Corynebacterium diphtheriae
 Скачать 0.7 Mb.
|
|
Билет №1. 1.Морфология и свойства возбудителей дифтерии. 16.7.1.1. Возбудитель дифтерии Corynebacterium diphtheriae Дифтерия - острое антропонозное инфекционное заболевание, вызываемое токсигенными штаммами Corynebacterium diphtheriae,передающееся преимущественно воздушно-капельным путем, характеризующееся местным фибринозным воспалением преимущественно зева и носа, а также явлениями общей интоксикации и поражением сердечно-сосудистой, нервной и выделительной си- стем. Название заболевания происходит от греческого слова diphthera- пленка, перепонка, кожа, что обусловлено клиническими проявлениями данного заболевания.
Таксономическое положение возбудителя.Возбудитель дифтерии относится к роду Corynebacterium,виду C. diphtheriae.Название микроба происходит от греческих слов koryne- булава и bacteria- палочка, что связано с его морфологическими особенностями, а также греческого слова diphthera.Возбудитель дифтерии впервые был описан Э. Клебсом в 1883 г. Позднее, в 1884 г., Ф. Леффлер выделил чистую культуру коринебактерий дифтерии. Тинкториальные и морфологические свойства.C. diphtheriae- прямые или слегка изогнутые тонкие грамположительные неподвижные полиморфные палочки с заостренными или булавовидными концами размером 0,3-0,8x1,5-8,0 мкм. Спор и капсул не образуют. Они утолщены на концах за счет наличия зерен волютина (зерен Бабеша-Эрнста), что придает им вид булавы или булавки. Зерна волютина воспринимают анилиновые красители более интенсивно, чем цитоплазма клетки. Вследствие метахромазии они приобретают необычный цвет. Зерна волютина выявляют при окраске препаратов по Леффлеру метиленовым синим, а также при окраске по Нейссеру. При люминесцентной микроскопии они окрашиваются корифосфином в оранжево-красный цвет, в то время как тела бактерий окрашиваются в желто-зеленый цвет. При окраске по Граму зерна волютина не выявляются. Дифтерийная палочка не обладает кислотоустойчивостью. Она имеет микрокапсулу с входящим в ее состав корд-фактором. В состав клеточной стенки входит большое количество липидов, в том числе некислотоустойчивые коринеформные миколовые кислоты. Для C. diphtheriaeхарактерен полиморфизм размеров и формы. В мазках возбудители дифтерии располагаются под углом, напоминая латинские буквы L, X, V, Y или растопыренные пальцы рук. Эта особенность, связанная со способом деления клетки, отличает возбудителей дифтерии от других коринебактерий, которые в микропрепаратах чаще располагаются в виде частокола из нескольких параллельно лежащих клеток, зерен волютина не имеют или содержат их в большом количестве.
Культуральные свойства.Возбудитель дифтерии относится к факультативным анаэробам, в отличие от коринеформных бактерий, являющихся облигатными аэробами, культивируется при 37 ?С. Требователен к условиям культивирования. В отличие от коринеформных бактерий, C. diphtheriaeна простых питательных средах не растет. Для первичного посева материала используют дифференциально-диагностические среды, содержащие гемолизированную кровь (барана, лошади и др.) и 0,03-0,04% теллурита калия или натрия, которые подавляют рост сопутствующей микрофлоры (среду Клауберга), на которых C. diphtheriaeобразуют колонии черного или черно-серого цвета в течение 24-48 ч. В качестве элективных сред для накопления чистой культуры используют агар с добавлением 10% нормальной лошадиной сыворотки (элективная среда Ру) или свернутую кровяную сыворотку с добавлением сахарного бульона (элективная среда Ру-Леффлера). На элективных средах возбудитель дифтерии опережает в росте банальную микрофлору, и через 8-14 ч вырастает в виде изолированных то- чечных, выпуклых желтовато-кремовых колоний с гладкой или слегка зернистой поверхностью. Биохимические свойства.Возбудитель дифтерии обладает высокой ферментативной активностью. Все штаммы C. diphtheriaeферментируют глюкозу и мальтозу с образованием кислоты и не разлагают сахарозу, не продуцируют уреазу и не образуют индол. Отсутствие способности ферментировать сахарозу и разлагать мочевину (отрицательная проба Закса, цвет бульона с мочевиной и феноловым красным не изменяется) является важным дифференциально-диагностическим признаком, отличающим C. diphtheriaeот сходных микроорганизмов. Другим важным дифференциально-диагностическим признаком является способность C. diphtheriaeпродуцировать фермент цистиназу (цистинсульфатгидразу), расщепляющую цистин или цистеин до сероводорода, который, реагируя с уксуснокислым свинцом, вызывает почернение столбика сывороточного агара в результате образования в нем сернистого свинца (положительная проба Пизу).
Вид C. diphtheriaeпо культурально-биохимическим свойствам можно подразделить на 4 биовара: gravis, mitis, intermediusиbelfanti,что важно с эпидемиологической точки зрения. В связи с тем что наиболее стабильным дифференцирующим признаком является тест на крахмал, по этому показателю в практических лабораториях все возбудители дифтерии делятся на два биовара: gravis(тяжелый) и mitis(облегченный). Все штаммы, не ферментирующие крахмал, относятся к биовару mitis,а ферментирующие крахмал - к биовару gravis. На дифференциально-диагностических кровяных теллуритовых средах бактерии биовара gravisобразуют сухие, матовые, размером 2-3 мм (крупные) плоские серовато-черные колонии, приподнятые в центре. Периферия колоний светлая с радиальной исчерченностью и изрезанным, волнистым краем (R-форма колоний). Такие колонии напоминают цветок маргаритку. На жидкой среде данные микроорганизмы образуют пленку на поверхности, а также крошковидный или крупнозернистый осадок. Жидкость остается прозрачной. Бактерии биовара mitisобразуют мелкие (1-2 мм) гладкие блестящие черные полупрозрачные колонии с ровными краями (S-формы колоний), окруженные зоной гемолиза. На жидкой среде они дают равномерное помутнение и порошкообразный осадок. Вид C. diphtheriaeподразделяется также на серовары, фаговары и корициновары, что не нашло широкого применения для их эпидемиологического маркирования. Наиболее перспективным является генотипирование, что используется эпидемиологами для выявления эпидемических штаммов и связи между инфицированными людьми. Факторы патогенности.Основными факторами патогенности возбудителей дифтерии являются поверхностные структуры липидной и белковой природы, к которым относятся корд-фактор, вместе с К-антигенами и коринеформными некислотоустойчи- выми миколовыми кислотами, входящий в состав микрокапсулы, ферменты и токсины. Поверхностные структуры способствуют адгезии микробов в месте входных ворот инфекции, препятствуют фагоцитозу бактерий, оказывают токсическое воздействие на клетки макроорганизма, разрушают митохондрии.
C. diphtheriaeобразуют ферменты агрессии и инвазии: нейраминидазу и N-ацетилнейрамиатлиазу, гиалуронидазу, а также гемолизин и дермонекротоксин. Нейраминидаза и N-ацетилнейрамиатлиаза действуют на эстафетной основе. Нейраминидаза является фактором распростране- ния, способствуя отщеплению от поверхностных рецепторов клеток сиаловых кислот. Это модифицирует клеточную поверхность, подготавливая ее рецепторы для прикрепления дифтерийного токсина. Лиаза расщепляет N-ацетилнейраминовую кислоту на пируват, который стимулирует рост C. diphtheriae,и N-ацетилманнозамин. Гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту соединительной ткани. Одним из последствий ее действия являются повышение проницаемости кровеносных сосудов и выход плазмы за их пределы, что ведет к отеку окружающих тканей. Дермонекротоксин вызывает некроз клеток в месте локализации возбудителя. Вышедший за пределы сосудов фибриноген плазмы, контактируя с тромбокиназой некротизированных клеток макроорганизма, превращается в фибрин, что и является сущностью дифтеритического воспаления. Находясь внутри дифтеритической пленки, C. diphtheriaeнаходят отличную защиту от действия эффекторов иммунной системы макроорганизма. Размножаясь, они образуют в большом количестве основной фактор патогенности - дифтерийный гистотоксин. Дифтерийный гистотоксин синтезируется в виде единой полипептидной цепи (протоксина), который активируется под действием протеолитических ферментов, что ведет к образованию А-В-фрагментов токсина. Фрагмент В отвечает за специфическое взаимодействие с ганглиозидными рецепторами клетки и участвует в образовании транспортного канала для фрагмента А. Активированный фрагмент А отвечает за токсичность. Внутри пораженных клеток фрагмент А обладает ферментативной АДФрибозилтрансферазной активностью. Его мишень - фактор элонгации EF-2 (трансфераза 2), необходимый для построения пептидных цепей на рибосомах эукариотической клетки. Блокада фермента ведет к нарушению синтеза белка на стадии элонгации и гибели клеток в результате некроза. Дифтерийный гистотоксин обладает специфичностью действия, поражая клетки сердечнососудистой, нервной систем, почек и надпочечников.
Способность к продукции дифтерийного гистотоксина детерминирована tox-геном, локализованным в ДНК лизогенного фага. Заболевание вызывают только токсигенные штаммы C. diphtheriae.Нетоксигенные штаммы не вызывают дифтерии, хотя способны длительно персистировать в респираторном тракте человека. Из лабораторных животных к дифтерийному гистотоксину чувствительны морские свинки, кролики, обезьяны. Определение токсигенности C. diphtheriaeпроводят также на куриных эмбрионах и культурах клеток. Устойчивость в окружающей среде.Благодаря наличию липидов C. diphtheriaeобладают значительной устойчивостью к воздействию факторов окружающей среды. В капельках слюны, прилипших к стенкам стакана, на ручках дверей и детских игрушках они могут сохраняться до 15 дней. Выживаемость их на предметах окружающей среды может достигать 5,5 мес и не сопровождаться утратой или снижением вирулентности. Данные микроорганизмы размножаются в молоке. Это имеет эпидемиологическое значение. К числу неблагоприятных факторов, действующих на C. diphtheriae,относятся прямые солнечные лучи, высокая температура и химические агенты. При кипячении C. diphtheriaeпогибают в течение 1 мин, в 10% растворе перекиси водорода - через 3 мин, в 5% карболовой кислоте и 50-60% алкоголе - через 1 мин. Эпидемиология, патогенез и клинические проявления заболевания.Дифтерия - это антропонозное заболевание. Источником инфекции являются больные и носители токсигенных штаммов C. diphtheriae.Заражение происходит воздушно-капельным путем. Не исключены контактно-бытовой и алиментарный пути передачи инфекции. Наиболее восприимчивы к данному заболеванию дети ясельного и школьного возраста. Среди взрослых к профессио- нальной группе повышенного риска относятся работники общественного питания и торговли, школ, детских дошкольных и ме- дицинских учреждений.
Патогенез и клинические проявления заболевания.Входными воротами инфекции служат слизистые оболочки ротоглотки (нёбные миндалины и окружающие их ткани), носа, гортани, трахеи, а также слизистые оболочки глаз и половых органов, поврежденные кожные покровы, раневая или ожоговая поверхность, опрелости, незажившая пупочная ранка. Наиболее часто встречается дифтерия ротоглотки (90-95%), чему способствуют воздушно-капельный путь передачи, тропизм микробов к слизистой оболочке и барьерная функция лимфоидного глоточного кольца. Инкубационный период при дифтерии от 2 до 10 дней. Дифтерия относится к токсинемическим инфекциям, при которых микроб остается в месте входных ворот инфекции, а основные клинические проявления заболевания связаны с действием белкового бактериального токсина. Начальным этапом инфекционного процесса являются адгезия микроба в месте входных ворот инфекции за счет поверхностных структур бактериальной клетки (корд-фактор и миколовые кислоты) и их колонизация. Размножаясь в месте входных ворот инфекции, C. diphtheriaeобразует дифтерийный гистотоксин, который оказывает местное воздействие на клетки тканей, а также поступает в кровь, что ведет к возникновению токсинемии. При наличии антитоксического иммунитета процесс может ограничиться легкой формой заболевания или формированием бактерионосительства. В области входных ворот инфекции развивается воспалительная реакция, сопровождающаяся некрозом эпителиальных клеток, отеком, выходом фибриногена из сосудистого русла в окружающие ткани и превращением его в фибрин под действием тромбокиназы, освободившейся при некрозе эпителиальных клеток. Это ведет к образованию налетов белого цвета с сероватым или желтоватым оттенком, содержащих большое количество микробов, продуцирующих токсин. Фибринозная пленка - характерный признак дифтерии. Фибринозное воспаление при дифтерии может быть дифтеритическим или крупозным.
Дифтеритическое воспаление возникает на слизистых оболочках с многослойным плоским эпителием, все клетки которого прочно связаны как между собой, так и с подлежащей соединительноткан- ной основой. Фибринозная пленка плотно спаяна с подлежащей тканью и не снимается тампоном при осмотре. При попытке снять ее слизистая оболочка кровоточит. При дифтерии ротоглотки, помимо изменения нёбных миндалин, отмечаются отек окружающих мягких тканей и увеличение региональных лимфатических узлов. Патологический процесс может распространяться как в вышележащие отделы, поражая слизистую оболочку носа и среднего уха, так и в нижележащие отделы. Крупозное воспаление возникает при локализации патологического процесса в нижних дыхательных путях, где слизистые оболочки содержат железы, выделяющие слизь и покрытые однослойным цилиндрическим эпителием. Здесь фибринозная пленка располагается поверхностно и легко отделяется от подлежащих тканей. В связи с легкостью отторжения поврежденных тканей, содержащих микробы, токсические формы дифтерии при таких поражениях не возникают. Такие больные часто откашливают целые слепки из различных отделов дыхательных путей. При распространении процесса из ротоглотки вниз по дыхательным путям в виде нисходящего крупа (от шотландского croak- карканье) крупозное воспаление последовательно захватывает трахею и бронхиальное дерево до его мельчайших разветвлений, что ведет к развитию ас- фиксии. Локализация процесса при дифтерии определяется входными воротами инфекции. Возможны возникновение дифтерии носа, гортани, трахеи, глаз, уха, половых органов у девочек, дифтерии кожи и ран. При одновременном поражении двух органов и более диагностируется комбинированная форма дифтерии. Наиболее тяжело протекает гипертоксическая форма дифтерии, которая может привести к смерти в течение первых суток. В благоприятных слу- чаях заболевание заканчивается полным выздоровлением.
Иммунитет.После перенесенного заболевания формируется длительный и напряженный гуморальный антитоксический иммунитет. В отличие от него, антибактериальный иммунитет при дифтерии ненапряженный и серовароспецифичный. Наличие антитоксического иммунитета не препятствует формированию носи- тельства токсигенных штаммов C. diphtheriae. Микробиологическая диагностика.Основным является бактериологический метод. При наличии клинических симптомов заболевания выделение токсигенных штаммов C. diphtheriaeявляется абсолютным подтверждением диагноза дифтерии, а при их отсутствии свидетельствует о бактерионосительстве. Бактериологи- ческому исследованию в обязательном порядке подвергаются все больные с острыми воспалительными явлениями в носоглотке, а также больные с подозрением на дифтерию. Материалом для исследования служат слизь и пленки из очагов воспаления, а также секрет из очагов патологического процесса. Сбор материала необходимо проводить в течение 3-4 ч (не позже 12 ч) с момента обращения больного. Для взятия материала используют сухие ватные тампоны, если посев будет проведен не позднее 2-3 ч после сбора материала. При транспортировке на дальние расстояния можно использовать тампоны, предварительно смоченные 5% раствором глицерина. При исследовании на дифтерию во всех случаях, в том числе и при экстрафарингеальной локализации, материал для исследования берут раздельными тампонами одновременно из зева и носа, а при необходимости и из других мест локализации воспаления. Посев делают раздельно на поверхность одной из рекомендованных инструкцией сред. Бактериологическая лаборатория через 48 ч выдает ответ об отсутствии в анализах C. diphtheriaeили при наличии положительных результатов исследования на токсигенность (не более 6 колоний) и пробы на цистиназу выдает ответ о выделении токсигенных штаммов C. diphtheriae.
Для оценки антитоксического иммунитета у отдельных лиц или всего коллектива, дифференциации заболевания дифтерией от других заболеваний применяют серологические методы диагностики. Для этого применяют РНГА (РПГА) с антигенным эритроцитарным диагностикумом и ИФА. Защитный титр антител в РНГА равен 1:40. РНГА применяют также для обнаружения антибактериальных антител в острый период заболевания, на содержание которых не влияет применение антитоксической сыворотки в лечебных целях.Для ускоренного обнаружения дифтерийного токсина как в бактериальных культурах, так и в биологических жидкостях (сы- воротка крови) применяют РНГА с антительным эритроцитарным диагностикумом и ИФА.Из молекулярно-генетических методов исследования применяют ПЦР, что позволяет определятьtox-ген в минимально короткие сроки (4-5 ч). Для установления источников и путей распространения дифтерийной инфекции, слежения за структурой популя-ции возбудителя и прогнозирования эпидемиологического процесса используют риботипирование. |