Методические указания для студентов лечебного факультета Томск. 2022 с. Методические указания подготовили Филинюк О. В., Колоколова О. В., Буйнова Л. Н
 Скачать 4.06 Mb.
|
|
Классификация лекарственной устойчивости МБТ Лекарственная чувствительность – это восприимчивость микроорганизмов к содержанию в питательной среде лекарственных препаратов; Первичная лекарственная устойчивость – это устойчивость МБТ к ПТП, которая обнаружена у впервые выявленных больных, которые никогда не принимали противотуберкулезную терапию. Вторичная лекарственная устойчивость (приобретенная) – резистентность МБТ, которая обнаружена у больных, которые принимали ПТП больше 1 мес. Монорезистентность – это устойчивость микобактерии туберкулеза только к одному противотуберкулезному препарату; Полирезистентность – это устойчивость микобактерии туберкулеза к двум и более противотуберкулезным препаратам кроме одновременной устойчивости к изониазиду и рифампицину; Устойчивость к изониазиду – это лекарственная устойчивость микобактерии туберкулеза к изониазиду независимо от лекарственной устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам, определенная любым методом определения лекарственной чувствительности; Устойчивость к рифампицину – это лекарственная устойчивость микобактерии туберкулеза к рифампицину независимо от лекарственной устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам, определенная любым методом определения лекарственной чувствительности; Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) – это устойчивость микобактерии туберкулеза одновременно к изониазиду и рифампицину независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам; Пре-широкая лекарственная устойчивость (пре-ШЛУ) – это устойчивость микобактерии туберкулеза к рифампицину с устойчивостью к изониазиду или без нее, в сочетании с устойчивостью к любому фторхинолону; Широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ) – это устойчивость микобактерии туберкулеза к рифампицину с устойчивостью к изониазиду или без нее, в сочетании с устойчивостью к любому фторхинолону и, по крайней мере, к линезолиду или бедаквилину; МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Цель этиологической диагностики туберкулеза является: – верификация диагноза туберкулез; – выявление эпидемиологически опасных больных туберкулезом – бактериовыделителей; – определение лечебной тактики (по тесту лекарственной чувствительности); – оценка эффективности лечения и прогноза; – для эпидемического контроля за туберкулезом в регионе, стране. Обследованию с целью диагностики туберкулеза органов дыхания подлежат пациенты, имеющие кашель с мокротой, или другие пациенты при наличии соответствующей клинико- рентгенологической картины и после консультации фтизиатра, в том числе выявленные при скрининговом рентгенологическом обследовании органов грудной клетки. При ТБ легких, наиболее распространенной и эпидемически опасной форме заболевания, доступным и часто исследуемым диагностическим материалом является мокрота. При подозрении на другие формы ТБ органов дыхания или при невозможности собрать мокроту у пациента с подозрением на ТБ легких, могут исследоваться и другие виды диагностических материалов (промывные воды бронхов, аспирационный материал, БАЛ, браш-биоптат, биоптат, экссудат и др.). Собранные образцы должны быть немедленно отосланы в соответствующую лабораторию. Если такой возможности нет, материал сохраняют в холодильнике при температуре воздуха 4-10° С. Если лаборатория расположена в отдалении от учреждения здравоохранения, доставку материала для исследований осуществляют 1 или 2 раза в неделю. Для этого должны использоваться специальные контейнеры. Контейнеры должны быть прочными, устойчивыми к разрушению, иметь широкую горловину с герметически завинчивающейся пробкой, чтобы предотвратить случайное вытекание из нее содержимого. При сборе образцов риск инфекции очень большой, особенно когда больной выкашливает мокроту, в связи с этим процедуру необходимо проводить как можно дальше от посторонних лиц и в специальном помещении/кабине. Мокроту пациенты с подозрением на туберкулез собирают трижды, после соответствующего туалета полости рта. Первая и вторая пробы мокроты должны быть получены в день обращения пациента в медицинских организациях с интервалом 2-3 часа. Третья проба мокроты должна быть получена на следующий день утром, до приема пищи. При невозможности получения третьей пробы на следующий день допускается получение ее первый день, с интервалом 2-3 часа после второй пробы. В медицинских организациях должны быть соблюдены санитарно-эпидемиологические правила сбора мокроты (наличие отдельного помещения, вентиляции, индивидуальных средств защиты медперсонала); сбор мокроты проводится после проведения инструктажа пациента, под непосредственным наблюдением обученного методике сбора диагностического материала медперсонала. У нетранспортабельных пациентов забор мокроты производит участковая медсестра поликлиники на дому в стерильную посуду и доставляет в бактериологическую лабораторию. Методы микроскопии Диагностическая чувствительность метода микроскопии обычно составляет не более 50% от всех больных ТБ легких, однако если говорить о наиболее инфекционно-опасных больных (у которых бактериовыделение подтверждено культуральным методом), диагностическая чувствительность метода микроскопии в этом случае достигает 90%. Рис. Этапы окраски мазка мокроты по Цилю-Нильсену на выявление КУМ Микроскопия не позволяют дифференцировать МБТ от НТМБ. В настоящее время методы микроскопии, обладающие относительно невысокой чувствительностью, сохраняют, тем не менее, свою актуальность, так как позволяют быстро и с минимальными финансовыми затратами выявлять наиболее эпидемически значимых больных ТБ и оценивать массивность бактериовыделения. Методы микроскопии в обязательном порядке включаются во все схемы обследования пациентов в связи с необходимостью определения статуса бактериовыделения согласно классификатору заболеваний и дальнейшему диспансерному наблюдению пациента или при необходимости его целевой госпитализации в специализированное отделение противотуберкулезных учреждений. Бактериоскопический метод имеет свои разновидности: простая/световая бактериоскопия по Циль-Нильсену и люминесцентная микроскопия или светодиодная LED-микроскопия. Этапы окраски по Циль-Нильсену: Фиксируют мазок на предметном стекле в пламене горелки. Наносят на мазок раствор карболового фуксина, нагревают, а затем экспонируют в течение 5 минут. Прополаскивают мазок в проточной воде, затем наносят обесцвечивающий раствор (3% солянокислый спирт или 25% серную кислоту) и выдерживают 3 минуты, затем смывают. На этом этапе происходит обесцвечивание мазка, однако МБТ благодаря своей спирто- и кислотоустойчивости свой краситель удерживают и остаются розово-красными. Для контрастирования докрашивают мазок раствором метиленового синего, затем промывают и высушивают. Рис. Виды микроскопии, градация результатов микроскопий. Кислотоустойчивые микобактерии (КУМ) окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие микробы клеточные элементы – в голубой цвет. МБТ под микроскопом имеют вид продолговатых палочек, розового цвета на синем фоне. На окрашивание затрачивается 20-30 минут. Метод простой и дешевый, но малоинформативный, чтобы обнаружить МБТ в 1 см 3 мокроты должно быть около 50-100 тыс. МБТ, если же будет меньше, то МБТ не будут найдены (ложноотрицательный результат). Микроскопическое исследование проводят в 100 полях зрения. Результаты оценивают количественно. В случае отрицательного результата рекомендуется изучить еще 200 полей зрения. Необходимо помнить, что данным методом прокрашиваются не только МБТ, но и нетуберкулезные микобактерии, в связи с чем, возможны ситуации выявления у пациента КУМ бактериоскопически при отсутствии их роста на питательных средах (таких случаев не более 1%). В связи с этим, бактериоскопический метод диагностики туберкулеза имеет свои преимущества и недостатки. Микроскопия патологического материала (мокроты, других патологических материалов) по Цилю- Нильсену применительно только в учреждениях первичного звена здравоохранения (поликлиники, стационары муниципальных и областных учреждений здравоохранения) куда обращаются пациенты с проявлениями (жалобами), схожими с туберкулезом. В медицинских организаций фтизиатрического (специализированного) профиля субъектов РФ в качестве основного метода микроскопического исследования рекомендуется применять методы люминесцентной микроскопии. В основу метода люминесцентной микроскопии включена окраска МБТ флюорохромами (аурамин, родамин и др.), которые также связываются воскоподобными структурами микробной клетки и светятся в ультрафиолетовых лучах, где в качестве источника излучения может использоваться светодиодный излучатель (LED). LED (lightemitteddiode – светоизлучающие диоды) технологии позволяют конвертировать обычный световой микроскоп во флюоресцентный, увеличивая и улучшая технические возможности люминесцентной микроскопии. Основное преимущество люминесцентной микроскопии перед микроскопией с окраской по Цилю-Нильсену состоит в экономии времени, затрачиваемого на просмотр препарата, за счёт использования меньших увеличений объектива и, соответственно, возможности просматривать большую площадь мазка в поле зрения. Диагностическая чувствительность микроскопии с окраской люминесцентными красителями в среднем на 10% выше, чем микроскопии с окраской по Цилю-Нильсену, однако метод люминесцентной микроскопии требует значительной технической компетенции, а также более высоких капиталовложений и расходов. Культуральные методы Культуральные методы диагностики (методы посева диагностического материала на питательные среды с последующей идентификацией выросших микроорганизмов) являются основными методами выделения МБТ (золотой стандарт ВОЗ). Их специфичность превышает специфичность микроскопических методов, а предел обнаружения значительно выше: он позволяет выявить МБТ при наличии в 1 мл исследуемого диагностического материала от 10 до 100 жизнеспособных микроорганизмов. С помощью культурального метода удается выявить на 20-40% больше случаев ТБ с бактериовыделением по сравнению с методом микроскопии среди впервые выявленных больных. Культуральный метод позволяет выделить культуру возбудителя, определить ее видовой принадлежность (МБТК и МБНТК) и определить лекарственную устойчивость (ЛУ). Наиболее часто используют следующие питательные среды: Левенштейна-Йенсена, Финн-2 (плотные/твердые питательные среды). Перед посевом на питательные среды проводят обработку патологического материала для уничтожения сопутствующей микрофлоры (деконтаминация), так как она быстро даст рост на питательной среде и ингибирует медленно делящиеся МБТ. В зависимости от материала, степени его гомогенности и загрязнённости для предпосевной обработки используют различные деконтаминанты (N-ацетил-l-цистеин и гидроокись натрия - NALC-NаOH (N-ацетил-l-цистеин деконтаминирующих свойств не оказывает, а используется только для разжижения образцов мокроты, 10% раствор трехзамещенного фосфорнокислого натрия (Na3PO4)). После предварительной обработки материал центрифугируют, за счёт этого осаждают микобактерии, повышают их содержание в осадке («обогащение осадка»). Полученный осадок подвергают нейтрализации, и засевают им (инокулируют) поверхность плотных питательных сред или пробирки с жидкими (полужидкими) средами. Из оставшейся части осадка готовят мазки для микроскопического исследования, так как микроскопическое и культуральное исследования нужно производить параллельно из одной и той же пробы диагностического материала. При использовании плотных сред инокулированные пробирки помещают в термостат при температуре 37С на 2 суток в горизонтальном положении. Это обеспечивает более равномерное всасывание материала в питательную среду. Через 2 суток пробирки переводят в вертикальное положение, и герметично закрывают резиновыми или силиконовыми пробками во избежание подсыхания засеянных сред. Посевы выдерживают в термостате при 37оС в течение 10-12 недель при регулярном еженедельном просмотре. Чувствительность данного метода составляет 80 – 85%, а специфичность – 98%. Рис. Колонии M.tuberculosis на среде Левенштейна-Йенсена. Окраска культуры МБТ по Цилю-Нильсену (благодаря корд-фактору МБТ сцепляются в виде кос) Посев материала на среду Левенштейна-Йенсена применяют для первичного выделения МБТ и определения его лекарственной чувствительности. Это плотная питательная среда на яичной основе. Вирулентные колонии выросших микобактерий имеют различные размеры, шероховатую поверхность и бледный кремовый оттенок, цвет слоновой кости (R-формы колоний). На других средах колонии микобактерий туберкулеза могут быть более влажными. После курса химиотерапии или в процессе лечения могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (S-формы колоний микобактерий). Средние сроки роста микобактерий на твердой среде составляют 25 – 30 дней, максимальные сроки роста – 8-12 недель (3 и более месяца!). Отрицательный результат посева выдается лабораторией по истечении максимальных сроков культивирования (90 дней). Длительность получения результатов исследований на основе классических метод выявления/культивирования микобактерий туберкулеза неблагоприятно сказывается на эффективности химиотерапии, особенно в связи с вероятностью неправильного выбора схемы химиотерапии при наличии ЛУ у возбудителя и риском расширения спектра устойчивости МБТ. Массивность бактериовыделения. Клиницистов интересует не только факт обнаружения МБТ, но и массивность бактериовыделения у пациента, что очень важно в эпидемиологическом отношении. При бактериологическом исследовании количественная оценка бактериовыделения производится методом подсчета числа колоний, выращенных в пробирках, и считается: – скудным – при количестве колоний от 1 до 20 (во всех пробирках); – умеренным – от 21 до 100 колоний; – массивным – когда обнаруживается рост 100 колоний и более или сплошной рост. Культивирование на жидкой питательной среде в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960 Культивирование на жидкой среде повышает выявление МБ примерно на 10% по сравнению с плотными средами. В настоящее время широко используются системы с автоматической детекцией учета роста МБТ, которые позволяют значительно ускорить получение результата. В медицинских организаций фтизиатрического профиля РФ преобладающей является автоматизированная система ВАСТЕС MGIT 960. Преимущества автоматизированной системы культивирования ВАСТЕС MGIT 960 перед культуральными исследованиями на плотных средах обеспечиваются высокой эффективностью стандартизованных и сертифицированных по ISO9001 производств реагентов и сред, а также поддержанием стандартных протоколов исследований. Рис. Автоматизированная система культивирования микобактерий: MGIT-BACTEC-960. В основе методики лежит изобретение индикаторной пробирки MGIT (mycobacteria growth indicating tube). Содержимое пробирки MGIT – это питательный бульон, благодаря которому достигается более эффективное выделение микобактерий и их ускоренный рост. Пробирка содержит 7 мл стерильного питательного бульона Мидлбрук 7Н9, которую перед использованием вносится обогатительная добавка для стимуляции роста МБТ. На дне пробирки содержится кислородозависимый флюорохромный краситель. Регистрацию ростамикроорганизмов осуществляют оптически. В ее основе лежит флюоресценция, возникающая при потреблении кислорода микобактериями в процессе роста. Кислородзависимый флюорохромный краситель содержится на дне специальной пробирки и покрыт слоем силикона. Размножение микобактерий приводит к уменьшению количества кислорода в пробирке и снижению его концентрации, что вызывает усиление флюоресценции, которая становится видимой при облучении и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор ВАСТЕС. Интенсивность свечения прямо пропорциональна уровню расходования кислорода и регистрируется в единицах роста (GU – growthunits). В среднем появление роста МБТ находится до 11 дней. Прибор оценивает пробу как отрицательную при отсутствии роста в течение шести недель (42 дня). Данные роста заносятся в компьютер, где их можно сохранить. Компьютерный анализ кривых роста может дать информацию о наличии различных пулов микобактерий, в том числе нетуберкулезных, а также помогает оценить ростовые свойства микобактерий. Рис. Пробирка MGIT. Молекулярно-генетические методы В 1983 году Кэри Мюллис с сотрудниками разработал метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР – метод амплификации, т.е. получения большого числа копий нужного гена или его фрагмента в условиях in vitro. Реакционная смесь для получения нужной ДНК содержит: исследуемую ДНК-матрицу, субстраты реакции – 4 дНТФ, 2 праймера, термостабильную Taq- полимеразу и реакционный буфер (кофактор – Mg 2+ ). Праймеры – это искусственно синтезированные короткие однонитевые ДНК (20 – 30 нуклеотидов), выполняющие функцию «затравок» при ферментативном синтезе ДНК. В ПЦР обычно используют 2 праймера, которые комплементарны 3'-концевым последовательностям амплифицируемого участка на обеих нитях ДНК-матицы соответственно. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых фрагментов ДНК. В один цикл ПЦР включается 3 этапа: Денатурация – исходная смесь нагревается до 94°С, при этом нити ДНК расходятся; Отжиг – на этом этапе Т реакционной смеси снижается до 52 – 60°С и происходит комплементарное связывание праймеров с нитями матричной ДНК; Полимеризация, в ходе которой Taq-полимераза катализирует удлинение праймеров (с 3'- конца) и синтез новых цепей ДНК. Температура смеси для проявления оптимальной активности Taq-полимеразы соответствует 72°С. Рис. Общая схема амплификации изучаемого фрагмента ДНК Рис. Анализатор-термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР в реальном времени) Эти этапы повторяются многократно в приборе – амплификаторе (термоциклере), что позволяет получить огромное количество копий нужного фрагмента ДНК. Так, в результате проведения 20 циклов ПЦР анализируемый участок ДНК амплифицируется более чем в миллион раз. Технологическая цепочка ПЦР на выявление ДНК МБТ: 1 этап. Выделение ДНК микобактерий. 2 этап. ПЦР-амплификация фрагментов генов микобактерий, для этих целей используют праймеры IS-элементов, IS-986 или IS-6110, поскольку данные элементы характерны только для МБТК. В большинстве тест-систем избран фрагмент ДНК IS6110, который в многочисленных штаммах МБТ имеет в геноме значительное число (10-20) повторов, что обеспечивает, наряду со специфичностью, высокую чувствительность анализа. 3 этап. Визуализация результатов гибридизации, при этом определяется принадлежность микобактерий к определенному виду. Выделение ДНК — это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: материал для исследования (мокрота, другие биологические жидкости кроме крови)подвергается специальной обработке с нагреванием до 92С. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. Амплификация ДНК. Для осуществления амплификации ДНК используются так называемые ДНК-праймеры — молекулы ДНК МБТ, на которые впоследствии будет происходить «клонирование» ДНК МБТ (IS-986 или IS-6110). В процессе детекции продуктов амплификации проходит разделение полученной смеси продуктов амплификации. К смеси добавляется специальные растворы, которые наделяют фрагменты ДНК МБТ способностью флюоресцировать — отражаться оранжево- красными светящимися полосами. Образующееся свечение выдает присутствие ДНК МБТ в забранном у пациента на ПЦР-анализ материале. В РФ в клинической практике для детекции ДНК МБТ используются следующие молекулярно-генетические методы: 1. ПЦР в режиме реального времени (Real-Time PCR), тест системы: Амплитуб- РВ, Амплитуб–МЛУ РВ (H и R), Амплитуб-ШЛУ РВ (Fq), Синтол, Россия. 2. Гибридизационная технология с использованием биочипов, тест-системы: БИОЧИП-1 (H и R), БИОЧИП-2 (Fq) ТБ-ТЕСТ (H, R, Fq, AG/CP, E) «БИОЧИП- ИМБ», Россия). 3. «Картриджная» технология (выделение ДНК и амплификация идут автоматически в специальном картридже, ЛУ к R), тест-система: GeneXpert MTB/RIF, Cepheid, США. 4. Метод молекулярной гибридизации с типоспецифичными зондами (LPA) Тест- системы: Geno Type MTBDRPlus (H и R); MTBDRs (Fq, AG/CP, E ), Hain’s Lifescience, Германия. ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в миллиарды раз. Заключение о наличии МБТ в диагностическом материале делается на основании выявления видоспецифичного генетического маркера (ДНК) МБТ или видоспецифичных белков-антигенов, а вывод о ЛУ - на основании выявления мутаций в целевых участках генов МБТ, ассоциированных с ЛУ. Биочипы состоят из массива гидрогелевых ячеек, содержащих олигонулеотидные зонды, специфичные к последовательностям микобактериального генома. Процедура анализа включает мультиплексную амплификацию и флуоресцентное маркирование фрагментов генома микобактерий с последующей гибридизацией полученных ПЦР-продуктов на биочипе. LPA (LineProbeAssay) - гибридизации проб с ДНК-зондамина мембранах (стрипах), позволяет определять ДНК МБТ в мокроте и, кроме того, четыре наиболее часто встречающиеся мутации в гене rpoB (устойчивость к рифампицину) и генах katG и inhA (устойчивость к изониазиду) – MTBDRplus («HainLifescience», Германия). LPA позволяет определять чувствительность к противотуберкулезным препаратам 1-го ряда (изониазид (H) и рифампицин (R), т. е. производить детекцию МЛУ МБТ. В настоящее время внедрена система (GenoTypeMTBDRsl), которая позволяют определить ЛУ к фторхинолонам (Fq) (ген gyrA), аминогликозидам/циклопептидам (AG/CP ) (ген rrs) и этамбутолу (E). Такие тесты позволяют выявить пациентов с широкой лекарственной устойчивостью. Время исследования составляет 1–2 рабочих дня. GeneXpert. Одной из инновационных технологий, основанных на ПЦР в режиме реального времени, является использование анализатора Xpert MTB/RIF (Cepheid, США). Этим оборудованием оснащены многие противотуберкулезные учреждения РФ. Она упрощает молекулярное тестирование, обеспечивая полную интеграцию и автоматизацию трех процессов (подготовка образца, амплификация и детекция), необходимых для молекулярного тестирования. В его основе также лежит амплификация участка 16S rRNA и гибридизация с олигонуклеотидной последовательностью, специфичной для M.tuberculosiscomplex. Молекулярные маяки, которые нацелены на ген «rpoB», охватывают все мутации, обнаруженные в >99,5 % штаммов, устойчивых к рифампицину. Образцы материала человека основном могут быть взяты из мокроты, промывных вод бронхов, мочи, плеврального экссудата, ликвора. Время пробоподготовки составляет 40 минут и выполнение самого анализа 2 часа. В результате мы получаем 2 ответа: первый - есть ли в материале ДНК МБТ и второй - имеется ли устойчивость МБТ к рифампицину, которая расценивается как маркер МЛУ- штаммов (резистентность к рифампицину в 98% совпадает с устойчивостью к изониазиду). Данная методика позволяет с первых дней назначить адекватную химиотерапию (режим лечения МЛУ ТБ), и распределить потоки поступающих больных в противотуберкулезный диспансер и направить в специализированные отделения (с лекарственно-устойчивым туберкулезом). При работе системы GeneXpert необходимы минимальное число ручных операций и специализированных знаний. Пользователь просто добавляет биологический образец для тестирования в картридж, ставит его на борт прибора, и система GeneXpert автоматически запускает цикл реакций ПЦР. Прибор GeneXpert компактен и удобен, может быть установлен вне лаборатории. Малые размеры прибора и незначительные потребности в энергии позволяют системе работать практически в любом помещении. Настольный ПК или ноутбук используется для выполнения программного обеспечения и хранения базы данных, содержащей результаты работы системы GeneXpert. Программное обеспечение позволяет выбирать описания тестов, контролировать процесс тестирования, просматривать результаты теста и экспортировать данные для анализа в приложениях сторонних разработчиков. Программное обеспечение также используется для архивирования результатов, извлечения данных из архива и управления базой данных. Сканер штрих-кодов ускоряет ввод данных, а также снижает вероятность возникновения ошибки при вводе данных. В обновленном руководстве ВОЗ по лабораторной диагностике туберкулеза (2021), данная методика в виду высокой чувствительности и специфичности заменяет микроскопию и определяет первостепенную необходимость в последовательности лабораторного обследавния больного с подозрением на туберкулез. Рис. Анализатор Xpert MTB/RIF . Подготовка образцов к проведению теста Определение лекарственной устойчивости МБТ к ПТП В современных условиях для выявления лекарственной устойчивости МБТ к ПТП используют микробиологические и молекулярно-генетические методы. Цель микробиологических методов исследования лекарственной чувствительности МБТ к ПТП состоит в том, чтобы определить отличается ли клинический изолят от «дикого» штамма МБТ по степени чувствительности к соответствующему антимикробному агенту. При оценке результата микробиологического исследования культура МБТ признаётся устойчивой, если микобактерии дают рост на питательной среде в присутствии критической концентрации заключённого в неё противотуберкулёзного препарата. Метод абсолютных концентраций на плотной питательной среде Левенштейна- Йенсена, основанный на добавлении в культуральную среду определенных стандартных концентраций противотуберкулезных препаратов, которые принято называть критическими при расчете на мкг/мл. Критическая концентрация – это самая низкая концентрация, которая подавляет рост 95% «диких» штаммов МБТ. Для каждой среды или системы культивирования подобраны соответствующие критические концентрации препаратов. Культура МБТ считается чувствительной к той или иной концентрации противотуберкулезного препарата, которая содержится в среде, если число колоний МБТ, выросших в одной пробирке с тем или иным ПТП, не превышает 20, а посевная доза соответствует 10 7 микробных тел. Модифицированный метод пропорций в жидкой питательной среде в системе с автоматизированным учетом роста микроорганизмов типа BACTEC MGIT 960. В процессе определения происходит сравнение скорости роста МБТ - в контрольной пробирке и в пробирках с лекарственными препаратами. В первую пробирку не вносится лекарственный препарат - контрольную, в остальные пробирки добавляются известные концентрации тестируемых лекарственных препаратов, рост в которых сравнивается с ростом в контрольной пробирке. Если тестируемый лекарственный препарат активен по отношению к выделенным МБТ, он будет ингибировать рост и подавлять флюоресценцию, при этом в контрольной пробирке рост не ингибируется и, соответственно, уровень флюоресцентности в данной пробирке будет выраженный. Мониторинг роста осуществляется при помощи прибора BACTEC MGIT 960/320, который автоматический интерпретирует результаты на наличие чувствительности или резистентности МБТ к препарату. На плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена проводят определение ЛЧ МБТ методом абсолютных концентраций к ПТП первого ряда (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол). На жидких питательных средах проводят определение ЛЧ МБТ к ПТП первого ряда (изониазид, рифампицин, этамбутол, стрептомицин, пиразинамид) и к ПТП второго ряда (амикацин, канамицин, офлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, этионамид, протионамид, капреомицин, аминосалициловая кислота, бедаквилин, линезолид). Молекулярно-генетические методы определения лекарственной устойчивости МБТ Огромное значение для разработки ускоренных методов ПЦР-диагностики лекарственной устойчивости МБТ явилось установление генов, «ответственных» за ее формирование. Так, полностью изучен процесс активации изониазида, являющегося пролекарством, который внутри микробной клетки под действием фермента каталазы- пероксидазы превращается в активную форму, способную ингибировать синтез миколовых кислот. Синтез каталазы-пероксидазы кодирует ген katG, мутации в котором ведут к потере каталазной активности микобактерий, а следовательно – к лекарственной резистентности. Вероятность встречаемости таких особей составляет в данный момент 47 – 58%. Еще два механизма развития устойчивости к изониазиду, связаны с мутациями генов inhA (вероятность встречаемости 21 - 34%) и ahpC (вероятность встречаемости 10 – 15% случаев), которые кодируют ферменты, участвующие в инактивации промежуточного активного продукта изониазида. Доказано также, что развитие устойчивости к рифампицину в 96 – 98% случаев происходит в результате мутаций в гене rpoB (РНК-полимеразы), что ведет к снижению способности фермента РНК-полимеразы связываться с рифампицином. Наиболее частым у большинства микроорганизмов механизмом развития устойчивости к стрептомицину, является ферментативная инактивация. Однако у М.tuberculosis этот путь развития резистентности не имеет значения. В 52 – 59% устойчивость развивается за счет мутаций в гене rpsL, кодирующем белок малой рибосомальной субъединицы S12, и в 8 – 21% случаев за счет мутаций в гене rrs (кодирует 16S рРНК). В результате таких мутаций изменяется структура рибосом и снижается проницаемость внешних структур микробной клетки. У 50% резистентных к этамбутолу изолятовМ.tuberculosis определяется кластер генов emb. Установлено, что повышенный уровень экспрессии этой области, выявляемый у этамбутолрезистентных штаммов, ведет к повышению содержания ферментов, необходимых для синтеза арабинана клеточной стенки. Наиболее эффективными методами диагностики ЛУ МБТ признаны методы, основанные на гибридизации с ДНК-зондами (LPA), в частности, GenoTypeMTBDRplus, GenoTypeMTBDRsl и INNO-LiPARif TB Assay (гибридизационные технологии). С помощью ДНК-зондов выявляют наличие мутаций, свидетельствующих о наличии ЛУ МБТ в тестируемом материале. Обычно в тесте используют не один, а несколько зондов: зонд для выявления M. Tuberculosis complex + н-р, зонд для выявления мутации в гене rpoB (свидетельствующих о наличии ЛУ к рифампицину). Устойчивость к рифампицину является маркером множественной лекарственной устойчивости микобактерий, поскольку, в соответствии с данными литературы, резистентность к рифампицину у 80-90% штаммов МБТ коррелирует с устойчивостью к изониазиду. Это позволяет выявить и изолировать пациентов с МЛУ-туберкулезом. Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени. Метод ПЦР в режиме реального времени позволяет определять мутации, ассоциированные с ЛУ к рифампицину, изониазиду. Преимуществом данного метода перед описанными выше является отсутствие этапа гибридизации и оценка результатов в режиме реального времени, что позволяет снизить возможность кросс-контаминации образцов. Однако, для получения информации, сравнимой с гибридизационными технологиями, необходимо проведение большего числа циклов анализа. Использование зарегистрированных наборов позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью (94 % и 99 %, соответственно) выявлять мутации в генах rpoB, katG и inhA, ассоциирующиеся с устойчивостью к рифампицину и изониазиду. «Картриджная» технология (выделение ДНК и амплификация идут автоматически в специальном картридже в системе GeneXpert). Использование этой системы позволяет непосредственно из нативной мокроты в очень короткие сроки (в течение 2,5 часов) одновременно проводить выявление ДНК МБТ и с высокой достоверностью определять устойчивость к рифампицину. Дифференциация (типирование) микобактерий Необходимо отличать микобактерии туберкулеза от сапрофитных микобактерий, которые определяются в 0,3-3% культур. Кислотоустойчивые сапрофитные микобактерии можно выделить как из внешней среды, так и из материала здорового человека, а также и из патологического материала. Присутствие сапрофитных микобактерий в мокроте, слюне, промывных водах желудка и бронхов, моче, кале и т. д. может быть не связано с наличием заболевания и служить источником серьезных диагностических ошибок. Обнаружение кислотоустойчивых сапрофитов в мокроте больных может привести к ошибочному диагнозу туберкулеза. Идентификация микобактерий по культуральным свойствам. Первичную идентификацию МБТ проводят по результатам культуральных тестов. В посевах на плотных питательных средах МБТ растут в виде сухих, морщинистых R-колоний (от английского слова rough - грубый, шершавый). Выросшие колонии не пигментированы и имеют кремовый цвет или цвет слоновой кости. После курса химиотерапии от больных туберкулезом могут выделяться гладкие влажные колонии, так называемые S-формы (от английского слова smooth-гладкий). Рост пигментированных колоний свидетельствует о наличии нетуберкулезных микобактерий, что требует дополнительных методов идентификации. Идентификация микобактерий с помощью биохимических тестов. Дифференциация микобактерий туберкулезного комплекса и нетуберкулезными видами микобактерий основана на их культуральных свойствах и способности к росту на дифференциально-диагностических средах. Иммунохроматографический метод идентификации выросших культур микроорганизмов, основанный на определении наличия специфического антигена МБТ МРТ64, отличается простотой выполнения и позволяет получить результат идентификации МБТ за 15 минут. Диагностические набор представляет собой одностадийный иммунохроматографический тест, который используется после культивирования МБТ в жидкой или на плотной питательных средах. Для качественного определения антигена МБТ МРТ64 используют мышиные моноклональные антитела. Диагностические наборы, это мембранные стрипы, на которые нанесены 2 полосы: моноклональные антитела мыши к антигену МРТ64 (тестовая полоса «T») и антитела козы к иммуноглобулинам G мыши (контрольная полоса «C») (выпускаются с системой ВАСТЕС MGIT 960/320). Рис. Иммунохроматографический тест на основе выявления белка MPT64 До внесения образца (100 мкл жидкой культуральной среды или конденсата со скошенной агаровой (плотной) питательной средой, полученной путем культивирования образца мокроты), обе линии в окне результатов не видны. Контрольная линия «С» используется в качестве контроля правильности проведения анализа. Она должна проявляться всегда, если процедура выполнена правильно и если реагенты контрольной линии находятся в рабочем состоянии и пригодны для анализа. При добавлении образца в окно для образцов, антиген МРТ64 реагирует с конъюгатом моноклональных антител мыши к МРТ64 и коллоидного золота, образуя комплекс «антиген-антитело». Этот комплекс в процессе реакции мигрирует вдоль стрипа до тестовой зоны (окно кассеты Т), где связывается с моноклональными антителами мыши к МРТ64, сорбированным на тестовой полосе, и формирует видимую глазом окрашенную полосу. Если в образце содержится достаточное количество антигена МРТ64, то тестовая линия «T» приобретает видимое глазом фиолетовое окрашивание, в противном случае тестовая линия остается неокрашенной. Наиболее эффективными молекулярно-генетическими методами идентификации нетуберкулезных микобактерий являются методы, основанные на гибридизации проб с ДНК-зондами (LineProbeAssay, LPA), а таже с помощью секвенирования, MALDI-ToF масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), тонкослойной хроматографии, результаты которых основаны на выявлении уникальных для каждого вида МБ структур. ЗАДАНИЯ, КОТОРЫЕ ВЫПОЛНЯЮТСЯ ПРИ ПОДГОТОВКЕ К ЗАНЯТИЮ 1. В тетради для СРС цветными карандашами нарисуйте возбудителя туберкулеза, дифференцируя строение. 2. Заполните таблицу, определяя особенности возбудителя туберкулеза. Особенности МБТ Характеристика Химический состав Вирулентность Патогенность Кислото-, спирто-, щелоче устойчивость Изменчивость Тип дыхания Жизнедеятельность в среде (в мокроте, уличной пыли, воде, почве, воздухе) 3. Заполните таблицу. Составьте список минимум из двух преимуществ методов для выявления КУМ/МБТ в каждом столбце. Одно и то же преимущество может быть представлено в нескольких столбцах (более 3-х преимуществ). Микроскопия МГМ Посев на плотные среды Посев на жидкие среды 1 1 1 1 |