|
биология. EKZAMEN_BIO (Восстановлен). Краткий обзор 1) единство химического состава, 2) обмен веществ, 3) самовоспроизведение (репродукция), 4) наследственность
Вопрос №116
Дифференциальное окрашивание хромосом
Краткий обзор:
Дифференциальное окрашивание хромосом- это комплекс методов окраски хромосомных препаратов, позволяющих на основе неодинакового сродства к красителям гетеро- и эухроматина, участков ДНК с различным АТ/ГЦ-соотношением и других особенностей выявлять специфическую продольную структурированность отдельных хромосом, что позволяет точно идентифицировать отдельные элементы кариотипа
Методы дифференциального окрашивания делятся на две группы:
1) приводящие к образованию сегментов вдоль длины всех хромосом (например Q-, G- или R-сегменты);
2) приводящие к окрашиванию специфических хромосомных структур, в результате чего выявляется ограниченное число сегментов (С-, Т-)
Основная часть:
Дифференциальное окрашивание хромосом- это комплекс методов окраски хромосомных препаратов, позволяющих на основе неодинакового сродства к красителям гетеро- и эухроматина, участков ДНК с различным АТ/ГЦ-соотношением и других особенностей выявлять специфическую продольную структурированность отдельных хромосом, что позволяет точно идентифицировать отдельные элементы кариотипа.
Разработан ряд методов окрашивания (бэндинга), позволяющих выявить комплекс поперечных меток (полос, бэндов) на хромосоме. Каждая хромосома характеризуется специфическим комплексом полос. Гомологичные хромосомы окрашиваются идентично, за исключением полиморфных районов, где локализуются разные аллельные варианты генов. Аллельный полиморфизм характерен для многих генов и встречается в большинстве популяций.
Q-окрашивание. Используют флюоресцентный краситель акрихин-иприт. Под люминесцентным микроскопом на хромосомах видны участки с неодинаковой интенсивностью флюоресценции - Q-сегменты. Метод лучше всего подходит для исследования Y-хромосом и потому используется для быстрого определения генетического пола, выявления транслокаций между Х- и Y- хромосомами или между Y-хромосомой и аутосомами.
G-окрашивание. После интенсивной предварительной обработки слабым раствором протеолитического фермента трипсина хромосомы окрашивают красителем Гимзы. При этом наблюдается полосатая исчерченность хромосом, где темные полосы в некоторой степени соответствуют гетерохроматиновым районам, а светлые – эухроматиновым. G-окраска имеет свою кодировку (GTG) по международной цитогенетической номенклатуре. G-окрашивание дает наилучшие результаты при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы). G-окрашивание заняло место в качестве стандартного метода цитогенетического анализа. G-окрашивание дает наилучшие результаты при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы).
R-окрашивание отличается противоположностью рисунка G-окраске. Темноокрашенными здесь являются эухроматиновые участки хромосом, а светлыми – гетерохроматиновые. Обычно используют краситель Гимзы или флюоресцентный краситель акридиновый оранжевый. Этим методом выявляют различия в окрашивании гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом.
С-окрашивание выявляется в виде вариабельных по величине темноокрашенных сегментов конститутивного гетерохроматина в центромерных районах хромосом, в то время как эухроматиновые участки хромосом прокрашиваются очень бледно.
Т-окрашивание применяют для анализа теломерных районов хромосом. Эту методику, а также окрашивание районов ядрышковых организаторов азотнокислым серебром (AgNOR-окрашивание) используют для уточнения результатов, полученных путем стандартного окрашивания хромосом.
Вопрос 117.
ДНК-зонды. Их применение в определении наследственных заболеваний.
Краткий обзор
ДНК – зонд - это короткий фрагмент ДНК, конъюгированный с флуоресцеином, ферментно, или радиоактивным изотопом, который используется для гибридизации с комплементарным участком молекулы ДНК – мишени.
Основная часть
Системы ДНК-диагностики
Информация о всем многообразии свойств организма заключена в его генетическом материале. Так, патогенность бактерий определяется наличием у них специфического гена или набора генов, а наследственное генетическое заболевание возникает в результате повреждения определенного гена. Сегмент ДНК, детерминирующий данный биологический признак, имеет строго определенную нуклеотидную последовательность и может служить диагностическим маркером.
В основе многих быстрых и надежных диагностических методов лежит гибридизация нуклеиновых кислот — спаривание двух комплементарных сегментов разных молекул ДНК. Процедура в общих чертах состоит в следующем.
1. Фиксация одноцепочечной ДНК-мишени на мембранном фильтре.
2. Нанесение меченой одноцепочечной ДНК-зонда, которая при определенных условиях (температуре и ионной силе) спаривается с ДНК-мишенью.
3. Промывание фильтра для удаления избытка несвязавшейся меченой ДНК-зонда.
4. Детекция гибридных молекул зонд/мишень.
В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевыми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции гибридизационного сигнала. Система детекции должна быть в высшей степени специфичной и высокочувствительной.
*Флуоресцеин (диоксифлуоран, уранин А) — органическое соединение, флуоресцентный краситель. В аналитической химии флуоресцеин используется в качестве люминесцентного кислотно-основного индикатора. В биохимии и молекулярной биологии изотиоцианатные производные флуоресцеина в качестве биологических красок для определения антигенов и антител.
* Детекция – это обнаружение, выявление, нахождение чего либо.
*конъюгирование=сопряжение
*Если в одной "пробирке" провести плавление и отжиг смеси ДНК, например, человека и мыши, то некоторые участки цепей ДНК мыши будут воссоединяться с комплементарными участками цепей ДНК человека с образованием гибридов. Число таких участков зависит от степени родства видов. Чем ближе виды между собой, тем больше участков комплементарности нитей ДНК. Это явление называется гибридизация ДНК-ДНК.
Вопрос 118.
Методы и условия применения прямой ДНК-диагностики.
Краткий обзор:
С помощью прямых методов выявляются нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК (мутации и их типы). Прямые методы отличаются точностью, достигающей почти 100 %.
Целью прямой диагностики является идентификация мутантных аллелей (нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, мутации и их типы).
Недостатком метода прямой ДНК-диагностики является необходимость знания точной локализации гена и спектра его мутаций. Методы прямой ДНК-диагностики показаны для таких заболеваний, как фенилкетонурия (мутация R408W), муковисцидоз - (наиболее частая мутация delF508), хорея Гентингтона (экспансия тринуклеотидных повторов-CTG-повторы) и др.
Полный ответ:
С помощью прямых методов выявляются нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК (мутации и их типы). Прямые методы отличаются точностью, достигающей почти 100 %. Однако на практике указанные методы могут применяться при определенных условиях:
1) известной цитогенетической локализации гена, ответственного за развитие наследственного заболевания,
2) должен быть клонированным ген заболевания и известна его нуклеотидная последовательность.
Целью прямой диагностики является идентификация мутантных аллелей (нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, мутации и их типы). Высокая точность метода прямой ДНК-диагностики в большинстве случаев не требует ДНК-анализа всех членов семьи, так как выявление мутации в соответствующем гене позволяет почти со 100-процентной точностью подтвердить диагноз и определить генотип всех членов семьи больного ребенка, включая гетерозиготных носителей.
Недостатком метода прямой ДНК-диагностики является необходимость знания точной локализации гена и спектра его мутаций.
Методы прямой ДНК-диагностики показаны для таких заболеваний, как фенилкетонурия (мутация R408W), муковисцидоз - (наиболее частая мутация delF508), хорея Гентингтона (экспансия тринуклеотидных повторов-CTG-повторы) и др.
Однако к настоящему времени гены многих заболеваний не картированы, неизвестна их экзонно-интронная организация, и многие наследственные болезни отличаются выраженной генетической гетерогенностью, что не позволяет в полной мере использовать прямые методы ДНК-диагностики. Поэтому информативность метода прямой ДНК-диагностики широко варьирует. Так, при диагностике хореи Гентингтона, ахондроплазии она составляет 100 %, при фенилкетонурии, муковосицидозе, адреногенитальном синдроме - от 70 до 80 %, а при болезни Вильсона-Коновалова и миопатии Дюшенна/Бекера — 45-60 %. В связи с этим используются косвенные методы молекулярно-генетической диагностики наследственных болезней.
Вопрос №119
Методы и условия применения косвенной ДНК-диагностики.
Краткий обзор:1)Метод ПДРФ-анализа и гипервариабельных сателлитных повторов 2)Косвенная ДНК-диагностика проводится в следующих случаях:
1) когда ген не идентифицирован, а лишь картирован на определенной хромосоме,
2) когда методы прямой ДНК-диагностики не дают результата (например, в силу большой протяженности гена или широком спектре мутационных изменений,
3) при сложной экзонно-интронной организации гена. 3) При использовании косвенных методов ДНК-диагностики требуется семейный анализ аллелей полиморфных маркеров. 4) Косвенные методы ДНК-диагностики могут использоваться в пренаталньой диагностике практически для всех моногенных заболеваний
Основная часть:Косвенные методы ДНК-диагностики основаны на анализе сцепления с исследуемым геном определенного полиморфного локуса (маркера), с помощью которого можно производить маркировку как мутантиых, так и нормальных аллелей и проанализировать их передачу в поколениях, т.е. среди родственников обследуемого лица. Метод ПДРФ-анализа включает проведение нескольких этапов исследования: выделение геномной ДНК; рестрикция выделенной ДНК с помощью специфических эндонуклеаз; электрофоретическое разделение фрагментов ДНК; идентификация фрагментов ДНК, содержащая полиморфный сайт рестрикции с помощью блот-гибридизации по Саузерну. При отсутствии рестрикции ДНК по данным радиоавтографии будет выявляться крупный (неразрезанный фрагмент, или бэнд). При наличии рестрикции будет выявляться меньший по размерам фрагмент. У лиц, гомозиготных по данному наследственному заболеванию, будет выявляться один бэнд, в то время как у лиц, гетерозиготных по данному наследственному моногенному дефекту, будут определяться оба фрагмента. ПДРФ-анализ значительно упрощается, если имеется возможность специфической амплификации участка ДНК, содержащего полиморфный сайт рестрикции. Проведение в этом случае ПЦР-реакции и рестрикции амплифицированного фрагмента позволяет провести тестирование состояния этого локуса. Таким образом, косвенная ДНК-диагностика проводится в следующих случаях:
1) когда ген не идентифицирован, а лишь картирован на определенной хромосоме,
2) когда методы прямой ДНК-диагностики не дают результата (например, в силу большой протяженности гена или широком спектре мутационных изменений,
3) при сложной экзонно-интронной организации гена.
При использовании косвенных методов ДНК-диагностики требуется семейный анализ аллелей полиморфных маркеров.
Для косвенной диагностики могут использоваться так называемые гипервариабельные сателлитные повторы. Они являются более информативными методами, чем ПДРФ-анализ, поскольку обладают высоким уровнем гетерозиготности и плотно расположены в каждой из хромосом. В последние годы используются короткие тандемные повторы (STR-повторы, short tandem repeates), которые стабильно наследуются и обладают большим уровнем полиморфизма, а также короткие секвенированные последовательности ДНК с известной генной локализацией, так называемые STS-повторы (sequence tagged sites).
Последние обладают выраженной индивидуальной специфичностью, стабильно наследуются по законам Менделя и находят широкое применение для молекулярно-генетической диагностики моногенных болезней. Они могут также использоваться в качестве молекулярных маркеров мутантных хромосом в семьях высокого риска. Косвенные методы ДНК-диагностики могут использоваться в пренаталньой диагностике практически для всех моногенных заболеваний. Однако для этого необходимо иметь знания о том, что локус является высокополиморфным и находится вблизи от мутантного гена или внутри него. Поэтому для диагностики требуется обследование как можно большего числа родственников (в первую очередь родители—дети), чтобы проследить путь передачи маркеров потомству. Это повышает информативность выбранного маркера.
Вопрос 120.
Клонирование организмов.
Кратко:
Термин «клон» происходит от греческого слова «klon», что означает веточка, побег, отпрыск и имеет отношение, прежде всего к вегетативному размножению. Клонирование – популяция клеток или организмов произошедших от общего предка путём бесполого размножения, причём потомок при этом генетически идентичен своему предку. Различают полное (репродуктивное) и частичное клонирование организмов. При полном воссоздаётся весь организм целиком, при частичном — организм воссоздаётся не полностью (например, лишь те или иные его ткани).
Полный ответ:
Наибольшее внимание учёных и общественности привлекает клонирование многоклеточных организмов, которое стало возможным благодаря успехам генной инженерии. Создавая особые условия и вмешиваясь в структуру ядра клетки, специалисты заставляют её развиваться в нужную ткань или даже в целый организм. Допускается принципиальная возможность воспроизведения даже умершего организма, при условии сохранения его генетического материала.
Различают полное (репродуктивное) и частичное клонирование организмов. При полном воссоздаётся весь организм целиком, при частичном — организм воссоздаётся не полностью (например, лишь те или иные его ткани).
Репродукти́вное клони́рование предполагает, что в результате получается целый организм. Кроме научных целей оно может применяться для восстановления исчезнувших видов или сохранения редких видов.
Одно из перспективных применений клонирования тканей — клеточная терапия в медицине. Такие ткани, полученные из стволовых клеток пациента, могли бы компенсировать недостаток и дефекты собственных тканей организма и не отторгаться при трансплантации. Это так называемое терапевтическое клонирование.
Терапевти́ческое клони́рование предполагает, что в результате намеренно не получается целый организм. Его развитие останавливают заранее, а получившиеся эмбриональные стволовые клетки используют для получения нужных тканей или других биологических продуктов. Эксперименты показывают, что терапевтическое клонирование может быть с успехом применено для лечения некоторых заболеваний, считавшихся неизлечимыми.
Вопрос 121.
Методы клонирования ДНК.
Краткий обзор:
Молекулярное клонирование — способ получения миллионов копий определенной последовательности ДНК или гена внутри бактериальной клетки. Сначала фрагмент ДНК помещают в вектор для клонирования. В качестве векторов чаще всего используют небольшие кольцевые молекулы ДНК, называемые плазмидами, или бактериальные вирусы, называемые фагами. Векторы содержат генетическую информацию, что позволяет бактериальной клетке реплицировать последовательность ДНК. После внедрения фрагмента ДНК плазмиду или фаг вводят в бактериальную клетку. Размножающиеся в культуре бактерии реплицируют вектор, содержащий требуемую последовательность ДНК, в количестве сотен копий на клетку, позволяя получить множество идентичных копий исходной последовательности ДНК. Затем векторы извлекают из культуры бактериальных клеток с помощью тех же рестрикционных ферментов, которые были использованы для включения фрагмента ДНК в вектор. Каждый рестрикционный фермент распознает специфическую последовательность нуклеотидов. Эти области распознавания расположены вдоль молекулы ДНК любого организма случайным образом и состоят из короткого симметричного мотива, называемого палиндромом, который одинаково прочитывается в противоположных направлениях на обеих цепях двойной спирали ДНК.
Полный ответ:
После того, как ДНК сшита в пробирке, ее необходимо размножить(клонировать).
Существует два подхода к клонированию ДНК. Первый подход предполагает использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК. Второй способ представляет собой амплификацию ДНК in vitro.
Клонирование ДНК in vivo. Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (кДНК).
Геномная библиотека (банк генов, клонотека)– это коллекция клонов ДНК, включающая все фрагменты, входящие в геном данного вида. Т. е. банк генов еще можно назвать набором клонированных фрагментов генома. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока. Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами. Библиотека кДНК. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) –ферментативная реакция, осуществляемая in vitro с помощью термостабильной ДНК-полимеразы на матрице ДНК с использованием олигонуклеотидных ДНК-затравок (праймеров), комплементарных нуклеотидным последовательностям противоположных цепей ДНК на границах амплифицируемого участка. ПЦР представляет собой серию из 3-х циклически повторяющихся реакций (обычно в сумме осуществляют 20—30 циклов): денатурация ДНК, отжиг ДНК-затравок с матрицей и синтез ДНК с помощью ДНК-полимеразы с каждой из затравок навстречу друг другу с использованием противоположных цепей ДНК в качестве матриц; по завершении каждого цикла количество синтезированного продукта удваивается и происходит увеличение количества анализируемой ДНК в геометрической прогрессии, что позволяет в миллионы раз увеличивать количество изучаемого фрагмента ДНК в пробе.
Вопрос №122
Клонирование генов.
Краткий ответ:
Клонирование генов – это процедура, включающая выделение и амплификацию отдельных генов в реципиентных клетках, про- или эукариотических. С информационной РНК, выделяемой из однотипных клеток организма, снимают ДНК-копии (кДНК), которые затем вводят в реципиентные клетки, и амплифицируют. Клонирование ДНК in vivo включает 4 этапов:
1) получение фрагментов ДНК, в том числе генов или их частей с помощью ферментов рестрикции;
2) рекомбинация фрагментов,
3) вставка фрагмента ДНК в вектор;
4) трансформация с помощью вектора организма хозяина;
5) скрининг на рекомбинантный вектор
6) отбор интересующих исследователя клонов.
Основная часть:
Реципиентные клетки – клетки, выбранные для клонирования гена, могут быть как про-, так и эукариотическими.
мРНК выделяют из клеток или тканей, в которых экспрессируется искомый ген.
Синтез ДНК - копий осуществляется ферментом РНК-зависимой ДНК-полимеразой. Чтобы этот фермент начал работать, требуется короткая одноцепочечная ДНК-затравка; для этой цели, как правило, используют oligo(dT). Затравочная ДНК самопроизвольно образует двухцепочечный комплекс с отрезком poly(dA).
Деполимеризацию исходной РНК-цепочки осуществляют путем щелочного гидролиза. Цепи ДНКустойчивы к обработке щелочью, а РНК полностью деполимеризуется. Получившаяся в результате ДНК является одноцепочечной.
Двухцепочечную (дц) кДНК получают путем достраивания оц-кДНК до двухцепочечной формы, выполняемого ферментом ДНК-полимеразой I. Такую кДНК можно встраивать в вектор.
Существует два основных типа векторов: бактериальные плазмиды и бактериофаги.
Плазмиды — это встречающиеся в клетках внехромосомные элементы, представляющие собой замкнутые кольцевые молекулы дц-ДНК. Чтобы включить кДНК в плазмиду, замкнутое кольцо плазмиды надо «разомкнуть». Для этого плазмиды подвергают воздействию рестриктаз.
Рестриктаза - разрезает дц-ДНК по определенным нуклеотидным последовательностям, называемым участками рестрикции.
Сшивание (лигирование) — процедура, в ходе которой чужеродная ДНК встраивается между (или сшивается с двумя концами плазмидной ДНК с помощью фермента, называемого ДНК-лигазой.
Трансформация происходит после того, как рекомбинантную плазмиду добавляют к бактерии-реципиенту: плазмида проникает внутрь бактерии и включается в ее жизненный цикл.
Скрининг («просеивание») — это процедура, необходимость применения которой обусловлена тем, что в исходном препарате кДНК представлено много разных мРНК и лишь часть плазмид несет нужный нам ген.
Амплификация осуществляется благодаря тому, что в одной бактериальной клетке может синтезироваться много копий интересующей нас плазмиды, а также за счет получения большого количества клеток с такими плазмидами. После выделения и очистки плазмиды обрабатывают соответствующей рестриктазой, которая вырезает встроенные в них копии искомого гена. Амплифицированный таким образом ген можно использовать для дальнейших экспериментов в области генной инженерии.
Вопрос №123
Генетически модифицированные организмы.
Краткий обзор:
Генетически модифицированный организм (ГМО) - организм, генотип которого был искусственно изменён при помощи методов генной инженерии (растения, животные и микроорганизмы).
Генная инженерия - совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма, осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования.
Основным видом генетической модификации в настоящее время является использование трансгенов для создания трансгенных организмов.
Трансген — фрагмент ДНК, переносимый при помощи генно-инженерных манипуляций в геном определённого организма с целью модификации его свойств. Трансген может быть выделен из биологического объекта или синтезирован искусственно.
Трансге́нный органи́зм — живой организм, в геном которого искусственно введен ген, который не может быть приобретен при естественном скрещивании.
Основная часть:
Основные этапы создания ГМО:
1. Получение изолированного гена.
2. Введение гена в вектор для переноса в организм.
Вектор - молекула нуклеиновой кислоты, чаще всего ДНК, используемая в генетической инженерии для передачи генетического материала другой клетке. Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты — рестриктазы и лигазы. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор.
3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.
4. Преобразование клеток организма.
5. Отбор генетически модифицированных организмов и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.
Применение:
В медицине: при помощи трансгенной бактерии производится человеческий инсулин.
В фармацевтической промышленности: выпускается большое количество лекарственных средств на основе рекомбинантных белков человека
В сельском хозяйстве: для создания новых сортов растений, устойчивых к неблагоприятным условиям среды и вредителям, повышение урожайности.
А также: разрабатываются генетически модифицированные бактерии, способные производить экологически чистое топливо.
Генетически модифицированная пища - это продукты питания, полученные из генетически модифицированных организмов (ГМО). Большинство культивируемых генно-модифицированных организмов обладают устойчивостью к возбудителям болезней (к вирусам и грибам), насекомым-вредителям или к гербицидам.
Ворос 124.
Структура генома.
Краткий ответ:
Геном - вся совокупность молекул ДНК клетки (в случае ряда вирусов говорят о геномной РНК).
Существует ядерный геном, митохондриальный геном и геном пластид. Мы будем рассматривать только ядерный геном. Соматические клетки содержат диплоидный (2n) геном, половые - гаплоидный (n).
Размер генома
Объект
|
Размер гаплоидного генома в парах нуклеотидов
|
Микоплазмы
|
104-106
|
Эубактерии (E.coli)
|
105-107
|
Грибы
|
(2-5)х107
|
Водоросли
|
(5-7)х107
|
Черви
|
108
|
Моллюски
|
5х108-5х109
|
Насекомые
|
108-5х109
|
Ракообразные
|
109
|
Иглокожие
|
2х108-2х109
|
Рыбы
|
3х108-1010
|
Амфибии
|
7х108-7х1010
|
Рептилии
|
(2-3)х109
|
Птицы
|
109
|
Млекопитающие
|
3х109
|
Цветковые растения
|
2х108-1011
|
Полный ответ:
Геном - вся совокупность молекул ДНК клетки (в случае ряда вирусов говорят о геномной РНК).
Существует ядерный геном, митохондриальный геном и геном пластид. Соматические клетки содержат диплоидный (2n) геном, половые - гаплоидный (n).
Прямой корреляции между количеством ДНК и эволюционной продвинутостью организма нет.
Так, например, у малярийного плазмодия 0.06 пг ДНК в ядре, а у амебы 490 пг. Большое количество ДНК не обязательно приносит качественно новую информацию. Амеба пошла на увеличение количества ДНК для увеличения размеров ядра и самой клетки. Генов у нее меньше, чем у плазмодия, но они копированы много раз. У малярийного плазмодия генов больше, чем у амебы, а ДНК меньше для максимальной компактности. Малые размеры ядра и самого одноклеточного организма позволяют ему быть внутриклеточным паразитом.
"Избыточность" эукариотического генома
На 106 пар нуклеотидов у бактерий приходится 5 тыс. генов. На 109 пар нуклеотидов у млекопитающих 50 тыс. генов.
Минусы "избыточной" ДНК:
- увеличение времени синтеза ДНК;
- cложнее организовывать удвоение ДНК;
- высокая энергоемкость - на 1 нуклеотид для включения в цепь ДНК нужно затратить 60 молекул АТФ.
Неопределенное следствие:
- благодаря зависимости размера ядра от количества ДНК происходит увеличение размеров клетки.
Плюсы "избыточной" ДНК:
- возникает возможность создания сложного регуляторного аппарата, позволяющего поднять организм на более высокий эволюционный уровень.
Причины избыточности:
1. Большой размер генов (за счет наличия интронов).
2. Присутствие повторенных последовательностей. Повторяются и гены, и некодирующие участки. У эукариот некоторые последовательности повторены сотни и тысячи раз.
3. Наличие большого числа некодирующих последовательностей, часть из которых выполняет регуляторную функцию при транскрипции, а часть - необходима для компактизации генома.
Компактность генома эукариот
Компактность - другое принципиальное отличие генома эукариот от прокариотического генома.
При средней разнице размеров геномов на 3 порядка, линейные размеры эукариотических хромосом соизмеримы с длиной ДНК прокариот.
Выделяют, по крайней мере, 4 уровня компактизации ДНК. При этом нить ДНК "укорачивается" в 10000 раз.
Это все равно, что нить, длиной с Останкинскую башню (500 м), уложить в спичечный коробок (5см).
Два первых уровня компактизации эукариотического генома обеспечиваются гистонами.
Вопрос 125.
Организация геномов гаплоидных и диплоидных организмов.
Кратко:
ГЕНОМ, совокупность генов, локализованных в гаплоидном наборе хромосом данного организма. Половыеклетки гаплоидные) содержат один геном, соматические клетки высших организмов (диплоидные) - два: один геном отцовский, другой - материнский.
Геном человека состоит из 23 хромосом и содержит примерно 3*109 нуклеотидных пар. Геном бактерий представлен единственной, кольцевой хромосомой, связанной с клеточной мембраной. Строение ее намного проще, чем у высших организмов. Так, ДНК генома кишечной палочки состоит из 3,8*106нуклеотидных пар. Геном наиболее примитивных вирусов состоит из молекулы ДНК или (в некоторых случаях) РНК, имеющих линейную или кольцевую форму. У более сложных вирусов обнаруживаются черты структурной организации, характерные для хромосом высших организмов.
Бактериальный геном содержит в основном неповторяющиеся гены; лишь немногие гены, кодирующие рибосомальные РНК, присутствуют в бактериальном геноме в виде неских копий. В геномах высших организмов по степени повторяемости выделяют три основных типа нуклеотидных последовательностей: высокоповторяющиеся (до 106 копий), умеренно повторяющиеся (102*105 копий) и уникальные. Последние могут быть представлены одной или несколькими копиями. В эту фракцию входит подавляющее число генов, кодирующих белки. Повторяющиеся последовательности обычно составляют в зависимости от вида организма 10-70% всего генома. Их, как правило, меньше у низкоорганизованных организмов и больше у высших. Выяснены функции лишь очень малой части всех повторов. Особую фракцию генома составляют мигрирующие генетические элементы.
Полный ответ:
ГЕНОМ, совокупность генов, локализованных в гаплоидном наборе хромосом данного организма. Половые клетки (гаплоидные) содержат один геном, соматические клетки высших организмов (диплоидные) - два: один геном отцовский, другой - материнский.
Все живые организмы в зависимости от структурно-функциональной организации генома делят на эукариотов и прокариотов (протокариотов). Эукариотами называют организмы, в клетках которых имеется морфологически обособленное ядро, содержащее хромосомы и отделенное от цитоплазмы ядерной мембраной. К ним относят всех животных и растения, кроме сине-зеленых водорослей. Прокариотами называют организмы, клетки которых не дифференцированы на ядро и цитоплазму и не содержат морфол, аналогов хромосом эукариотов. К ним относят бактерии и синезеленые водоросли, а также самые примитивные формы жизни — вирусы и бактериофаги. Общим для эукариотов и прокариотов является то, что в обоих случаях носителем наследственной информации является нуклеиновая к-та — ДНК или у некоторых вирусов РНК (см. Дезоксирибонуклеиновые кислоты, Рибонуклеиновые кислоты).
Геном человека состоит из 23 хромосом и содержит примерно 3*109 нуклеотидных пар. Геном бактерий представлен единственной, кольцевой хромосомой, связанной с клеточной мембраной. Строение ее намного проще, чем у высших организмов. Так, ДНК генома кишечной палочки состоит из 3,8*106нуклеотидных пар. Геном наиболее примитивных вирусов состоит из молекулы ДНК или (в некоторых случаях) РНК, имеющих линейную или кольцевую форму. У более сложных вирусов обнаруживаются черты структурной организации, характерные для хромосом высших организмов.
Бактериальный геном содержит в основном неповторяющиеся гены; лишь немногие гены, кодирующие рибосомальные РНК, присутствуют в бактериальном геноме в виде неских копий. В геномах высших организмов по степени повторяемости выделяют три основных типа нуклеотидных последовательностей: высокоповторяющиеся (до 106 копий), умеренно повторяющиеся (102*105 копий) и уникальные. Последние могут быть представлены одной или несколькими копиями. В эту фракцию входит подавляющее число генов, кодирующих белки. Повторяющиеся последовательности обычно составляют в зависимости от вида организма 10-70% всего генома. Их, как правило, меньше у низкоорганизованных организмов и больше у высших. Выяснены функции лишь очень малой части всех повторов. Особую фракцию генома составляют мигрирующие генетические элементы.
Вопрос 126.
Базовые регуляторные элементы генома.
Краткий ответ:
регуляторные элементы энхансеры, сайленсеры, инсуляторы.
Полный ответ:
регуляторные элементы энхансеры, сайленсеры, инсуляторы.
Энхансеры
Механизм действия энхансера основан на результатах изучения бактериальных систем. Известно, что в клетках бактерий началу транскрипцииспособствует образование петли ДНК. Это согласуется с данными о том, что энхансеры обычно наиболее эффективны, когда они находятся вблизи промотора; с увеличением расстояния их активность постепенно падает.
Предложены и другие гипотезы о механизме действия этого регуляторного элемента:
1. Энхансер может действовать на большом расстоянии, активируя ДНК-топоизомеразу, которая вносит торсионное напряжение в большую петлю ДНК, используя для этого энергию гидролиза АТР.
2. Энхансер может влиять на транскрипцию, действуя как сайт посадки мобильных белков, которые связываются с ДНК и затем движутся вдоль ее молекулы.
3. Энхансер может связывать белки, которые способствуют присоединению близлежащего гена к определенной области ядра, где локализованы факторы транскрипции.
Активаторы (Activators)- белки, которые связываются с энхансерами, которые помогают РНК-полимеразе правильно начать транскрипцию.
Репрессоры (Repressor)- белки,которые связывают активаторы, чем снижают или прекращают транскрипцию.
Основные факторы (Basal factors)- белки, которые ориентируют РНК-полимеразу на начало структурной части гена.
TATA box (или Pribnow box)- часть промотора, являющаяся сайтом связывания для белковых факторов.
Транскрипционные факторы (Transcription factors)- помогают занять правильную позицию активаторам и РНК- полимеразе.
Сайленсоры
Ингибирование транскрипции с использованием регуляторных элементов, называемых сайленсерами, - активный процесс. В этом случае происходит прямое подавление инициации транскрипции путем разрушения транскрипционного комплекса на промоторе или посредством его инактивации иным способом. Первый из описанных в 1986 г. сайленсеров обладал классическими энхансероподобными свойствами, действуя на промоторы, расположенные в цис-положении (на той же молекуле ДНК) на большом расстоянии. При этом активность сайленсера, подобно энхансеру, не зависела от его ориентации по отношению к регулируемому промотору. Активность других сайленсеров зависит от положения их по отношению к регулируемому промотору и ориентации относительно него, и прямо пропорциональна числу их копий. Регуляторные белки, связывающиеся с сайленсерами, по аналогии с белками энхансеров , помимо ДНК-связывающих доменов содержат аминокислотные последовательности, обеспечивающие белок-белковые взаимодействия, которые необходимы для осуществления негативной регуляции транскрипции.
 Инсуляторы
Существуют определенные последовательности нуклеотидов длиной в несколько сотен пар оснований, которые обладают способностью подавлять позитивное и негативное влияние эухроматина и гетерохроматина на экспрессию трансгенов, интегрированных в этот хроматин и фланкированных указанными последовательностями в новом сайте интеграции. Такие участки ДНК как бы изолируют ген, находящийся между ними, способствуя сохранению его обычной пространственной структуры. Эти последовательности известны под названием инсуляторов (англ. insulate - изолировать) и как регуляторные области локусов (LCR - locus control regions). Введение одного из таких элементов между энхансером и промотором регулируемого гена приводит к функциональной изоляции энхансера и подавлению экспрессии гена, а фланкирование гена пограничными последовательностями предохраняет его от инактивирующего действия окружающего конденсированного гетерохроматина, т.е. снимает эффект положения. У высших эукариот энхансер может активировать промотор на расстоянии, достигающем нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов, что является одной из особенностей регуляции транскрипции высших эукариот.
По сути механизм формирования петли (домена) выглядит так:
Взаимодействующие белки инсулятора (голубые и зеленые шары) связываются с инсулятором (красный) и формируют "петлю"- домен. Гены в домене отделены от конденсированного хроматина вне домена, что обеспечивает их независимую регуляцию транскрипционными факторами.
Вопрос №127
Полиморфизм генов.
Краткий обзор:
Полиморфизм ДНК-существование в популяции двух или большего числа альтернативных аллелей определенного локуса гена, которые различаются нуклеотидной последовательностью.
Аллель-серия двух или более генов занимающие одинаковые позиции в гомологичных хромосомах. Соматические клетки содержат два аллеля одного гена(по числу гомологичных хромосом),половые по одному аллелю.
Основная часть:
Большинство генов в каждом организме представлено двумя аллелями один от отца другой от матери. Если аллели идентичны- то организм -гомозиготен если разные- гетерозиготен.В ходе эволюции разные аллели произошли от единого аллеля предшественника.Таким образом гены представленные в популяции несколькими аллелями –полиморфные. Мутации ведут к возникновению новых аллелий.И лежат в основе генетической изменчивости живой природы.Пример молчащей мутации замена нуклеотида, при которой новый кодон имеет прежний смысл.(кодирует ту же аминокислоту- НЕ МЕНЯЕТ СТРУКТУРУ БЕЛКА)Такие нейтральные мутации –нормальные полиморфизмы.Патологические мутации приводят к нарушению механизма трансляции транскрипции, либо к синтезу аномального белка.
Полиморфизмы обнаружены во всех структурных элементах генома:экзонах интронах регуляторных участков. Полиморфизм ДНК БОЛЕЕ выражен в некодирующей части генома→изменение уровня экспрессии мРНК.Если один и тот же ген у разных людей отличается на один нуклеотид –однонуклеотидный полиморфизм.(В геноме человека встречается 1 на 300 нуклеотидов)Такая высокая плотность позволяет использовать однонуклеотидные полиморфизм ы в качестве генетического маркера. Еще один вид генетического полиморфизма –вариация числа копий.В этом случае наблюдатся вариации числа копий протяженных участков ДНК. Происходит ЭТО в результате ДЕЛЕЦИИ И ДУПЛИКАЦИИ.
Ген считается полиморфным если его самый распространенный аллель встречается менее чем у 99%людей,или частота редкого аллеля должна быть менее чем 1%В науке и медицине полиморфизм используют в качестве генетического маркера для поисков генов ответственных за генетические заболевания
Вопрос 128.
Применение полиморфных маркеров в ДНК-диагностике.
Краткий :Полиморфного локус (маркер), с помощью которого можно производить маркировку как мутантных, так и нормальных аллелей и проанализировать их передачу в поколениях. Применяется при косвенной ДНК-диагностике. Анализ полиморфных генетических маркёров позволяет проследить в ряду поколений наследование каждой из родительских хромосом.Полиморфными принято называть гены, которые представлены в популяции несколькими разновидностями - аллелями, что обусловливает разнообразие признаков внутри вида.
Полный:Косвенная ДНК-диагностика, по существу, сводится к анализу полиморфных генетических маркеров у больных и здоровых членов семьи. Эти маркеры должны быть расположены в том же хромосомном регионе, где и ген болезни, т.е. они сцеплены. Такими маркерами могут быть участки ДНК, существующие в популяции в нескольких аллельных вариантах. Различия могут быть по составу нуклеотидов, по числу динуклеотидных повторов. На основе вариабельности состава маркерных участков ДНК можно дифференцировать материнское или отцовское происхождение конкретного варианта маркера, сцепленного с геном болезни. Сцепление означает, что маркер и ген болезни располагаются близко друг к другу; они передаются в составе одного хромосомного сегмента. Благодаря анализу полиморфных генетических маркеров можно проследить в ряду поколений наследование каждой из родительских хромосом.Технические приемы в косвенной диагностике те же самые, что и в прямой (получение ДНК, рестрикция, электрофорез и т.д.). Естественно, к этому добавляется математический анализ сцепления признаков.Использование косвенных подходов оказалось возможным благодаря существованию в геноме полиморфных участков (локусов) ДНК. Нуклеотидные замены достаточно часто встречаются в некодирующих участках ДНК. Значительное число нуклеотидных замен приводит к изменению мест рестрикции. Эти изменения можно выявить с помощью блот-гибридизации по Саузерну, поскольку изменяется длина рестриктных фрагментов. Эта разновидность полиморфизма ДНК получила названиеполиморфизма по длине рестриктных фрагментов.Расположенный вблизи изучаемого гена или внутри него полиморфный сайт может служить маркером аллельных вариантов этого гена, в том числе маркером патологических мутаций.
Полиморфизм, обусловленный нуклеотидными заменами или делециями, как правило, диаллелен, а, значит, его информационная ценность ограничена. Более информативны кластеры тандемных повторов, которые обусловливают полиморфизм по количеству копий (VNTR -variable number of tandem repeats), так называемый полиморфизм мини- и микросателлитных последовательностей.Микросателлиты - короткие тандемные повторы, обычно двугексануклеотидные. Самый распространенный из них - CA-повтор. Показано, что кластеры СА-повторов встречаются в среднем 1 на 30 000 пар нуклеотидов. Они локализованы, как правило, в некодирующих районах ДНК. Блоки СА-повторов имеют менделевское наследование в семьях и не обнаруживают новых мутаций (рис. 9.20). Немаловажным положительным фактором является относительная простота обнаружения таких повторов в геноме человека. Кроме СА-повторов, достаточно распространены GA-повторы и другие кластеры тандемных повторов (ТТТА)хп, (TCTA)xn, (TTTC)xn, также обнаруживающие вариабельность по числу повторов. Широкая распростра-ненность в геноме (частота различных микросателлитов, взятых вместе, составляет 1 на 6000 пар нуклеотидов) и высокий уровень полиморфизма делают микро- и мини-сателлиты идеальными полиморфными маркерами для картирования генов наследственных заболеваний и проведения косвенной ДНК-диагностики.Полиморфные ДНК-маркеры и интегральная карта их расположения позволяют определить и проследить в поколениях хромосому, несущую патологический ген, а также подробнейшим образом охарактеризовать определенный хромосомный район, выявить субмикроскопические перестройки, определить наименьший район их перекрывания и локализовать ген-кандидат, ответственный за заболевание.
Основной недостаток косвенных методов диагностики - обязательное предварительное изучение генотипа (гаплотипа) хотя бы одного пораженного родственника. В случае отсутствия пораженныхродственников, доступных для обследования, диагностика (за редким исключением) становится невозможной.Итак, существует достаточно много молекулярно-генетических методов диагностики наследственных болезней. Эти методы оказались настолько универсальными, что нашли применение не только в медицинской генетике, но и диагностике инфекционных заболеваний. Каждый из представленных в табл. 9.4 методов имеет много вариантов. Одни и те же болезни можно диагностировать разными методами. Можно диагностировать болезнь даже в трудных случаях (невозможность обследования родителей, малое количество биологического материала, отсутствие сведений о гене и т.д.).
Вопрос 129.
Псевдогены.
Краткий обзор:
Псевдогены (англ. pseudogenes) — нефункциональные аналоги структурных генов, утратившие способность кодировать белок и не экспрессирующиеся в клетке. Псевдогены - это неработающие, "молчащие" гены, которые возникают в результате мутаций, выводящих нормальные "рабочие" гены из строя (существуют и другие, более редкие пути возникновения псевдогенов).
Полный ответ:
Если мутация выведет из строя ген, полезный для организма, она почти наверняка будет отсеяна отбором. Однако некоторые гены, в прошлом полезные, могут стать ненужными, например, из-за смены образа жизни. Мутация, выводящая из строя такой ген, не отсеивается отбором и может закрепиться в популяции.
Мутация, выводящая из строя такой ген, не отсеивается отбором и может закрепиться в популяции. Псевдогены могут долго сохраняться в геноме в качестве ненужного "балласта". Мутации, которые в дальнейшем будут происходить в псевдогене, безразличны для выживания организма, и поэтому такие мутации свободно накапливаются и в конце концов могут изменить псевдоген до неузнаваемости. Однако на это уходит обычно много времени (десятки или даже сотни миллионов лет). Поэтому в геномах большинства организмов, включая человека, псевдогены на той или иной стадии мутационной деградации присутствуют в больших количествах. Псевдогены представляют собой своеобразную "историческую хронику", рассказывающую об образе жизни и адаптациях далеких предков изучаемого организма.
Например, в геноме человека в псевдогены превратились многие гены обонятельных рецепторов. Это и понятно, поскольку обоняние не имело существенного значения для выживания людей в историческое время, и, по-видимому, в доисторическое тоже.
Некоторые псевдогены могут копироваться из мРНК и включаться в хромосомы, такие последовательности называются процессированными псевдогенами (ретропсевдогенами)Тем не менее, они также нефункциональны. Псевдогены происходят от обычных функциональных генов, однако утрачивают способность экспрессии в результате мутаций (появление стоп-кодонов, сдвиг рамки считывания и т. п.).Число процессированных псевдогенов (ретропсевдогенов) в среднем больше, чем предковых функциональных генов.
Анализ генетической последовательности псевдогенов и сравнение их с предковыми генами может быть использовано при изучении родственных связей между различными видами живых существ и их происхождения[3].
Примеры:
Ярким доказательством эволюции является присутствие одинаковых псевдогенов в одних и тех же местах генома у видов, произошедших сравнительно недавно от общего предка. Так, у человека есть псевдоген GULO, который представляет собой "сломанный" ген ферментаглюконо-лактон-оксидазы. Этот фермент необходим для синтеза аскорбиновой кислоты. У других приматов обнаружен точно такой же псевдоген, причем мутационная "поломка", нарушившая работу гена, у него такая же, как и в человеческом псевдогене. Причины очевидны: в связи с переходом предков современных приматов к питанию растительной пищей, богатой витамином C, данный ген перестал быть необходимым для выживания. Мутация, испортившая ген, не была отсеяна отбором, закрепилась и была унаследована обезьянами и человеком. У других млекопитающих (например, у крысы) GULO является не псевдогеном, а работающим геном, и поэтому крысам не нужно получать витамин C с пищей: они синтезируют его сами. В других группах млекопитающих, которые независимо от приматов перешли к питанию пищей, богатой витамином С, тоже произошла псевдогенизация гена GULO, но мутации, выведшие ген из строя, у них были другие (пример - морские свинки).
Вопрос 130.
Тандемные повторы. Их роль в ДНК – диагностики
Краткий обзор:
Тандемные повторы- последовательности повторяющехся фрагментов ДНК.
Полный ответ:
В зависемости от размреа подразделяются на три класса:
1-Сателлиты
Длина последовательности высокоповторяющехся сателлитов состовляют от 100 до 1 миллиона нуклеотидов. Длина одного повтора составляет 171 пару оснований, а весь повторяющийся регион занимает около 3—5 % размеров каждой хромосомы
2-Минисателлиты
Минисателиты – повторяющие фрагменты ДНК длиной от 7 до 100 нуклеотидов. Они встречаются более чем в 1000 местах генома человека.
3-Микросателлиты – повторяющие фрагменты ДНК длиной от 1 до 6 оснований.
Тандемные повторы играют важнейшую роль в самом существовании хромосом. Любая хромосома должна быть отграничена от остального генетического материала (это обеспечивается уникальными свойствами теломерной ДНК) и должна нормально наследоваться, правильно «растаскиваться», при делении клетки (центромерная ДНК). Без клонированных теломерных и центромерных участков невозможно и создание искусственных хромосом, необходимых для манипуляций с генами.
|
|
|
Скачать 1.8 Mb.