К онтроль качества клинических лабораторных исследований. Внутрилабораторный контроль качества клинических лабораторных исследований. Построение контрольных карт. Критерии оценки контрольной карты. Правила Вестгарда
 Скачать 2.79 Mb.
|
|
3. Ситуационная задача. Больная 25 лет поступила в клинику с диагнозом «пневмония». Анализ крови: эритроциты – 3,9 × 1012/л, Нb – 118 г/л, лейкоциты – 23 × 109/л, метамиелоциты –8%, палочкоядерные нейтрофилы – 13%, сегментоядерные нейтрофилы – 53%,моноциты – 8%, лимфоциты – 18%; большинство нейтрофильных гранулоцитов содержит грубую токсигенную зернистость в цитоплазме. СОЭ – 26 мм/ч. Вопрос: Результаты анализа крови: Предполагаемый ответ: соответствуют норме; изменения носят функциональный характер; свидетельствуют о выраженной эндогенной интоксикации; свидетельствуют о вероятной паразитарной инвазии; свидетельствуют в пользу миелопролиферативного процесса Билет 14 1) Методы биохимических исследований: принципы, основное используемое оборудование. Основные приемы количественного анализа. Весы и правила взвешивания. Растворы. Понятие о концентрации растворов. Унифицированные методы исследования в биохимической лаборатории Фотометрические методы исследования В клинико-диагностических лабораториях для исследования состава и свойств биологических жидкостей широко используются фотоэлектроколориметры, фотометры, спектрофотометры, нефелометры, флуориметры, рефрактометры, хемилюминометры. Эти приборы и построенные на их основе анализаторы образуют класс фотометрических приборов. Своим названием этот класс приборов обязан фотометрическому принципу детектирования результата: измерение энергии светового потока с помощью фотодетекторов, преобразующих световую энергию в электрический сигнал. Фотометрические методы исследования базируются на способности растворов поглощать, отражать или рассеивать электромагнитное излучение. Жидкие среды могут даже излучать электромагнитную энергию под воздействием световой энергии возбуждения ии в результате химической реакции. Абсорбционный метод анализа На абсорбционном методе анализа основан принцип действия самых распространенных фотометрических приборов для лабораторных исследований – спектрофотометров и фотоколориметров. Фотоколориметры предназначены для определения количества окрашенного вещества путем измерения величины поглощения и пропускания в видимой части электромагнитного спектра. Принцип работы колориметра Источником света для видимого участка спектра служит вольфрамовая лампа накаливания, которая формирует световой поток. Диафрагма из светового потока вырезает узкий луч, создавая как бы «точечный» источник света. Оптическая система формирует параллельный поток световой энергии, который проходит через полосовой фильтр. Фильтр пропускает световой поток с максимальной длиной волны в диапазоне длин волн. Площадь и форма пятна, образуемого световым потоком на чувствительной площадке детектора-фотоприемника, остается постоянной. Она не зависит в заданных пределах от объема раствора в кювете и смены кюветы в кюветном отделении. Фотоприемник трансформирует световую энергию в электрическую. Аналоговый сигнал в виде тока преобразуется аналого-цифровым преобразователем в цифровую форму. Микро-ЭВМ пересчитывает цифровой сигнал, принятый с преобразователя, в единицы измеряемых параметров. Основное назначение абсорбциометрических приборов – определение концентрации растворов с исследуемым веществом посредством сравнения величин поглощения или пропускания световой энергии исследуемого раствора и раствора известной концентрации. В настоящее время в КДЛ можно встретить большое разнообразие по конструкции и характеристикам колориметров, фотометров, спектрофотометров. Приборы могут отличаться: 1) по форме представления информации (в единицах оптической плотности, в единицах концентрации, в единицах светопропускания или в любых других значениях, по которым была произведена калибровка; 2) по способу подачи в прибор исследуемого раствора (проточная кювета, коммутируемая кювета, 96-луночный планшет и т. д.; 3) по способу построения и хранения калибровочных значений (ручное, автоматическое, длительное или краткосрочное); 4) по виду источника излучения световой энергии (разнообразные лампы накаливания: вольфрамовые, импульсные, газоразрядные, светодиоды, лазеры); 5) по конструкции оптической системы (одноканальные и многоканальные). Фотометры (колориметры) работают в спектральном диапазоне 340–700 нанометров (нм). Диапазон работы спектрофотометров значительно шире – 200–950 нм. Многие современные приборы имеют процессоры, запоминающие устройства, которые позволяют автоматизировать процесс построения градуировочных характеристик самих приборов. Современные динамометрические приборы могут работать с минимальными объемами раствора в диапазоне 10-500 мкл. Нефелометрический метод анализа Этот вид исследования проводится в дисперсных средах с целью определения концентрации, размера и формы диспергированных частиц. Аппаратура для нефелометрических исследований представляет собой специализированные спектрофотометры, которые называются нефелометрами. Они предназначены для измерения интенсивности рассеянного света под углом к направлению падающего на раствор светового потока. Длины волн, используемые в большинстве нефелометров, находятся в диапазоне 340–650 нм. Системы «антиген – антитело» содержат гетерогенные популяции частиц с размерами от 250 до 1500 нм, а используемые в аппаратуре длины волн – величины того же порядка, что и размеры исследуемых частиц. Поэтому большая часть света будет рассеиваться под углом 90°. Хотя для измерения рассеивания света датчики установлены под углом от 5 до 90°, наилучшие характеристики по чувствительности будут достигнуты, если измерять интенсивность света, рассеянного под углом 90°. Турбидиметрический метод анализа Данный вид исследования мутных сред основан на измерении изменения интенсивности потока световой энергии, прошедшего через дисперсную систему. Изменение потока световой энергии вызвано как поглощением, так и его рассеянием дисперсной системой. Преимущество турбидиметрического анализа заключается в том, что измерения могут быть выполнены практически на любом колориметре или фотометре. Повышение чувствительности турбидиметрических исследований может быть достигнуто за счет использования спектрофотометров с высококачественными детекторами. Флуориметрический метод анализа Этот метод основан на явлении, которое называется флуоресценцией. Световая энергия, поглощенная атомами или молекулами, отдается ими в виде светового же излучения. Спектр излучения флуоресценции многих веществ носит избирательный характер. Он не зависит от длины волны возбуждающего света. Это показывает, что спектр флуоресценции характеризует исследуемое вещество и является основой для обнаружения и идентификации этих веществ. Существуют многочисленные физико-химические факторы отклонения от пропорциональности энергии поглощения и энергии флуоресценции от концентрации исследуемого раствора. При практических определениях концентрации раствора по световой энергии требуется предварительное построение градуировочных кривых. Градуировочная кривая строится по результатам измерений флуоресценции растворов с известной концентрацией. Флуоресцентные методы анализа, по сравнению с другими фотометрическими методами, обладают высокой чувствительностью. Для измерения оптического пропускания и флуоресценции предназначены приборы флуориметры. Рефректометрический метод анализа Количественное определение содержания веществ на твердофазных носителях реактивов условно называется системами сухой химии. Измеряется интенсивность светового потока, отраженного от окрашенной поверхности носителя, которая зависит от концентрации исследуемой жидкой пробы. Определение изменения цвета окрашенной поверхности производится методом рефректометрии. В качестве носителя сухих реагентов выступают реагентные полоски. Они наиболее широко используются для экспресс-анализа мочи и крови. Сейчас на современном рынке лабораторных приборов представлена целая гамма принципиально новых клинических автоматических анализаторов сухой химии, которые работают без использования традиционных жидких реагентов. Хемилюминесцентный анализ Это один из люминесцентных методов анализа. Принцип метода состоит в том, что при реакции окисления происходит возбуждение молекул продуктов реакции и выделение световой энергии при возвращении их в основное состояние. Частный случай хемилюминесценции – биолюминесценция. При биолюминесценции выделение световой энергии излучения происходит в результате окислительного процесса, который катализируется ферментами-люциферазами. Поскольку ферменты чрезвычайно избирательны, то биолюминесцентные методы очень специфичны. Приборы, на которых производят хемилюминесцентный анализ, называются люминометрами. В зависимости от того, каким путем решается эта задача, выделяют несколько методов количественного анализа. Весовой анализ (гравиметрия) – базируется на точном взвешивании. Объемный анализ (титрование) – базируется на точном измерении объемов. Техника взвешивания. В клинико-диагностических лабораториях взвешивание проводят на аналитических весах, предназначенных для определения массы тел с высокой точностью. Работают с образцами небольших объёмов. Весы позволяют определять массу порошков, жидкостей, твёрдых тел, а также небольших по размерам животных. Высокая дискретность (точность) аналитических весов в 0,01 мг достигается за счёт использования технологического решения – электромагнитной компенсации, благодаря чему происходит мгновенный отклик на изменения массы. Точность измерений также обеспечивают ветрозащитные экраны с автоматизированным или ручным приводом, а заряды статического электричества нейтрализуются встроенным либо устанавливаемым дополнительно ионизатором. Устройства имеют двунаправленные интерфейсы, что позволяет подключать компьютер, принтер, сохранять данные на флеш-карты. Калибровка аналитических весов может проводиться несколькими способами. Во многих моделях предусмотрен механизм автоматической калибровки при помощи встроенных гирь. Также возможна ручная внешняя калибровка – для этого дополнительно приобретаются эталонные гири. Калибровка необходима при каждом перемещении устройств с места на место, при изменении температуры окружающей среды, толчках, ударах, вибрации и т. д. Техника приготовления растворов. Химические реактивы выпускаются промышленностью с различной степенью очистки. В клинических лабораториях находят применение реактивы, в основном, следующих четырех типов квалификации чистоты: Технический – на этикетке обозначается буквой «Т», содержит значительное количество примесей, для выполнения анализов непригоден. Используется только для подсобных целей. Например, техническая серная кислота применяется для приготовления хромовой смеси. Чистый – имеет до 0,1% примесей, на этикетке обозначается буквой «Ч». Чистый для анализа – содержание примесей не превышает 0,07%. На этикетке обозначается буквами «ЧДА». Химически чистый – содержит примеси не более 0,03%. На этикетке обозначается буквами «ХЧ». Последние три типа чистых реактивов используются непосредственно для проведения биохимического анализа. Растворители следует применять только чистые независимо от того, какие по точности готовят растворы. Если растворителем служит вода, то можно применять только дистиллированную или деионизированную воду, в отдельных случаях бидистиллят. Лабораторная посуда должна быть чистой. Предварительно подготавливают соответствующей емкости посуду, в которой будут готовить и хранить получаемый раствор. Если нужно приготовить 1 л раствора, то для растворения следует взять посуду емкостью не больше 1,5 л. Если готовят 10 л раствора, то бутыль должна быть емкостью не больше 12-13 л. При особо точных и ответственных анализах следует обязательно принимать во внимание возможность выщелачивания стекла и применять, если это допустимо, кварцевую посуду или такую, стекло которой не содержало бы искомый элемент. Так, неизбежна ошибка при определении алюминия, свинца и некоторых других элементов в посуде из стекла, содержащего эти элементы. Вся посуда, контактировавшая с кровью, подвергается очистке от остатков материала и дезинфицируется в соответствии с действующими правилами санэпидрежима. Обычно хорошая очистка достигается уже после замачивания посуды в моющем комплексном растворе. Затем посуда промывается проточной водой и ополаскивается дистиллированной водой. С хорошо вымытой посуды вода стекает струйками, не задерживаясь в виде капель. После сушки она абсолютно прозрачная и не имеет подтеков. Высушивают посуду в сухожаровых шкафах. Можно сушить и на любых приспособлениях, где обеспечивается свободный отток воды с посуды. В лабораториях удобно пользоваться посудомоечными машинами, в которых используется ультразвуковая очистка поверхностей. Если в загрязненной посуде был или мог быть инфицированный биологический материал, она перед тем, как закладываться в моечную машину, должна быть стерилизована согласно санитарным правилам работы с соответствующим материалом. Лабораторная посудомоечная машина имеет ванну с крышкой, обычно объемом 3-10 л, в которую заливают моечный раствор и кладут посуду, она обрабатывается ультразвуком при температуре до 60°С, после чего промывается чистой водой. При работе на современных лабораторных анализаторах используется разовые пробирки, мытье которых не предусматривается. Они дезинфицируются и уничтожаются согласно действующим санитарным нормам, как правило, специализированными компаниями по прописанной технологии. Растворы щелочные нельзя оставлять надолго в фарфоровой и особенно в стеклянной посуде. Если приходится их оставлять, то необходимо вначале нейтрализовать растворы, потом немного подкислить и хранить только подкисленные растворы. Скорость растворения твердого вещества зависит от размера его частиц. Чем крупнее частицы, тем медленнее идет растворение. Поэтому перед растворением твердого вещества его следует измельчить и отвешивать для растворения только измельченное вещество. Сказанное не относится к гигроскопичным веществам, так как последние в измельченном виде очень легко поглощают влагу из воздуха вследствие большого увеличения поверхности. Поэтому гигроскопичные вещества растворяют, не измельчая, разве только быстро разбив большие куски. 2) Иммуноглобулины. Классификация, структура и функции, гетерогенность иммуноглобулинов, биологическая активность антител разных классов и субклассов. Биосинтез и метаболизм иммуноглобулинов. АНТИТЕЛА — это белки (точнее гликопротеины), которые синтезируются под влиянием антигенов и специфически с ними реагируют. Это белки гаммаглобулиновой фракции, поэтому их называют ИММУНОГЛОБУЛИНАМИ (иммунными глобулинами). Иммуноглобулины обозначаются символом Ig. Синтезируются они В-лимфоцитами, а более точно - ПЛАЗМАТИЧЕСКИМИ КЛЕТКАМИ и содержатся в большом количестве в сыворотке, в межклеточной жидкости и других секретах, обеспечивая гуморальный ответ. Одновременно определенная, но небольшая часть Ig фиксируется на поверхности мембран макрофагов и лимфоцитов, функционируя в качестве рецепторов к антигенам и участвуя, таким образом, не только в гуморальном, но и клеточном иммунном ответе. На В-лимфоцитах Ig встроены в цитоплазматическую мембрану и являются антигенспецифическим рецептором. В данном случае это мембранная форма иммуноглобулина СТРУКТУРА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ. Смотрите Nсхему на титульном листе. Молекула Ig состоит из двух тяжелых полипептидных цепей, называемых Н-цепями (от англ. heavy – тяжелый) и из двух легких, называемых L-цепями (от англ. light – легкий). С помощью физико-химических и иммунологических методов доказано существование 5 классов Ig с молекулярной массой от 150 000 до 900 000 Д, обозначаемых Ig A, Ig M, Ig G, Ig E, Ig D. Принадлежность иммуноглобулинов к определенному классу определяется типом тяжелых цепей. У IgA тяжелые цепи α(альфа), IgM – μ(мю), IgG – γ(гамма), IgE – ε(эпсилон), IgD – δ(дельта). У всех иммуноглобулинов легкие цепи могут быть или обе λ (лямбда), или обе κ (каппа). Антитела против одного и того же антигена могут быть представлены разными классами Ig. При этом выявлена такая закономерность: первыми после иммунизации появляются антитела класса М, затем класса G, и последними иммуноглобулины А и Е. Таким образом, если у человека определяются антитела (к какому-либо инфекционному агенту) класса М, то это свидетельствует о недавнем его инфицировании. Вот почему определение антител классов М и G к одному и тому же возбудителю играет важную диагностическую роль (как к ВИЧ, так и к возбудителю токсоплазмоза, ЦМВ и многим другим патогенам). Структура молекулы IgG. Четыре цепи между собой связаны дисульфидными связями. Место вращения в тяжелой цепи называют шарнирной областью (участком). Каждая из легких и тяжелых цепей состоит из вариабельной (VL, VH) и константной (CH,CL) частей (см. рис на титульном листе). Вариабельные участки в цепях начинаются от N (концевого участка) и состоят приблизительно из 110 аминокислот. Константный участок Н-цепи в 3 раза длиннее вариабельного и состоит из 3 гомологичных областей, L-цепи – из одной, каждая из которых содержит 3 110 аминокислот. Эти гомологичные участки, длиной 110 аминокислот, свернуты в глобулы и называются доменами. ò ДОМЕНЫ — это фрагменты цепей Ig, стабилизированные дисульфидными мостиками, состоящие приблизительно из 110 аминокислот (мол. масса 12500). Вторичная структура доменов представляет собой «клубки» (глобулы). В молекуле Ig G имеется 12 доменов, по 4 на тяжелых цепях и по 2 на легких. Домены, состоящие из вариабельных участков легких и тяжелых цепей, обозначаются соответственно VL и VH. На константных участках легких цепей имеется по одному домену CL, на тяжелых цепях три константных домена, которые обозначаются CH 1, CH 2, CH 3. Важно отметить, что в области СН 2 домена располагается центр связывания комплемента, что и обуславливает активацию системы комплемента некоторыми классами иммуноглобулинов. В молекуле Ig выделяют три фрагмента: два из них идентичны и обладают способностью соединяться с антигеном (точнее с антигенной детерминантой). Поэтому их назвали Fabфрагментами (fragment antigen binding - фрагмент антигенсвязывающий). Третий фрагмент может кристаллизоваться, и в связи с этим его обозначили как Fc-фрагмент (fragment crystallizable). В Fab-фрагментах располагаются активные центры антител (смотри ниже), а вот своим единственным, образованным тяжелыми цепями, Fc-фрагментом антитело связывается с клеточными Fc-рецепторами (FcR), которые находятся на поверхности ряда клеток (макрофагов, моноцитов, лимфоцитов, базофилов и др.). Во всех V-областях иммуно-глобулинов имеются ГИПЕР-ВАРИАБЕЛЬНЫЕ УЧАСТКИ с высокой степенью изменчивости аминокислотного состава. На Н-цепи четыре таких участка, а на L-цепи — три. АКТИВНЫЙ ЦЕНТР иммуноглобулина (синоним: паратоп) представляет собой пространство между VH и VL участками и расположен в Fab. Активным центром антител или антидетерминантой, именуют участок молекулы антитела, являющийся структурой, комплементарной (специфичной) детерминантой группе антигена. Именно активными центрами Ig связываются с антигеном. Активный центр антител обладает функциональной автономией, т.е. способен связывать антигенную детерминанту в изолированном виде. Иногда антигенсвязывающие центры молекулы антитела могут связываться с несколькими различными антигенными детерминантами (обычно эти антигенные детерминанты очень схожи). Такие антитела называют ПЕРЕКРЕСТНО-РЕАГИРУЮЩИМИ, способными к полиспецифическому связыванию. СПЕЦИФИЧНОСТЬ антител — это способность Ig реагировать только с определенным антигеном. Феномен специфичности основан на наличии активных центров в молекуле антител, вступающих в контакт с соответствующими детерминантами антигена. ВАЛЕНТНОСТЬ антител — это количество активных центров в молекуле антитела. Валентность Ig G равна двум. Валентность Ig M -.....? (Вспомните, сколько активных центров в молекуле Ig M. Строение IgМ смотри ниже.). АВИДНОСТЬ антител - это способность антител образовывать прочные соединения с антигеном. А степень этой прочности, т.е. степень прочности связывания антител с антигеном называется АФФИННОСТЬЮ антител. (Она определяется степенью комплементарности активного центра антигенной детерминанте антигена.) Ig G составляют 70% всех иммуноглобулинов человека. По строению - мономеры. Структура подробно описана выше. Появляются они на более поздних сроках после первичной антигенной стимуляции, при вторичном иммунном ответе это основной класс продуцируемых антител. Находятся они как в крови, так и вне сосудов. Ig G – единственный, кто активно транспортируется через плаценту и играет важную роль в защите новорожденного от инфекции в первые месяцы жизни. Он является активатором системы комплемента. Валентность его равна 2. У человека различают в сыворотке крови 4 субкласса (подкласса) IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), которые различаются по строению тяжелых цепей (γ1, γ2, γ3, γ4) и некоторыми функциями. Концентрация в сыворотке от 7,0 до 22 г/л. Ig М в сыворотке крови представлен в виде пентамера. (См. рис. на с. 8). В молекуле IgM пять структурных молекул (подобных IgG) расположены радиально. Fc-фрагменты направлены в центр, где соединены J-цепью (от англ. joining – соединение), а Fab-фрагменты - наружу. Тяжелые (Н) цепи состоят из 5 доменов, так как содержат 4 константных домена. Ig M обладает высокой комплементсвязывающей активностью, так как имеет пять центров активации комплемента в СН2 доменах. Синтезируется в основном при первичном иммунном ответе и преимущественно содержится Мембрана клетки FcR 4 во внутрисосудистом русле. Количество Ig M в сыворотке крови здоровых составляет 0,48 - 2,0 г/л., т.е. около 10% от общего количества Ig. Концентрация IgM в сыворотке крови у пожилых несколько снижается (подумайте почему?). Ig A составляет 10 — 15% от всех иммуноглобулинов сыворотки крови. Не обладает способностью активировать комплемент. Большая часть сывороточных Ig A (80%) имеет мономерную структуру. Имеется два субкласса (IgA1, IgA2). Менее 20% Ig A в сыворотке представлено димерными молекулами. Концентрация Ig А в сыворотке крови взрослого 0,7 – 5,0 г/л. Ig A синтезируется плазматическими клетками, находящимися преимущественно в подслизистых тканях, на слизистой эпителиальной поверхности дыхательных путей, урогенитального и кишечного тракта, почти во всех экскреторных железах. Часть Ig А попадает в общую циркуляцию, но большая его часть секретируется местно на слизистых оболочках в виде sIgA и служит местным защитным иммунологическим барьером слизистых. Сывороточный IgA и sIgA это различные иммуноглобулины! SIgA нет в сыворотке крови. FВ секретах слизистых и желез (молозиво, женское молоко, слюна, секреты кишечника, бронхиального дерева и др.) содержится секреторный Ig A (sIg A) в наибольших концентрациях. Он состоит из двух мономеров IgA, соединенных j-цепью и молекулы секреторного компонента. (См. рис. ниже). Последний предохраняет иммуноглобулин от разрушающего действия различных ферментов, секретов слизистых оболочек. Секреторный компонент синтезируется в эпителиальных клетках слизистых. sIg А играет особую роль в обеспечении местной защиты от инфекций бактериальной природы. Он препятствует внедрению бактерий в эпителиальные клетки слизистых путем ингибиции прикрепления микробов к слизистым оболочкам, их роста, ферментативной активности, блокирования антигенных компонентов. Дети рождаются без IgA и получают его с молоком матери. Достоверно показано, что дети, находящиеся на естественном вскармливании, значительно реже болеют кишечными инфекциями и заболеваниями дыхательных путей по сравнению с детьми, получающими искусственное питание. Дефицит IgA встречается у одного больного на 700 здоровых лиц. У лиц с иммунодефицитом IgA отмечается склонность к аутоиммунным заболеваниям инфекциям дыхательных путей, гайморовых и лобных пазух, кишечным расстройствам. 5 Ig E содержится в сыворотке в очень небольшом количестве. Ig E не активирует систему комплемента. Его особенность состоит в том, что он СПОСОБЕН ФИКСИРОВАТЬСЯ НА БАЗОФИЛАХ И ТУЧНЫХ КЛЕТКАХ, что объясняется наличием в большом количестве на указанных клеткахù рецепторов к Fc-фрагментам Ig E (см. рис. на стр. 6). При последующем соединении фиксированных на тучных клетках или базофилах Ig E с антигеном возникает дегрануляция этих клеток с высвобождением гистамина. Ig E называют цитофильным иммуноглобулином, или РЕАГИНОМ за способность фиксироваться на названных клетках. Он играет ведущую роль в патогенезе ал-лергических заболеваний (1 тип) и в противогельминтном иммунитете. Концентра-ция в сыворотке здоровых людей 0,000014 – 0,00045 г/л. Сравните с другими Ig. Ig D обнаруживается в сыворотке в малых количествах (0,02 - 0,04 г/л) и его роль как сывороточного иммуноглобулина не совсем ясна. Как рецепторный, Ig D находится на В-лимфоцитах, причем он появляется на мембране относительно зрелых клеток, поэтому его наличие является свидетельством зрелости В-лимфоцитов. Иммуноглобулины различных классов и подклассов называют ИЗОТИПАМИ. Всего известно 9 изотипов (G1,G2,G3,G4, A1,A2, M, E, D), отличающихся друг от друга по строению тяжелых цепей. При сравнении антител, относящихся к одному изотипу, но образовавшихся в ответ на различные антигены, также выявляются различия. Эти различия касаются активных центров антител, сформированных VH и VL доменами, то есть строение вариабельных доменов у иммуноглобулинов одного и того же изотипа различное, и характерно только для данной молекулы. Особенности иммуноглобулинов по вариабельным доменам называют ИДИОТИПОМ. АЛЛОТИПЫ — это антигенные детерминанты, по которым молекулы иммуноглобулинов одних индивидуумов отличаются от молекул антител других индивидуумов данного вида. Иммуноглобулины синтезируются четырьмя типами клеток В-ряда, различаемыми морфологически. В-лимфоцит — непролиферирующая клетка, которая синтезирует иммуноглобулины и экспрессирует их на поверхности мембраны, где они играют роль специфических рецепторов. Плазматические и лимфоплазмоцитоидные клетки представляют собой конечный этап дифференцировки В-лимфоцита. Эти клетки не делятся и секретируют большое количество иммуноглобулинов. Непосредственными предшественниками плазматических клеток являются плазмобласты (иммунобласты). Они образуются на этапе антигензависимой дифференцировки В-лимфоцита или В-клетки памяти, сохраняют способность к делению и детерминированы к превращению в плазмоцит. Таким образом, они обеспечивают увеличение клона в процессе иммунного ответа на антиген. Количество продуцируемых ими иммуноглобулинов зависит от клеточного окружения и регуляторных взаимодействий. Наконец, В-бласт — это клетка, которая также появляется из клонированного В-лимфоцита в процессе иммунного ответа на антигенную стимуляцию. В отличие от плазмобласта эта клетка сохраняет способность превращаться, помимо плазмоцита, в В-клетку памяти. В онтогенезе в результате многоэтапной антигеннезависимой дифференцировки стволовой кроветворной клетки образуется клонированный В-лимфоцит, т. е. клетка, несущая на своей поверхности иммуноглобулиновые рецепторы определенной специфичности, благодаря которым она способна реагировать на воздействие антигена. Сначала клеткой экспрессируются рецепторы IgM (sIgM), а на более поздней стадии дифференцировки (после этапа негативной селекции на аутоантигены) образовавшиеся зрелые В-лимфоциты приобретают дополнительно IgD-рецепторы (sIgD). Важно отметить, что с момента клонирования данный В-лимфоцит и все его потомки (т. е. собственно клон) будут синтезировать иммуноглобулины, характеризующиеся одним и тем же идиотипом (строение и специфичность активного центра) и типом L-цепей. Связанные с мембраной иммуноглобулины отличаются по структуре от секретируемых иммуноглобулинов. Так, мембранный IgM является мономером, а не пентамером, как сывороточный IgM. Кроме того, Н-цепи slg имеют в С-концевой части дополнительный участок, играющий роль якоря и отсутствующий у сывороточных иммуноглобулинов соответствующего класса. Около 90 % синтезируемого В-лимфоцитами иммуноглобулина связано с мембраной. Только очень небольшое количество IgM секретируется в виде мономера. Вероятно, происходит не активная секреция, а спонтанное отщепление мембранного IgM в результате ограниченного протеолитического процесса на клеточной поверхности. Таким образом, зрелые В-лимфоциты являются иммуноглобулинсинтезирующей, но не секретирующей клеточной формой. Взаимодействие мембранных иммуноглобулиновых рецепторов с родственным антигеном включает антигензависимый этап дифференцировки В-лимфоцита, конечной формой которого является плазматическая клетка. Она практически не имеет поверхностных иммуноглобулиновых рецепторов, не способна к делению, живет всего 2—3 дня, зато характеризуется развитой цитоплазмой и выраженной эндоплазма-тической сетью. Ее функции — синтез и секреция иммуноглобулинов. Скорость синтеза в каждой плазматической клетке достигает 2000 молекул в секунду. Отдельная плазматическая клетка синтезирует целую молекулу иммуноглобулина — Н- и L-цепи, а в случае полимерных форм иммуноглобулинов — также и J-цепь. В каждый данный момент одна клетка синтезирует иммуноглобулин только одного класса и одного типа; обнаружение клетки, секретирующей сразу два класса иммуноглобулинов, является редкостью и связано с моментом переключения изотипов. Кроме того, клетка функционирует по принципу одна клетка — одно антитело. Следовательно, специфичность секретируемых антител, т. е. структура VH- и VL-участков, остается всегда той же, что и структура V-областей мембранного иммуноглобулина-рецептора. Синтез иммуноглобулинов в плазматических клетках происходит на полирибосомах зернистой эндоплазматической сети, причем Н- и L-цепи синтезируются отдельно. Сборка молекулы происходит в цистернах эндоплазматической сети и занимает 20— 30 мин. В это время отдельные цепи собираются в молекулы, формируются дисульфидные связи, под действием ферментов присоединяются сахара, образуются полисахаридные группы иммуноглобулинов. Затем в результате экзоцитоза происходит секреция готовых молекул. Процесс сборки может проходить несколькими путями. Например, сначала может образоваться димер Н-цепей Н2, к которому последовательно присоединяются две L-цепи; либо образуются две полумолекулы HL, которые, объединяясь попарно, формируют полную мономерную молекулу. Все эти промежуточные структуры обнаружены при изучении миеломных и IgG-продуцирующих лимфоидных клеток мыши. Кроме того, установлено, что клетки как мышиной, так и человеческой миеломы часто синтезируют значительно большее количество L-цепей, чем Н-цепей. В таких случаях клетка секретирует как целые молекулы иммуноглобулина, так и свободные L-цепи, чаще всего в виде мономеров и димеров. При изучении клеточных линий с блоком сборки и секреции Н- и L-цепей обнаружено, что при невозможности формирования полноценной молекулы секреция Н-цепей прекращается. Интересно, что в миеломных клеточных линиях происходит постепенное накопление спонтанных мутаций, сопровождающихся потерей способности клетки продуцировать Н-цепи. Можно предположить, что клон, секретирующий только L-цепи, является результатом повторной мутации опухолевой клетки, синтезировавшей полный иммуноглобулин. Вторая мутация сопровождается потерей способности клетки к синтезу Н-цепей. |