Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с

• Название: Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
• Анкор: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 9.74 Mb.
• Имя файла: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Тип: Документы; #189
• страница: 22 из 88

ГЛАВА 8
Направленный мутагенез и генная инженерия белков

Технология рекомбинантных ДНК позволяет выделять гены любых белков, существующих в природе, экспрессировать их в специфическом хозяйском организме и получать чистые белковые продукты. Однако физические и химические свойства таких «природных» белков часто не удовлетворяют условиям, обеспечивающим возможность их промышленного применения. Иногда для получения белков, обладающих нужными свойствами, в качестве источника соответствующих генов используют организмы, растущие в необычных, зачастую экстремальных условиях. Например, для синтеза α -амилазы, не утрачивающей своей активности при высокой температуре, выделили ее ген из Bacillusstearothermophilus — бактерии, естественной средой обитания которой являются горячие источники с температурой воды 90 °С. Полученная таким образом α-амилаза оставалась активной при температурах, при которых осуществляют промышленное производство этилового спирта из крахмала. Для получения белков с заранее заданными свойствами можно использовать также мутантные формы генов. Однако число мутантных белков, образующихся в результате замены отдельных нуклеотидов в структурном гене с помощью обычного мутагенеза, чрезвычайно велико. Мутагенез с последующим отбором редко приводит к существенному улучшению свойств исходного белка, поскольку большинство аминокислотных замен сопровождается снижением активности фермента.

Для создания белков со специфическими свойствами можно использовать другой подход, основанный на внесении изменений в кодирующие их клонированные гены. Это позволяет получать белки с другими, чем у их аналогов, свойствами.

•   Изменив константу Михаэлиса (K_М), которая характеризует прочность связывания субстрата с ферментом, и максимальную скорость (V_max) превращения субстрата в продукт при определенных условиях, можно повысить общую каталитическую эффективность (V_max./K_M) реакции; V_max  равна полному количеству фермента (Е₀ ), умноженную на каталическую константу (k_cat).

•   Повысив стабильность белка в широком диапазоне температур или pH, можно использовать его в условиях, при которых исходный белок инактивируется.

•   Создав белки, способные функционировать в безводных растворителях, можно осуществлять каталитические реакции в нефизиологических условиях.

•   Изменив белок таким образом, чтобы он мог работать без кофактора, можно использовать его в некоторых непрерывных промышленных процессах.

•   Изменив активный центр фермента, можно повысить его специфичность и уменьшить число нежелательных побочных реакций,

•   Повысив устойчивость белка к клеточным протеазам, можно упростить процедуру его очистки и повысить выход продукта.

•   Изменив аллостерическую регуляцию фермента, можно уменьшить степень его ингиби-рования метаболитом по типу отрицательной обратной связи и увеличить выход продукта.
Направленный мутагенез и генная инженерия белков            159

Направленный мутагенез: методика

Получить новый белок с заранее заданными свойствами — непростая задача, но вполне реально изменить свойства уже существующего белка. Изменения можно вносить в сам белок или в его ген. Однако химическая модификация белков редко бывает строго специфичной и ее необходимо осуществлять заново для каждого белкового препарата, поэтому лучше вносить изменения в его клонированный ген. К сожалению, не всегда бывает известно, какую именно аминокислоту или последовательность аминокислот нужно изменить, чтобы получить белок с нужными физическими, кинетическими или химическими свойствами. Может случиться, что изменения должны затрагивать два или более аминокислотных остатка, расположенных далеко друг от друга в полипептидной цепи, но сближающихся в результате укладки белковой молекулы. Есть надежда, что уже в недалеком будущем с помощью компьютеров удастся предсказывать свойства того или иного белка, исходя из данных о его аминокислотной последовательности. Это значительно упростит процедуру создания нужных белков. Введение новой генетической информации в клонированные гены сейчас не составляет особого труда, однако чтобы определить, обладает ли искомый белок нужными свойствами, необходимо проанализировать множество белковых продуктов.

Внесение специфических изменений в коди-руюшие последовательности ДНК, приводящих к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется направленным мутагенезом. Идентификация аминокислот, замена которых даст желаемый результат, облегчается, если детально известна пространственная структура белка (ее устанавливают с помощью рентгеноструктурного анализа или других аналитических методов). Однако для большинства белков такие данные отсутствуют, поэтому направленный мутагенез — это в значительной мере эмпирическая процедура, основанная на методе проб и ошибок. Каждый белок, кодируемый мутантным геном, нужно протестировать и убедиться в том, что мутация дала желаемый эффект.

Для направленного мутагенеза клонированных генов используют разные экспериментальные подходы, В одних случаях вносят изменения в специфические сайты клонированного гена, в других случайным образом изменяют короткий фрагмент клонированного гена и среди образующихся мутантных белков выбирают один, обладающий необходимой активностью.

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ДНК фага M13

Олигонуклеотид-направленный (сайт-специфический) мутагенез — это один из наиболее простых методов внесения точковых мутаций в клонированный ген (рис. 8.1). Для его осуществления необходимо знать: 1) точную нуклеотидную последовательность той области ДНК, которая соответствует мРНК-кодону, подлежащему изменению; 2) характер аминокислотных замен. Обычно встраивают ген-мишень в двухцепочечную форму вектора на основе бактериофага M13. Сначала выделяют одноцепочечную форму вектора (плюс-цепь M13) и смешивают ее с синтетическим олигонуклеотидом, в точности комплементарным — за исключением одного нуклеотида -- нужному сегменту клонированного гена. Этот отличающийся (т. е. неспаривающийся) нуклеотид соответствует тому нуклеотиду кодона мРНК, который необходимо изменить. В случае, представленном на рис. 8.1, триплет АТТ, соответствующий изолейциновому кодону AUU, нужно заменить на триплет СТТ, соответствующий лейциновому кодону CUU. Олигонуклеотид будет гибридизоваться с комплементарным участком клонированного гена в том случае, если: 1) он добавлен в количестве, во много раз превышающем количество ДНК М13; 2) неспаривающийся нуклеотид находится примерно посередине олигонуклеотида; 3) отжиг проводят при низкой температуре и высокой ионной силе. 3'-конец спарившегося олигонуклеотида служит затравкой для инициации синтеза ДНК, а интактная цепь ДНК M13 — матрицей. Репликация осуществляется с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Escherichiacoliпри наличии в среде четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов« а присоединение последнего нуклеотида синтезированной цепи к 5'-концу затравки обеспечивает ДНК-лигаза фага Т4. Однако in vitro синтез ДНК редко идет до конца, и частично двухцепочечные молекулы приходится отделять от нормальных центрифугированием в градиенте сахарозы.

Полностью двухцепочечными молекулами ДНКфага М13, содержащими, однако, некомплементарные нуклеотиды, трансформируют клетки Е. coll. В последних образуются фаговые

160            ГЛАВА 8

Рис. 8.1. Олигонуклеотид-направленный мутагенез. Одноцепочечную ДНК фага М13 (плюс-цепь),   несущую   ген-мишень, отжигают с комплементарным      синтетическим олигонуклеотидом,  содержащим одно основание, не комплементарное соответствующему основанию исходной ДНК, Олигонуклеотид  служит   затравкой для синтеза ДНК, а М13-вектор с встроенным геном — матрицей. Репликацию катализирует фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E E. coli. Синтезированную  полноразмерную цепь замыкает в кольцо ДНК-лигаза Т4. Образовавшимися      двух цепочечными молекулами трансформируют E. coli. Часть фаговых частиц содержит ДНК дикого типа, часть — мутантную ДНК.

частицы, что в конечном счете приводит к лизису клеток и образованию бляшек. Поскольку репликация идет по полуконсервативному механизму, половина популяции образующихся фаговых частиц должна содержать ДНК дикого типа, а половина — мутантную ДНК со специфической нуклеотидной заменой. Частицы, содержащие только мутантный ген, идентифицируют при помощи ДНК-гибридизации в жестких условиях, используя в качестве зонда исходный олигонуклеотид. Мутантный ген вырезают и встраивают в какой-либо экспрессирующий Е. соli-вектор. Мутантный белок синтезируют в E. coli и очищают.

На самом деле число фаговых частиц, несущих мутантную ДНК, оказывается гораздо меньше ожидаемых 50%: лишь 1—5% бляшек содержат фаг с мутантным геном. Чтобы повысить выход мутантного фага, метод олигонуклеотиднаправленного мутагенеза модифицировали. Один из подходов состоял во введении М13-вектора, несущего ген, в который необходимо внести мутацию, в штамм E. coli, дефектный по двум ферментам метаболизма ДНК (рис. 8,2). Один фермент — это мутантная форма dUTP-пирофосфатазы (dut). Клетки с неактивной dUTP-пирофосфатазой характеризуются повышенным содержанием dUTP, что приводит к

Направленный мутагенез и генная инженерия белков           161
встраиванию в ДНК при репликации нескольких остатков dUTP вместо dTTP. Второй фермент – это дефектная урацил-К-гликозилаза (ung). В отсутствие функциональной урацил-М-гликозилазы остатки dUТР, случайно встроившиеся в ДНК, не могут быть удалены. В одноцепочечной ДНК M13, синтезированной в таких клетках Е. соli, примерно 1% тимидиновых остатков оказываются замененными уридиновыми. Олигонуклеотид с некомплементарным основанием отжигают с урацилсодержащей ДНК М13 и in vitro достраивают вторую

Рис. 8.2. Повышение выхода мутантного фага M13 путем трансформации штамма Е. coltdia ung. Ген-мишень встраивают в двух цепочечную репликативную форму ДНК фага MI3 и полученными молекулами трансформируют штамм Е. coli dut ung. Мутация dut вызывает повышение содержания dUTP в клетке, что приводит к включению в ДНК нескольких остатков dUTP (U). а мутация ung блокирует их удаление. Двухцепочечной ДНК М13, содержащей ген-мишень, трансформируют клетки E. coli дикого типа. Продукт гена ung дикого типа (урацил-N-гликозилаза) удаляет все остатки урацила из исходной цепи, и она деградирует. Мутантная цепь остается интактной, поскольку она не содержит остатков урацила. Эта цепь служит матрицей для репликации ДНК, и в результате доля фаговых частиц, несущих мутантный ген, увеличивается.

цепь. Двухцепочечной ДНК трансформируют штамм E. coli, содержащий функциональный ген ung. Активная урацил-N-гликозилаза хозяйских клеток удаляет остатки уридина из ДНК M13 (рис. 8.2), исходная матричная цепь М13 деградирует и далее реплицируется только мутантная цепь, не содержащая dUTP, В результате выход фаговых частиц, несущих мутантный ген, значительно увеличивается.

Олигонуклеотид-направлепный мутагенез с использованием плазмидной ДНК

Основной недостаток одигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием фага М13 — большое число процедур. Чтобы выделить мутантную форму нужного гена, приходится затратить много времени. В качестве альтернативы системе с использованием фага M13 было разработано множество других подходов, основанных на применении плазмидных ДНК. Это позволяет обойтись без переноса интересующего исследователя гена из плазмиды в фаговую ДНК, а после завершения мутагенеза — обратно в плазмиду. Один из этих подходов включает встраивание ДНК в плазмидный вектор, который несет функциональный ген устойчивости к тетрациклину и неактивный ген устойчивости к ампициллину; в середине последнего заменен один нуклеотид (рис. 8.3). Клетки E. coli трансформируют вектором, несущим ДНК-мишень, и двухцепочечную плазмидную ДНК денатурируют щелочью с тем, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с тремя разными олигонуклеоти-

162             ГЛАВА 8]
дами. Один из них предназначен для внесения изменений в клонированную ДНК-мишень, второй — для устранения мутации в гене устойчивости к ампициллину, третий — для замены одного нуклеотида в гене устойчивости к тетрациклину с тем, чтобы инактивировать этот ген. В реакционную смесь добавляют четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата и ДНК-полимеразу Т4, функционирующую аналогично фрагменту Кле-нова ДHК-полимеразы I Е. coli. Гибридизовавшиеся олигонуклеотиды служат затравками для синтеза ДНК, а интактная кольцевая молекула

Рис, 8.3. Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК. Ген-мишень встраивают в полилинкер вектора pALTER. Плазмидную ДНК денатурируют в щелочи и отжигают с тремя олигонуклеотидами: «мутагенным» олигонуклеотидом, олигонуклеотидом,    восстанавливающим устойчивость к ампициллину (Ampr), и олигонуклеотидом, придающим чувствительность к тетрациклину (Tets). Эти олигонуклеотиды  служат затравками для синтеза ДНК с помощью ДНК-полимеразы Т4, а исходная цепь — матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной    цепи    зашиваются ДНК-лигазой Т4. Продуктами реакции трансформируют клетки E. coli и отбирают трансформантов Аmрг и TetS.

Направленный мутагенез и генная инженерия белков            163
ДНК — матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются с помощью ДНК-лигазы Т4. По окончании синтеза и лигирования продуктами реакции трансформируют клетки E. coli. Трансформантов отбирают по признаку устойчивости к ампициллину и чувствительности к тетрациклину. Примерно 90% из них содержат специфическую мутацию в клонированном гене. У остальных трансформантов клонированный ген не был изменен либо потому, что олигонуклеотид не гибридизовался с ним, либо потому, что он вытеснялся в ходе синтеза ДНК. Клетки, несущие мутантный клонированный ген, идентифицируют с помощью гибридизации. Все плазмиды, штаммы, ферменты, олигонуклеотиды (кроме того, который предназначен для изменения клонированного гена), а также буферы продаются в наборе, что облегчает работу.

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации

Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, -сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР), Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 8.4) и помешают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР: 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 — в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров l и 2 в одной пробирке и 3 и 4 — в другой таково, что ΠЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевых молекул с двумя одноцепочечными разрывами. Эти разрывы репарируются in vivo после трансформации E. coli. При ренатурации одиночных цепей из одной пробирки образуются линейные молекулы. В клетках E. coti стабильно поддерживаются в виде плазмид и наследуются только кольцевые, а не линейные молекулы, при этом все они несут сайт-специфическую мутацию. Таким образом, с помощью описанного метода можно вносить точковые мутации в клонированный ген, при этом отпадает необходимость во встраивании гена в ДНК фага M13, использовании мутантных штаммов Е. coli типа dut ung и в переносе мутантного гена из М13-вектора в экспрессирующий вектор.

Случайный мутагенез с использованием «вырожденных» олигонукмотидных праймеров

К сожалению, обычно бывает неизвестно, какую нуклеотидную замену в клонированном гене нужно произвести, чтобы получить белок с нужными свойствами. Поэтому часто приходится изменять один определенный нуклеотидный сайт всеми возможными способами. Например, можно синтезировать олигонуклеотидные праймеры, в одном из сайтов которых находятся разные нуклеотиды. Такие «вырожденные» олигонуклеотиды обычно получают, добавляя в автоматический синтезатор ДНК на определенном этапе, когда к цепи должен просоединяться специфический нуклеотид, небольшое количество (до нескольких процентов) трех других нуклеотидов (рис. 8.5). В результате получается гетерогенный по одному сайту набор олигонуклеотидных праймеров, с помощью которых можно получить соответствующий набор мутантных генов-мишеней с нуклеотидными заменами в специфическом сайте.

Этот подход имеет два преимущества: 1) не нужно в точности знать, какую роль играет тот или иной аминокислотный остаток в функционировании белка: 2) поскольку в данном сайте происходят разные аминокислотные замены, могут случайно синтезироваться белки с разнообразными интересными и полезными свойствами. Конечно, если ни один из образующихся белков не обладает нужными свойствами, приходится все начинать сначала, синтезировав новый набор "вырожденных" праймеров, комплементарных другой области гена.

164             ГЛАВА 8

Рис. 8.4. Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР. Реакцию проводят в двух пробирках, в каждой из которых содержится одинаковая двухце π очечная плазмидная ДНК, но разные наборы праймеров. Πраймеры 1 и 3 содержат один неспаривающийся нуклеотид и комплементарны разным цепям плазмидной ДНК. Праймеры 2 и 4 полностью комплементарны соответствующим участкам плазмидной ДНК и тоже гибридизуются с разными цепями. Положение сайтов гибридизации для праймеров каждой пары различается, но их концы стыкуются. В результате ПЦР-амплификации образуются линейные молекулы. По окончании реакции содержимое пробирок смешивают и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. В результате кроме двух исходных линейных амплифицированных молекул образуются две кольцевые плазмидные ДНК, каждая с двумя одноцепочечными разрывами. После трансформации кольцевыми молекулами клеток Е. coliразрывы репарируются ферментами клетки-хозяина, и плазмида может реплицироваться независимо. Линейные молекулы ДН К в E. coli не сохраняются.