Методические рекомендации по профилактике, диагностике и лечению малярии в Вооруженных Силах Российской Федерации
 Скачать 1.9 Mb.
|
|
4.3 Лабораторная диагностика Основным методом лабораторной диагностики малярии остается микроскопическое иссле- дование крови. Для подтверждения диагноза также могут применяться иммунохроматографиче- ские, серологические и молекулярно-биологические методы исследований. 4.3.1 Микроскопическая диагностика Паразитологический метод диагностики малярии регламентируется МУК 4.2.3222-14 (Ла- бораторная диагностика малярии и бабезиозов) и основывается на исследовании препаратов крови «толстая капля» и «тонкий мазок». «Толстая капля» окрашивается без предварительной фиксации, это приводит к разрушению эритроцитов и выходу наружу находящихся в них пара- зитов. Отсутствие в препарате эритроцитов позволяет просматривать более толстый слой крови, что повышает чувствительность метода. «Тонкий мазок» содержит фиксированные эритроциты, его эффективное исследование возможно только при условии расположения клеток крови в один слой. Находящиеся в эритроцитах плазмодии имеют характерный внешний вид, что делает их легко узнаваемыми, обеспечивая тем самым достаточно высокую специфичность паразитологи- ческого метода диагностики малярии. 4.3.1.1 Взятие крови, приготовление «тонкого мазка» и «толстой капли» Для приготовления препаратов крови необходимо заблаговременно подготовить иглы, предметные стекла, стекла со шлифованными краями, спирт, эфир, гигроскопическую вату. Для обеспечения чистоты предметных стекол их кипятят в слабом растворе соды, затем моют с мы- лом в теплой воде, промывают в проточной водопроводной воде и вытирают чистым полотенцем. После этого их помещают в закрывающиеся банки со спиртом и выдерживают некоторое время. Извлеченные стекла протирают хлопчатобумажной стираной материей, заворачивают в чистую гладкую не ворсистую бумагу небольшими партиями и стерилизуют. Кровь обычно берут из мякоти последней фаланги безымянного или среднего пальца левой руки. Прокол производят острыми иглами одноразового пользования. Место укола протирают спиртом, а затем ватой, смоченной для быстрого обсушивания эфиром. Если кровь из ранки вы- ступает плохо, то слегка массируют палец в направлении к месту укола или просят обследуемого сделать несколько энергичных сгибательных движений пальцами и кистью. Иногда производят повторный прокол. Когда от одного больного берут несколько мазков, а выступившая из пальца кровь свертывается, ее удаляют сухой ватой. 24 При изготовлении мазков палец держат проколом вверх. К выступившей капле крови при- касаются нижней поверхностью предметного стекла, отступив на 1,5-2 см от узкого края. Затем стекло переворачивают, берут в левую руку, а в правую - предметное стекло с шлифованными краями и сточенными углами. Его узким краем под углом 45° касаются капли крови. Кровь рас- текается по краю шлифованного стекла, после чего быстрым движением этого стекла вперед де- лают мазок. Последний должен быть тонким (эритроциты не должны налегать друг на друга) и располагаться в средней части стекла, не доходя до его боковых сторон и противоположного края, так как пораженные эритроциты в значительной степени группируются по периферии маз- ков. Мазки крови высушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают. Для фиксации применяют этиловый 96° спирт (15 мин). Фиксатор можно наливать прямо на стекло, находящееся в гори- зонтальном положении, но лучше пользоваться специальными стаканчиками, в которые можно погружать сразу несколько препаратов. Фиксированные мазки высушивают на воздухе и окра- шивают азур-эозином по методу Романовского-Гимза. При изготовлении «толстых капель» палец поворачивают проколом вниз. К выступающим каплям крови прикасаются предметным стеклом, на которое берут 2-3 капли крови. Затем иглой или углом другого предметного стекла кровь размазывают, чтобы получить на стекле овал диа- метром около 1 см или полосу длиной 2-3 см. Слой крови не должен быть слишком толстым, так как в последнем случае при высыхании он превращается в корочку и легко отстает от стекла. После изготовления «толстых капель» их высушивают, положив стекла на горизонтальную по- верхность. Для ускорения высыхания стекла можно помещать в термостат (30-35 °С). Нужно предохранять стекла от запыления, а также от мух и тараканов, которые охотно поедают влажную и подсохшую кровь. Концентрированный раствор краски перед употреблением разводят дистиллированной во- дой из расчета 1-2 капли краски на 1 мл воды. Рабочий раствор краски наносят пипеткой на мазки, помещенные на дно стеклянной ванночки или на стеклянные палочки, соединенные попарно ре- зиновой трубкой и положенные на края кюветки. Продолжительность окрашивания – 30-45 мин. После окраски препарат промывают слабой струей воды и высушивают на воздухе. На стекле поверх окрашенного мазка можно написать простым карандашом фамилию больного, номер и дату. Эта надпись хорошо сохраняется. Дистиллированная вода для разведения краски должна иметь нейтральную или слабоще- лочную реакцию (рН 7,0-7,2). Число капель основного раствора на определенный объем воды и продолжительность окрашивания рекомендуется устанавливать для каждой отдельной серии краски путем предварительных проб. «Толстые капли» после высушивания на воздухе окрашиваются краской Романовского- Гимза без предварительной фиксации. Техника окрашивания такая же, как при окраске мазка. При этом происходит разрушение (гемолиз) эритроцитов и выход из них плазмодиев. Если «тол- стые капли» сохраняли неокрашенными более недели, то их следует предварительно обработать дистиллированной водой в течение 10-15 мин. Удалив со стекол дистиллированную воду вместе с выщелоченным гемоглобином, на них наливают красящий раствор. После окраски «толстой капли» препараты ополаскивают водой. Лучше всего промывать препарат, погружая его в ба- ночку с водой, при этом следует соблюдать осторожность, чтобы не допустить смывания со стекла окрашенной капли крови. Хранят окрашенные препараты завернутыми в бумагу, небольшими пачками, а лучше — в специальных папках с гнездами для каждого препарата. После микроскопирования иммерсион- ное масло удаляют мягкой фланелевой тряпочкой. Предварительно его можно растворять очи- щенным бензином. Для большей сохранности препаратов их можно покрывать раствором орга- нического стекла в хлороформе. 4.3.1.2 Плазмодии малярии в мазке крови Микроскопия препаратов крови для выявления плазмодиев проводится при большом уве- личении с иммерсионным объективом ×90-100 и окуляром ×7-10 при ярком освещении. Каплю иммерсионного масла наносят на тонкое место мазка. 25 P. vivax на стадии юного трофозоита имеет вид кольца (кольцевидный трофозоит). Большая часть паразита занята крупной вакуолью, оттесняющей ядро и цитоплазму к периферии клетки (прил. 10). В цитоплазме плазмодия пигмент отсутствует. На этой возрастной стадии плазмодий занимает около 1/3 объема эритроцита (прил. 11).Иногда встречаются 2-3 кольца в одном эрит- роците. Вследствие нарушения целостности ядра плазмодия во время подсыхания мазка крови иногда в кольце видны как бы два ядра, расположенные рядом или на некотором расстоянии одно от другого. В зрелом трофозоите, в отличие от кольцевидного, ободок цитоплазмы утолщен на стороне, противоположной ядру. В цитоплазме содержатся мелкие зерна пигмента. Зрелые трофозоиты обычно имеют неправильную амебовидную форму с одной или несколькими вакуолями. Размер их равен 1/2-2/3 диаметра эритроцита. По всей цитоплазме разбросан темно-бурый или золоти- сто-бурый пигмент. Зрелые трофозоиты занимают почти весь эритроцит. Они имеют круглую или овальную форму, без псевдоподий; цитоплазма без вакуоли. Пигмент у зрелых трофозоитов собирается в кучки (35-40 отдельных зернышек). Созревание трофозоитов завершается делением их ядра. Образующийся шизонт имеет не- сколько ядер. Их число после окончания деления варьирует от 14 до 22 (обычно бывает 16-18 ядер). Иногда, если деление началось раньше, чем трофозоит достиг своего предельного размера, образуется всего 10-12 ядер. После деления ядра образуется зрелый шизонт, из которого начинают формироваться до- черние клетки (мерозоиты). Пигмент к этому времени собирается в 1-2 кучки. Затем оболочка эритроцита разрывается, мерозоиты выходят в плазму крови и вновь внедряются в эритроциты. В одном эритроците могут находиться сразу два плазмодия на одной или различных стадиях раз- вития. После нескольких циклов шизогонии из некоторых мерозоитов развиваются мужские и женские половые клетки – гаметоциты. Вполне сформировавшийся женский гаметоцит (макро- гаметоцит) крупнее мужского и, как правило, занимает весь объем увеличенного эритроцита. Он имеет сравнительно небольшое, интенсивно окрашенное в рубиновый цвет, компактное ядро, расположенное на периферии клетки. В темно-голубой протоплазме равномерно рассеяны почти черные палочковидные частицы пигмента. Макрогаметоцит весьма похож на крупный шизонт, от которого его не всегда легко отличить. Иногда в одном эритроците обнаруживаются два мак- рогаметоцита. Мужской гаметоцит, или микрогаметоцит, имеет крупное, рыхлое, светло-розовое, цен- трально расположенное ядро. Бледно-голубая цитоплазма с обильно рассеянным в ней коричне- ватым пигментом окружает ядро узкой каемкой. Двойные инвазии микрогаметоцитами одного эритроцита встречаются реже, чем макрогаметоцитами. Число гаметоцитов P.vivax в крови обычно невелико. Появляются они на второй - третий день заболевания, и затем количество их значительно возрастает. Эритроциты, пораженные P. vivax, увеличиваются в размерах по сравнению с нормальными почти в 1,5 раза. В них появляется красновато-фиолетовая зернистость (зернистость Шюффнера). Она бывает особенно четко выражена в перекрашенных препаратах, что затрудняет выявление паразита. Сам инвазированный эритроцит постепенно обесцвечивается и бледнеет. P. malariae на стадии кольца не отличается от соответствующей формы P. vivax (прил. 12). В эритроците встречается не более одного кольца. Трофозоиты имеют правильную, чаще всего округлую форму, нередко встречаются и лентовидные трофозоиты, которые обнаруживаются обычно в тонких участках мазка, где кровь подсыхает быстрее. В протоплазме шизонтов разбро- сан обильный пигмент в виде грубых округлых темно-бурых глыбок. Зрелый шизонт состоит из 6-12 (чаще из 8) мерозоитов, расположенных вокруг кучки пигмента как лепестки цветка («цве- ток маргаритки»). Гаметоциты по форме сходны с гаметоцитами P.vivax, но более мелкие. Довольно обиль- ный пигмент представлен грубыми, круглыми зернышками. У микрогаметоцита они коричневые, у макрогаметоцита темно-коричневые, почти черные. Гаметоциты в крови больных обнаружива- ются в незначительном количестве не ранее второй - третьей недели от начала заболевания. 26 Эритроциты, пораженные P. malariae, не увеличиваются в размерах, а находящиеся в них плазмодии мельче, чем аналогичные жизненные стадии P. vivax. P. falciparum в периферической крови находится, как правило, на стадии кольца. Диаметр колец в начале их развития значительно меньше, чем кольца остальных видов плазмодиев. При дальнейшем развитии размеры колец P. falciparum увеличиваются и отличить их от соответству- ющей стадии других видов плазмодиев становится труднее. Однако следует иметь в виду, что в одном эритроците часто находятся 2-3 кольца P. faiciparum, a кольцо P. malariae бывает только одно. Эритроциты же с двумя или тремя кольцами P.vivax обычно уже увеличены, обесцвечены и содержат зернистость Шюффнера, тогда как величина эритроцитов, инвазированных P. falciparum, остается прежней и зернистость в их цитоплазме отсутствует. Иногда встречаются незамкнутые кольца P. falciparum. При обычном течении тропической малярии в мазках обнаруживаются только кольца, т. к. дальнейшее развитие P. falciparum проходит в капиллярах внутренних органов. Лишь в очень тяжелых случаях заболевания трофозоиты и шизонты встречаются в периферической крови, хотя и в небольшом количестве. Трофозоиты мелкие, заполняют не более 2/3 эритроцита, по форме сходны с трофозоитами четырехдневной малярии. Для них характерно быстрое исчезновение ва- куолей и раннее скучивание глыбок темного пигмента. Зрелый шизонт состоит из 12-24 мелких мерозоитов, которые располагаются беспорядочно вокруг кучки пигмента. Сформировавшиеся гаметоциты имеют полулунную форму или напоминают банан. Они обнаруживаются на 7-14 день болезни. Макрогаметоциты – более узкие, вытянутые, окрашива- ются в голубой, синевато-серый цвет. В центре находится компактное, окрашенное в красный цвет ядро, прикрытое черными, неправильной формы грубыми глыбками пигмента, вследствие чего оно кажется темным. Микрогаметоциты более короткие (особенно молодые). Цитоплазма их розовато-серая или сиреневая; ядро бледно-розовое, крупное, нечетко отграниченное от цито- плазмы. Зерна пигмента немногочисленные, грубые, коричневые, рассеяны по всей клетке пара- зита, несколько концентрируясь в средней ее части. Гаметоциты полностью заполняют и растягивают эритроциты (в длину их размер может достигать двух диаметров эритроцитов), поэтому бывает видна только узкая пленка эритроцита на вогнутой стороне полулуния. В крови реконвалесцентов после перенесенной тропической малярией могут обнаружи- ваться только одни гаметоциты, что наблюдается после проведенного курса лечения шизонто- цидными препаратами, к которым половые клетки весьма устойчивы. P. ovale на различных стадиях эритроцитарного цикла развития имеет сходство с соответ- ствующими стадиями P. vivax или P. malariae. Пораженные плазмодием эритроциты увеличива- ются в размерах и принимают угловатую или овальную форму (отсюда название паразита); не- которые из них с фестончатыми краями. Эритроциты обесцвечиваются, и в их цитоплазме появ- ляется обычно хорошо выраженная зернистость Джеймса, похожая на зернистость Шюффнера в эритроцитах, инвазированных P. vivax. В мазке встречаются кольца и зрелые трофозоиты P. ovale, похожие на такие же стадии P. malariae, но с более крупными ядрами. Пигмент в виде темно-бурых глыбок разбросан по всей цитоплазме трофозоита. У зрелого шизонта собранные в кучку глыбки пигмента лежат не в центре эритроцита, как у P. malariae, а сбоку, между беспоря- дочно расположенными мерозоитами. Паразит делится на 6-12 мерозоитов (чаще на 8). Гамето- циты сходны с гаметоцитами P. vivax. 4.3.1.3 Плазмодии малярии в «толстой капле» В толстой капле слой крови во много раз толще, чем в тонком мазке, поэтому число маля- рийных паразитов в поле зрения при просмотре капли значительно увеличивается. Одно поле зрения «толстой капли» соответствует примерно 60-80 полям зрения «тонкого мазка», благодаря чему сокращается время просмотра. Этим и определяется важное значение метода «толстой капли» для исследования крови на плазмодии и других кровепаразитов. Метод «толстой капли» нередко позволяет быстро обнаружить паразитов в тех случаях, когда в тонком мазке их не уда- ется найти даже при просмотре очень большого числа полей зрения. Он является основным и 27 обязательным при диагностике малярии, как в клинической практике, так и при эпидемиологи- ческом обследовании. Малярийные плазмодии в толстой капле выглядят несколько иначе, чем в мазке, так как вследствие разрушения эритроцитов при окрашивании нефиксированных мазков крови плазмо- дии подвергаются деформации и лежат в поле зрения свободно. Они уменьшаются в размерах, изменяются их очертания. Эти изменения проявляются в различной степени у разных видов па- разитов. Кроме того, при просмотре капли нельзя использовать такой важный диагностический признак, как изменение эритроцитов. Окрашиваются плазмодии в толстой капле в те же цвета, что и в мазке: ядро имеет различ- ные оттенки красного, а цитоплазма – голубого или серовато-синего цвета. P. vivax на стадии юного (кольцевидного) трофозоита редко сохраняет свойственную этому возрасту форму. Кольцевидная цитоплазма, как правило, разорвана. Возле обычно отдельно рас- положенного небольшого красного ядра находится комочек округлившейся цитоплазмы. Часто цитоплазма вместе с ядром образуют фигуры, напоминающие восклицательный знак, запятую или пропеллер. Цитоплазма зрелых трофозоитов обычно разорвана на отдельные части. Среди цитоплаз- матических фрагментов находится ядро, лежащее отдельно или в одном из комочков цито- плазмы. В более крупных обрывках цитоплазмы видны зернышки пигмента. Преобладание разо- рванных трофозоитов над неповрежденными может служить одним из диагностических призна- ков P. vivax. Хорошо различимы в толстой капле развивающиеся и зрелые шизонты, которые имеют примерно тот же вид, что и в мазке. Макрогаметоциты обычно сохраняют круглую или овальную форму, но иногда принимают неправильные очертания вследствие надрыва цито- плазмы эритроцита. Микрогаметоциты повреждаются чаще. Нередко ядра их располагаются от- дельно от бледно окрашенных (иногда почти неразличимых) обрывков цитоплазмы, содержащих пигмент. Макрогаметоциты практически неотличимы от крупных шизонтов. В хорошо окрашен- ных и особенно отчетливо в перекрашенных препаратах нередко можно видеть, что плазмодии лежат на полупрозрачных розоватых дисках – строме эритроцитов, в которых они находились. Чаще эти диски можно обнаружить в более тонком слое крови по краям препарата. Наличие та- ких «теней» эритроцитов — важный диагностический признак P. vivax. P. malariae в толстой капле по сравнению с P. vivax изменяются незначительно. Юные (кольцевидные) трофозоиты этих видов сходны между собой, но в препаратах P. malariae коль- цевидных трофозоитов обычно бывает больше. Зрелые трофозоиты мелкие, круглой или оваль- ной формы, без вакуоли, с глыбками темного пигмента по периферии цитоплазмы. Зрелые ши- зонты состоят из 6-12 мерозоитов, сохраняющих форму «розетки» или разбросанных в беспо- рядке вокруг кучки пигмента. Гаметоциты имеют такой же вид, как и в мазке, сходны с гамето- цитами P. vivax, но мельче их. P. falciparum в начале болезни представлены лишь стадиями юных (кольцевидных) трофо- зоитов, в более поздний период обнаруживаются также гаметоциты. В толстой капле, как и в мазке, зрелые трофозоиты и шизонты выявляются обычно лишь в тяжелых случаях и служат не- благоприятными прогностическими признаками. Кольцевидные трофозоиты P. falciparum часто сохраняют свою обычную форму, но иногда деформируются и разрываются. В этих случаях видна красная точка (ядро) и лежащий рядом маленький комочек цитоплазмы. Гаметоциты, как правило, сохраняют ту же характерную форму, что и в мазке; лишь те из них, которые видны в поперечном сечении или под углом, имеют овальную или округлую форму. Однако наличие гру- бых коричневых зерен пигмента, собранных в кучку, и ободка цитоплазмы вокруг них позволяет и в этих случаях распознать макрогаметоцит. У микрогаметоцита пигмент представлен единич- ными грубыми зернами, и диагностировать его труднее. P. ovale в препаратах капли на стадиях юного (кольцевидного) и зрелого трофозоитов сходны с P. malariae. Отличие возбудителей малярии типа трехдневной заключается в том, что они нередко лежат на фоне дисков стромы эритроцитов, слабо окрашенных в бледно-розовый цвет с глыбками зернистости, которая более заметна в краевой, быстрее высыхающей зоне пре- парата, где скорее прекращается гемолиз. |