Методические указания для студентов лечебного факультета Томск. 2022 с. Методические указания подготовили Филинюк О. В., Колоколова О. В., Буйнова Л. Н
 Скачать 4.06 Mb.
|
|
ТЕМА: ЭТИОЛОГИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ 1. Этиология туберкулеза. Микобактерии туберкулеза (МБТ): морфологическое строение, химический состав, ферментативная активность, размножение. Патогенность и вирулентность микобактерий. Виды микобактерий и их дифференциация. 2. Нетуберкулезные микобактерии их классификация. 3. Микробиологическая и молекулярно-генетическая диагностика туберкулеза: методы обнаружения МБТ в патологическом материале, 4. Информативность различных лабораторных методов выявления МБТ: бактериоскопия, бактериологические и молекулярно-генетические. 5. Определение критерия бациллярности и массивности бактериовыделения по данным лабораторных исследований у пациентов с туберкулезом легких и их значения и цель. 6. Лекарственная устойчивость МБТ к противотуберкулезным препаратам (ПТП), клиническое значение, классификации, критерии диагностики. Механизмы развития лекарственной устойчивости микобактерий. Начальная (первичная) и приобретенная (вторичная) лекарственная устойчивость. Множественная и широкая лекарственная устойчивость микобактерий, ее эпидемиологическое и клиническое значение. По ссылки https://online.ssmu.ru пройдите в Раздел 1. Основы фтизиатрии и в 3.1 Лабораторные методы исследования. ЭТИОЛОГИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА Возбудителем туберкулеза являются микобактерии туберкулеза (МБТ), которые в 1882 г. открыл Роберт Кох. Классификация микобактерий Домен: Baсteria; Отдел: Актиномицеты; Порядок: Actinomycetales; Подпорядок: Corynebacterineae; Семейство: Mycobacteriaceae; Род: Mycobacterium. Среди известных в природе множества микобактерий по способности вызывать заболевание различают: – безусловно патогенные – Micobacterium (М.) tuberculosis, M africanum и M. bovis, которые вызывают туберкулез человека и крупного рогатого скота, M. leprae - возбудитель заболевания проказы; – условно-патогенные (или атипичные) – при определенных условиях могут вызвать заболевания человека: M. avium, M.intracellulare, M. kanssasii, M. malmoense, – сапрофиты – свободно живут в окружающей среде и, как правило, не опасны для человека: M. terrae (выделенная из почвы (земли)), M. phlei (найдена на траве тимофеевке), M. gordonae/aqual (выделена из водопроводной воды), а также M. triviale, M. flavescens, M. gastri. Микобактерии, вызывающие туберкулез (7 видов), объединены в комплекс M. tuberculosis, включающий (МБТК, рубрика «А15-19» в МКБ 10,11): • М. Tuberculosis (98% в РФ), • M. africanum, • M. bovis, • M. microti, • M. canettii, M. caprae и M. pinnipedii (крайне редко). Между данными видами высокое сходство на уровне ДНК >99%; но существуют различия по биохимическим/фенотипическим свойствам, географической распространенности и важности для заболеваемости ТБ человека Остальные микобактерии, вызывающие различные микобактериозы, отнесены к группе нетуберкулезных микобактерий. Из этой группы выделяют следующие комплексы: • М. Avium (МАС – комплекс), состоящий из М. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum; • M.fortuitum(MFC – комплекс) включающий подвиды M.fortuitum и М. chelonae, и • М. Terrae (МTC – комплекс), включающий М. terrae, M. triviale и М. nonchromogenicum. • Важнейшие группы составляют возбудители проказы М. leprae, а также возбудители язвенных поражений Buruli M. Ulcerans. Нетуберкулезные микобактерии (НТМБ) – это сапрофитные и условно-патогенные микобактерии. Заболевания человека, вызванные нетуберкулезными микобактериями, называются микобактериозами (рубрика «А 31» в МКБ 10, 11), которые по клиническому течению и рентгенологическим признакам схожи с туберкулезом. Возбудители микобактериозов обычно естественно первично устойчивы к большинству антибиотиков и противотуберкулезных препаратов. Их, как правило, обнаруживают бактериологическими исследованиями по виду, характеру роста, скорости роста колоний, пигментообразованию и т.д., и классифицируют по группировке Раньона (1959 г.) на четыре группы (1 – фотохромогенные, 2 – скотохромогенные, 3 – непигментные, 4 – быстрорастущие). Фотохромогенные - образуют пигмент лимонно-желтого цвета при росте на свету. Скотохромогенные - образуют пигмент оранжево-желтого цвета при инкубировании в темноте. Нефотохромогенные - пигмента не образуют (независимо от наличия света), иногда культуры имеют светло-желтоватую окраску. Люди, больные микобактериозами не опасны (нет передачи от человека к человеку), так как резервуар инфекции окружающая среда. В связи с этим данные заболевания не вызывают туберкулез и больные наблюдаются и лечаться в общей лечебной сети и изучаются во фтизиатрии в вопросах дифференциальной диагностики. Микобактерии туберкулезного комплекса (МБТК) (вызывающие туберкулез) имеют продолговатый палочковидый вид длиной 1-6 мкм и шириной 0,2-0,5 мкм, неподвижные, имеют большой полиморфизм. Размножение происходит в основном путем простого клеточного деления. Споры и капсулы не образуют. Растут медленно, оптимальная температура роста 37- 38°С. Удвоение МБТ наступает через 20-24 часов. При снижении температуры к 29°С, или повышении к 45°С рост МБТ прекращается. За ростовыми свойствами выделяют МБТ, которые растут быстро или медленно и МБТ, что находятся в латентном состоянии. Электронно- микроскопическое исследование МБТ позволило дифференцировать в них микрокапсулу, многослойную клеточную мембрану, цитоплазму с органеллами (гранулы, вакуоли, рибосомы) и ядерную субстанцию (нуклеотид). Отличительным свойством МБТ является химическая устойчивость, которая проявляется в способности сохранять окраску даже при интенсивном обесцвечивании кислотами, щелочами и спиртом, что обусловлено высоким содержанием в клеточных стенках МБТ миколевой кислоты (С88Н17604), липидов и белков. Микрокапсула состоит из полисахаридов и играет важную роль в жизнедеятельности МБТ, в том числе придает им устойчивость к неблагоприятным воздействиям внешней среды. Толстая клеточная стенка, насыщенная липидами, ограничивает клетку снаружи, обеспечивая механическую и осмотическую защиту. Стенка МБТ состоит из четырех слоев. Первый, внутренний, слой образован пептидогликаном; последующие слои включают в себя миколевые кислоты, гликолипиды, воск и корд-фактор, связывающий отдельные клетки в косы и оказывающий токсическое действие на макрофаги при фагоцитозе. Миколевые кислоты представляют собой уникальные альфа-разветвленные липиды, найденные в клеточных стенкахмикобактерий и Corynebacterium. Они составляют 50% от сухого веса микобактериальной клеточной оболочки. Миколевые кислоты являются сильными гидрофобные молекулы, образующие липидный оболочку вокруг организма и влияют на свойства проницаемости клеточной поверхности. Они предотвращают атаку микобактерий катионными белками, лизоцимом и кислородными радикалами в фагоцитарной грануле. Они также защищают внеклеточные микобактерии от осаждения комплемента в сыворотке крови. Кроме того, данный состав клеточной стенки определяет устойчивость МБТ к воздействию кислот и щелочей, а также высокую гидрофобность клетки в целом. Цитоплазма МБТ состоит из гранул и вакуолей различной величины. Основная часть мелкогранулярных включений представлена рибосомами, на которых синтезируется специфический белок. Ядерная субстанция МБТ определяет специфические свойства клетки, важнейшими из которых являются синтез белка и передача наследственных признаков потомству. Для нормального развития МБТ нуждаются в кислороде, поэтому их относят к облигатным аэробам. Потребление кислорода микробной клеткой связано с окислительно- восстановительными процессами в тканях макроорганизма. При формировании гранулем размножение МБТ из-за снижения в них парциального давления кислорода (Р02) замедляется, однако имеются сведения, что некоторые виды МБТ можно рассматривать, как факультативные анаэробы. Рост культур МБТ в обычных условиях в тканях организма и на питательных средах происходит в основном путем простого деления клетки или более сложным циклом деления микробной особи – почкованием. Одним из возможных, но еще не доказанных способов размножения МБ, считается спорообразование, что роднит их с актиномицетами. Важно подчеркнуть, что размножение МБТ происходит медленно, цикл простого деления материнской клетки на две дочерние занимает от 20 до 24 часов, а поэтому видимый рост колоний МБТ на поверхности твердой питательной среды можно обнаружить не ранее 12-20 дней (2-3 недели). При культивировании МБТ на питательных средах надо учитывать, что они: – являются строгими аэробами (поэтому при искусственном выращивании культуры МБТ необходимо стремиться к максимальной аэрации культуры); – чувствительны к pH среды. Оптимальной кислотностью среды является pH 6,8-7,2 (диапазон роста МБТ 5,5-8,0 pH, но растут очень медленно); – оптимальной температурой для размножения и роста колоний МБТ на питательной среде является температура 37-38С (температурный диапазон 29-42С). Подобные благоприятные для размножения условия МБТ находят в лимфе инфицированного больного, поэтому они характеризуются лимфотропностью. В 1998 г. завершена расшифровка генома микобактерий туберкулеза., который состоит из 4 411 529 пар нуклеотидов, большая часть представлена (66,5%) гуанином и цитозином. Геном МБТ чрезвычайно консервативен. ДНК других видов микобактерий гомологичны МБТ лишь на 4–26%. Многие ключевые обменные процессы и ферментативные системы дублируются несколькими генами (устойчивость ко многим лекарственным препаратам). МБТ синтезируют все необходимые для своего обмена компоненты (незаменимые аминокислоты, витамины, ферменты и кофакторы). Гены способны производить белковые продукты, ответственные за проникновение внутрь клеток хозяина и внутриклеточное существование. В естественных условиях МБТ устойчивые к факторам внешней среды и сохраняют жизнеспособность в течение нескольких месяцев. В жидкой среде МБТ погибают при кипячении через 5 минут, а в сухой мокроте при температуре 100° С – через 45 минут. Под воздействием солнечных лучей они погибают через 1-2 минуты, а в мокроте – через 4 часа. Под воздействием дезинфицирующих средств (хлорамин, пюржавель, жавелион, дезоксон-14, клорсепт и т.д.) МБТ погибают через 3-5 часов. Под воздействием неблагоприятных условий и противотуберкулезных препаратов МБТ способны к изменчивости: они трансформируются в более стойкие, не чувствительные к этим условиям формы (фильтрующиеся, L- формы) – персистенция МБТ, но при благоприятных условиях они способны к реверсии – приобретать классическую форму МБТ с патогенными свойствами. Патогенность – основной видовой признак МБТ - возможность МБТ вызвать заболевание. Главныйфактор патогенности - токсичный гликолипид (трегалоза-6,6- ди-миколат корд-фактор). Корд-фактор обусловливает токсическое действие на ткани и защищает МБТ от элиминации. Вирулентность – степень патогенности; возможность роста и размножения микобактерий в определенноммакроорганизме и способность вызвать специфические патологические изменения в органах. Вирулентным считают штамм микобактерий, если он в дозе 0,1- 0,01 мг вызывает заболевание туберкулезом, а через 2 месяца - смерть морской свинки массой 250-300 г. Если после введения этой дозы животные умирает через 5-6 месяцев, то этот штамм считают слабовирулентным. У МБТ не выявлено каких-либо эндотоксинов, экзотоксинов или гистолитических ферментов. Их патогенное действие связано, главным образом, со способностью избегать губительного влияния макрофагов и вызывать реакции гиперчувствительности замедленного типа. Это обеспечивается 5 компонентами клеточной стенки МБТ. Первым таким компонентом является корд-фактор (фактор жгутообразования), «вынуждающий» МБТ расти in vitro в виде извитых жгутов. Вирулентные штаммы возбудителя имеют этот фактор на поверхности бактериальной клетки, а авирулентные штаммы им не обладают. Доказано, что введение очищенного корд-фактора подопытным мышам вызывает у них формирование типичных туберкулезных гранулем. Вторым компонентом считаются сульфамиды, представляющие собой серосодержащие гликолипиды бактериальной поверхности и присущие тоже только вирулентным штаммам. Они предупреждают слияние фагосом макрофагов, содержащих фагоцированные МБТ, с лизосомами. Третий компонент клеточной стенки — фактор, подавляющий активацию макрофагов – липоарабиноманнан (LAM-фактор). Он представляет собой главный гетерополисахарид, по строению сходный с эндотоксином грамотрицательных микробов и выполняющий функцию подавления ИФН-γ. LAM обеспечивает также выработку макрофагами ФНО-а, вызывающего лихорадку, снижение массы тела и повреждение тканей, а также выработку интерлейкина-10, тормозящего пролиферацию Т-лимфоцитов. Четвертым компонентом является высокоиммуногенный белок теплового шока с молекулярной массой 65 кДа. Этот белок возбудителей туберкулеза, по строению сходный с белками теплового шока человека, возможно, играет определенную роль в развитии аутоиммунных реакций, вызываемых микобактериями. Пятый компонент — комплемент, активированный на поверхности микобактерии и способный опсонизировать возбудителей и облегчать их поглощение посредством макрофагального комплементного рецептора CR3 (интегрина МАС-1). Важной особенностью МБТ является высокая мутагенная активность под воздействием факторов окружающей среды (прием противотуберкулезных препаратов), ведущая к быстрому формированию изменчивости МБТ. Это связано с наличием генов многократно дублирующих ключевые ферментные системы МБТ, что ведет к быстрой смене путей метаболических процессов. Многообразная изменчивость МБТ может проявляться в следующих формах: морфологической, тинкториальной, культуральной и биологической. Морфологическая изменчивость характеризуется тем, что наряду с типичными МБТ в виде палочек в литературе описаны колбообразные, дифтероидные, кокковидные формы, ветвистые, нитевидные, мицелиеподобные и др., вплоть до ультрамелких фильтрующихся форм, проходящие через бактериальные фильтры и биологические мембраны. Иногда выделяют у больных, длительно принимающих противотуберкулезные препараты, измененные в процессе химиотерапии фильтрующие формы возбудителя, которые поддерживают длительно текущее хроническое туберкулезное воспаление. Изменчивость может быть тинкториальной, т.е. изменения возникают в отношении к красящим веществам, например, неокрашиваемость по методике Циль-Нильсена в связи с утратой кислото-и спиртоустойчивости. Культуральная изменчивость проявляется в изменении морфологи и цвета культур при росте на стандартных искусственных питательных средах. Биологическая изменчивость характеризуется изменением степени вирулентности как сторону повышения, так и в сторону понижения ее вплоть до полной утраты вирулентности, которая может быть и временной. Это свойство дало возможность французским ученым Кальмету и Герену изменить вирулентность МБТ и создать стабильную ослабленную, но живую вакцину, которая широко применяется для профилактики туберкулеза во многих странах. За последние годы наблюдается и усиленно изучается еще одно проявление трансформации МБТ – переход их в, так называемые L – формы, обозначенные по заглавной букве Института Листера (Англия), где они впервые обнаружены. Суть L – трансформации заключается в том, что микробы под влиянием различных неблагоприятных факторов, чаще при длительной химиотерапии, изменяют свои морфологические и биологические свойства. Вирулентность возбудителя, перешедшего в L – форму, резко снижается или даже может полностью исчезнуть. Подобные штаммы персистируют, «переживают» это время где-нибудь в лимфатических узлах или в очагах поражения больного. Наступает на длительный срок клиническое излечение больного. Однако, не исключено, что через тот или иной срок после прекращения лечения МБТ в L – форме могут возвращаться к прежнему состоянию, т.е. реверсировать в исходную вирулентную бактериальную форму и вызвать рецидив туберкулезного процесса. Одной из форм изменчивости МБТ является образование лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам, проявляется в приобретении способности микобактерий существовать и даже размножаться при значительном содержании в питательной среде или организме антибактериальных препаратов, которые губительно действуют на обычные МБТ. Возникновение и увеличение лекарственно-устойчивых штаммов возбудителя туберкулеза являются одним из важных условий эпидемиологического неблагополучия по заболеванию туберкулезом во многих странах мира в настоящее время. По вопросу приобретения лекарственной устойчивости существует две теории: – теория адаптации – как результат общебиологического закона приспособления живых существ к вредному влиянию окружающей среды в процессе воздействия; – теория селекции – отбора первично-устойчивых генетически заложенных мутантов МБТ в культуре, которые в процессе размножения накапливаются, а чувствительные погибают. Причины лекарственной устойчивости МБТ 1. биологические – недостаточная концентрация препарата в очаге туберкулезной инфекции, индивидуальные особенности организма пациента (быстрая скорость инактивации препаратов); 2. причины, обусловленные пациентом – контакт с больными резистентным туберкулезом, отсутствие приверженности к лечению (нерегулярный прием препаратов, неосознание важности лечения, преждевременное прекращение приема ПТП), неудовлетворительная переносимость препаратов, в том числе и сопутствующая патология, требующая приостановления (коррекция) противотуберкулезной терапии; 3. факторы, обусловленные течением заболевания – распространенный, быстропрогрессирующий деструктивный процесс; 4. факторы, обусловленные назначенным лечением – неадекватная схема лечения, лечение одним препаратом (монотерапия), недостаточная доза или длительность лечения, использование препаратов с перекрестной стойкостью, использование ПТП низкого качества, где доза препарата не соответствует заявленной. Возникновение лекарственной устойчивости у МБТ имеет значение в клинической практике, так как ПТП, к которым отмечена устойчивость или мало эффективны, или положительный лечебный эффект отсутствует полностью, что требует их замены с коррекцией схем лечения. |