необходимости их десульфатирования. Однако особенность структуры фукоиданов такова, что даже в условиях сольволитического десульфатирования происходит разрушение, как правило, большей части их молекул и выход подходящей для установления строения высокомолекулярной фракции (например, для метилирования) составляет от 7 до 40% (Bilan et al., 2002, Усов, Билан, 2009) от нативного полисахарида. Таким образом, теряется большая часть информации (часто до 90%) о строении фукоиданов. Нами впервые метод сольволиза был классифицирован как метод деградации фукоиданов и с помощью МС-методов для установления деталей структуры были проанализированы низкомолекулярные продукты, образующиеся при их сольволитическом расщеплении (Anastyuk et al., 2009, Шевченко и др., 2007).

70

Анализ структуры фукоидана из бурой водоросли Sacharinagurjanovae

Современные методы масс-спектрометрии для исследования фукоиданов стали использоваться сравнительно недавно, возможно, потому, что последние представляли сложный объект для изучения. Сообщения об успешном масс-спектрометрическом исследовании фукоиданов появились всего несколько лет назад (в 2007 году) (Daniel et al., 2007; Шевченко и др., 2007).

Первая работа была выполнена в ТИБОХ ДВО РАН и посвящена структурным исследованиям фукоидана из бурой водоросли S. gurjanovae(Шевченко и др., 2007). Высокоочищенная фракция фукоидана LgF2 была выделена из S. gurjanovaeи состояла из остатков фукозы и галактозы с приблизительно равным соотношением: FucGal = 1:0,8. Для масс-спектрометрического исследования LgF2 нами были использованы различные способы деполимеризации. Образец LgF2 дезацетилировали, а затем десульфатировали и получили фракцию LgF-DS. При десульфа-тировании наряду с отщеплением сульфатных групп произошла деполимеризация исследуемого фукоидана. Состав образовавшихся при этом олигосахаридов, которые экстрагировали метанолом, анализировали методом МАЛДИ МС. При анализе масс-спектров были обнаружены сигналы ионов фукоолигосахаридов [Fuc +Na]⁺ (n=2-ll) в режиме регистрации положительных ионов (рис. 3.7) и [Fuc_nS0₃] (n=2-ll), а также моносульфат фукозы в режиме регистрации отрицательных ионов (рис. 3.8). Присутствие в спектрах сигналов, отстоящих от пиков фукоолигосахаридов на 16, 32,48 Да, показывало наличие в смеси олигомеров ([Fuc_{n m}Hex_m+Na]⁺; n=4-6, m=l-3 и [Fuc_{n m}Hex_mS0₃]; n=3-6, m=l-2), состоящих из остатков фукозы и гексозы, идентифицированной как галактоза.

Таким образом, анализ спектров продуктов сольволиза LgF2 показал наличие фукоолигосахаридов со степенью полимеризации до 11 и смешанных олигосахаридов, содержащих в своем составе фукозу и галактозу (например, Fuc₃Gal₃). Олигосахариды, содержащие уроновую кислоту, отсутствовали.

В МАЛДИ масс-спектрах продуктов частичного кислотного гидролиза (LgF-H180) дезацетилированного образца фукоидана LgF2 (см. рис. 3.9 А,Б) были обнаружены моносульфаты фукозы и галактозы и серия ионов вида [Gal_nS0₃Na+Na]⁺ (n=2-3); [Gal_n+Na]⁺ (n=2-5) и [Gal_nS0₃]^- (n=2-3), полученных в соответствующих режимах регистрации и принадлежащих сульфатированным галактоолигосахаридам со степенью полимеризации от 2 до 5. Сигналы, соответствующие фуко- и смешанным фукогалак-тоолигосахаридам, отсутствовали. Очевидно, фрагменты молекул полисахарида, построенные из остатков фукозы, в условиях кислотного гидролиза разрушаются.

71

									m/z С о с т а в
									353.12 IFucr-Na]1
	4W.S9 IFucj-HjO+NuJ1
	p-^ 478.90 [Fuc3*Na]+
	495.07 [FucHex.+Na]"
	580.94 [Fuc^CNa+Na]1
	'47V 606.93 [Fuc^-lbOiNar
		&25 Q4 &25.04 [Fut4+Na]+
		I Wl.lM [Fu^Hcxi+WaJ
			657.07 IFu^He^Na]' 727.0S [R^SQjNa+NaJ4
■			753.26 [Futj-H^O+Na]4" 771.29 [Fuc,+Na]+ 787.33 [Facile*,+Na]_
			771-29 8IB.38 [FucsHe^+Na]
					889.47 rFWHjO+NuI1
-					917:60 [Fuus-Na]1 317ftC M3.7G [FucsHftSi+Nar
							949.65 [Fae5l!ex.+Na]'
							965.8! ("FucjHcxj НЧа]" 1019.89 [Fucf.SO,Na+Na]'
							1045.96 [FutT-H^O+NaJ4"
									1004.C9 iFucT-^aJ1
								1710.44 [FucB+Na]+
40 -								1356.94 [Fuo-Naf 150391 [Fucm-bNal1
								U io 44 1650.60 [Fucnl-Naf
20 -									1355.94 1 1503.91
										1650.60
0 '

800 1000