Микра методичка. Методические указания к практическим занятиям по микробиологии с иммунологией и вирусологией для студентов
 Скачать 1.32 Mb.
|
|
Суперантигены — антигены микробов, взаимодействующие с МНС II класса антиген- презентирующих клеток (АПК) и Т-клеточным рецептором (TcR) Т-лимфоцитов, вне антигенсвязывающей щели, т.е. не в активных центрах. Суперантигены присоединяются как бы сбоку молекул МНС II и TcR. Они блокируют возможный специфичный иммунный ответ и вызывают поликлональную активацию лимфоцитов, выброс цитокинов и, затем, гибель Т-лимфоцитов с явлениями иммунодефицита. Суперантигенами являются: энтеротоксины стафилококков; токсин синдрома токсического шока; суперантигены стрептококков, вируса Эпстайна—Барр и др. Антитела - иммуноглобулины классов G, M ,A, D и Е, продуцируемые В- лимфоцитами (плазматическими клетками); состоят из мономеров, димеров, тримеров или пентамеров. Антитела – это гамма-глобулины, способные специфически соединяться с антигеном, под воздействием которого они образовались. Кроме того, антитела могут лизировать клетки, оказывать опсонизирующее действие, активировать систему комплемента, реализовывать аллергические реакции немедленного типа. Мономеры иммуноглобулинов состоят из двух тяжелых (Н-цепи) и двух легких (L-цепи) полипептидных цепей, связанных дисульфидной связью Эти цепи имеют константные (С) и вариабельные (V) участки. По типу тяжелой цепи различают 5 классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, {gA, IgD, IgE. Папапин расщепляет молекулу иммуноглобулина на два одинаковых антигенсвязывающих фрагмента— Fab (Fragment antigen binding) и Fc (Fragment сristallizable). Антиген-связывающий участок (активный центр антител) Fab-фрагмента иммуноглобулина, образован гипервариабельными участками Н- и L-цепей; он связывает эпитопы антигена. В активном центре имеются специфичные комплементарные участки к определенным антигенным эпитопам. Fc-фрагмент связывает комплемент (при образовании комплекса антиген-антитело), взаимодействует с мембранами клеток и участвует в переносе IgG через плаценту. Мономеры иммуноглобулинов имеют два активных центра, что позволяет им взаимодействовать одновременно с двумя антигенными детерминантами (полные антитела). Неполное антитело имеет лишь один активный цент. При первичном иммунном ответе вырабатываются тяжелые иммуноглобулины (IgM), при вторичном – легкие (IgG). При дисфункции иммунного ответа, что может зависеть от конституционных особенностей индивидуума и/или особенностей антигена (аллергена), продуцируется повышенное количество иммуноглобулинов класса Е, способствующих возникновению аллергических реакций немедленного (первого) типа . Кроме мономерной структуры IgA, присутствующих в сыворотке крови, вырабатываются секреторные sIgA, которые находятся на слизистой оболочке, в слюне, слезах, молозиве и г рудном молоке. Блокируя вирусы и бактерии. Димер имеет секреторный компонент, защищающий антитело от разрушения ферментами. Свойства антител Антитела, например IgG, вместе с другими опсонинами усиливают фагоцитоз, могут участвовать в активации комплемента (IgM, IgG), входят в состав рецепторов В-лимфоцитов (IgM, IgD), участвуют в реакциях антиген-антитело. Они отличаются по аффинности и авидности. Антигенные свойства антител Изотип антител (класс, подкласс иммуноглобулинов — IgM, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE) определяется С-доменами тяжелых цепей; выявляется с помощью антисыворотки против Fc- фрагментов тяжелых цепей в реакции радиальной иммунодиффузии (см. Реакция преципитации) и др. Идиотип антител определяется антигенсвязывающими центрами Fab-фрагментов антител, т. е. антигенными свойствами вариабельных участков (V-областей). Идиотип состоит из набора идиотопов — антигенных детерминант V-области антитела Аффинность (аффинитет) антител — сродство антител к антигенам. Авидность антител — прочность связи антитела с антигеном и количество связанного антигена антителами. Моноклональные антитела. Моноклональные антитела являются однородными и высокоспецифичными. Их продуцирует гибридома — популяция гибридной клетки, полученной слиянием антителообразующей клетки определенной специфичности с «бессмертной» опухолевой клеткой миеломы. Процессы, лежащие в основе механизма образования антител, а также взаимодействия с антителом in vivo и in vitro характеризуются высокой специфичностью. Это предопределило их широкое применение для диагностики инфекционных заболеваний, для определения групп крови, видовой специфичности белка, подбора 71 донора при трансплантации тканей и т.д. Для выявления специфических антител или идентификации антигена применяют следующие реакции антиген-антитело: Цель занятия: 1. Изучить развитие, становление, анатомию, клеточный состав и функционирование системы иммунитета. 2. Изучить специфические формы иммунного ответа: клеточный и гуморальный ответы, иммунологическая память, иммунологическая толерантность. 3. Иметь представление о роли гиперчувствительности и аутоиммунных реакций в возникновении иммунопатологических нарушений. 4. Выработать четкое преставление об антигенах и антителах, их роли в иммунном ответе. Учебно-целевые задачи: Знать: 1. Иммунная система организма человека и ее функции. Клетки иммунной системы: Т- и В-лимфоциты, макрофаги (А-клетки). Субпопуляции Т- и В-клеток. Клеточные маркеры. Клеточная кооперация. Цитокины. 2. Формы иммунного ответа: клеточный и гуморальный иммунный ответ, иммунологическая толерантность, иммунологическая память. 3. Иммунопатология. Гиперчувствительность. Аллергия немедленного и замедленного типа. Аутоиммунитет. 4. Антигены, их свойства, классификация. 5. Антитела, их свойства, механизм образования, первичный и вторичный иммунный ответ Биологическая роль различных классов иммуноглобулинов в противоинфекционной защите организма, в возникновении аллергии немедленного типа. Уметь: 1. Обосновать практические мероприятия, предпринимаемые при иммунологической диагностике, специфической профилактике и специфической терапии инфекционных и неинфекционных заболеваний. ОСНАЩЕНИЕ ЗАНЯТИЯ Таблицы и схемы по иммунологии КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Что такое система иммунитета, каково ее значение? Какие органы относят к центральным и периферическим? 2. Назовите основные классы и субклассы клеток иммунной системы. Каковы их основные функции и маркеры? 3. Назовите основные проявления клеточного и гуморального иммунитета. 4. Что такое иммунологическая память и иммунологическая толерантность? Какова их роль? 5. Что такое цитокины, какова их роль в иммунной системе? 6. Каков механизм межклеточной кооперации в реализации первичного иммунного ответа? Какие клетки при этом участвуют? 7. Что лежит в основе возникновения иммунопатологических реакций? Какова их роль в возникновении заболеваний? 8. Что такое гиперчувствительность немедленного и замедленного типов, каков механизм из развития? 9. Что такое аутоиммунитет, какова его роль в возникновении заболеваний? 10. Что такое антигены: (полноценные, неполноценные)? 11. Каково антигенное строение бактерий и вирусных частиц? Каково их практическое значение? 12. Что такое трансплантационные антигены? 13. Что такое аутоантигеы? В каких случаях они могут появляться и проявлять себя? 14. Что такое антитела (иммуноглобулины)? Какие бывают классы и виды антител? 15. Каково химическое строение антител. Где они образуются? 16. Что такое неполные антитела, как их обнаружить? 17. Что такое первичный и вторичный иммунный ответ, каковы их отличия? 72 18. Каковы принципиальные основы серодиагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний? 19. Какие методические приемы используются для выявления специфичности антигенов и антител? ЗАНЯТИЕ №14. Темы: Методы выявления и идентификации специфических антигенов и специфических антител. Реакции агглютинации, преципитации, их варианты. Иммунофлюоресцентный метод. Реакция нейтрализации. План занятия. 1. Реакция агглютинации: механизм, роль ингредиентов, варианты, методы постановки, практическое значение. 2. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакция обратной непрямой гемагглютинации ( РОНГА). 3. Метод выявления неполных антител (реакция Кумбса). 4. Реакция преципитации: механизм, ингредиенты, варианты постановки, разновидности (кольцепреципитация, преципитация в агаре, иммуноэлектрофорез, р. флокуляции). Практическое применение. 5. Иммунофлюоресцентный метод Кунса, прямой и непрямой варианты. Практическое использование. 6. Реакция нейтрализации токсина антитоксином. ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. В основе их лежат реакции специфического взаимодействия антигена с антителом. Поскольку антигены идентифицируют с применением антител иммунных сывороток, эти методы получили название серологических (от лат. «serum» - сыворотка). Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др. При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т.е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих антимикробные антитела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов. Для определения антител или антигенов применяют следующие реакции антиген—антитело: 1. реакция агглютинации; 2. реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации; 3. реакция коагглютинации; 4. реакция Кумбса; 5. реакция торможения гемагглютинации; 6. реакция преципитации; 7. реакция нейтрализации; 8. реакция связывания комплемента; 9. реакция радиального гемолиза; 10. реакция иммунного прилипания; 11. реакция иммунофлюоресценции; 12. иммуноферментный анализ; 13. радиоиммунный метод, или анализ; 14. иммуноблотинг; 15. иммунная электронная микроскопия. 73 В зависимости от диагностической чувствительности все эти реакции можно условно разделить на три уровня. К первому уровню (наименьшему) относятся реакции прямой агглютинации, преципитации, РСК. Ко второму – реакции непрямой агглютинации, нейтрализации токсина, иммунофлюоресценции. К третьему – ИФА, иммуноблотинг (разновидность ИФА) и РИА. В последние годы разработаны и постоянно совершенствуются еще более чувствительные методы, индикации специфического взаимодействия антиген-антитело с помощью лазерного луча и компъютерного анализа, основанные на изменении в этих условиях поляризационных свойств среды (метод биочипов). Реакция агглютинации Реакция агглютинации (от лат. agglutinatio — склеивание) — склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов. Реакция агглютинации проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул, «склеенных» антителами. В качестве антигена (корпускулярного!) в этой реакции выступают: бактериальные клетки, клетки крови, индифферентные нерастворимые частицы или клетки с адсорбированными на них антигенами. Реакцию агглютинации используют для: определения возбудителя, выделенного от больного; определения антител в сыворотке крови больного; определения групп крови. 1. Определение возбудителя, выделенного от больного. Ориентировочная реакция агглютинации на стекле. К капле диагностической агглютинирующей сыворотки (разведение 1:20) добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного. Образуется хлопьевидный осадок. Поскольку родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, это затрудняет их идентификацию. Поэтому из агглютинирующих сывороток удаляют групповые антитела путем адсорбции их родственными бактериями (р.Кастеллани). В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только для одного вида микроорганизмов. Полученные таким способом сыворотки называют монорецепторными адсорбированными диагностическими сыворотоками. 2. Определение антител в сыворотке крови больного Развернутая реакция агглютинации с сывороткой крови больного. К разведениям сыворотки больного добавляют диагностикум. — Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие 0-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. — Агглютинация с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н- антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее. Реакция ставится с разными разведениями исследуемой сыворотки для определения титра антител. Нарастание титра специфических антител в сыворотке больного говорит об инфекционном заболевании. Это реакции титрования иммунной сыворотки, р. Видаля для диагностики брюшного тифа, р. Райта для диагностики бруцеллеза и др. Реакция агглютинации для определения групп крови. Реакцию агглютинации для определения групп крови применяют для установления системы АВО (табл. б) с помощью агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки против антигенов групп крови А (II), В (III). Контролем служат: сыворотка, не содержащая антител, т.е. сыворотка АВ (IV) группы крови; антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А (II), В (III). Отрицательный контроль не содержит антигенов, т. е. используют эритроциты группы О (I). Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации. В РНГА выявляют антитела сыворотки крови больного с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами. Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови , что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде «пуговки». РПГА ставят в пластиковых планшетках или в пробирках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум. Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикум — эритроциты, на которых адсорбированы антитела. Например, можно обнаружить ботулинический токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непрямой гемагглютинации — РОНГА). Реакцию коагглютинацииприменяют для определения антигенов с помощью антительного диагностикума — антител, адсорбированных на белке А клеток стафилококка 74 Белок А имеет сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, поэтому такие бактерии, обработанные иммунной диагностической сывороткой, неспецифически адсорбируют антитела сыворотки. Антитела диагностикума взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба. Реакция торможения гемагглютинации. Гемагглютинины некоторых вирусов (миксовирусы) склеивают эритроциты. Это свойство используют в реакции гемагглютинации для индикации и титрования вирусов, что необходимо для последующей постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Она основана на блокаде, подавлении антигенов (гемагглютининов) вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных. Реакция коагглютинации. В реакции использовано свойство стафилококков, содержащих протеин А, неспецифически адсорбировать антимикробные антитела. При добавлении к таким диагностическим препаратам неизвестного микроорганизма может произойти коагглютинация, если адсорбированные антитела специфичны для данного микроорганизма. Непрямые (пассивные) реакции агглютинации. Эти реакции называются непрямыми (пассивными) т.к. при их проведении используют антигены (или антитела), искусственно адсорбированные на поверхности различных корпускулярных частиц. Реакция непрямой (пассивной) агглютинации основана на способности клеток (эритроцитов) или некоторых химических частиц (латекс) адсорбировать на своей поверхности антигены и гаптены бактерий, антигены вирусов, риккетсий. При этом носитель приобретает новую антигенную специфичность и вступает во взаимодействие с имунными сыворотками, специфичными для адсорбированного антигена. Можно адсорбировать на сенсибилизированных эритроцитах не только антигены, но и специфические антитела. Такие препараты называют антительными эритроцитарными диагностикумами. Постановка реакции агглютинации с таким диагностикумом называется обратной РНГА (или РОНГА). Антигенные и антительные эритроцитарные диагностикумы широко используются для постановки непрямой реакции гемагглютинации. РНГА обычно ставят на плексигласовых планшетках с лунками. Исследуемую сыворотку предварительно инактивируют при 56˚С в течение 30 минут для разрушения комплемента и разводят от 1:10 до 1:12 000 и более, разливают в лунки до 0,5 мл и добавляют по 0,1 мл эритроцитарного диагностикума. Реакцию выдерживают в течение двух часов в термостате и считают положительной, если осадок эритроцитов имеет форму "зонтика" с зубчатыми краями и покрывает почти все дно лунки. При отрицательном результате эритроциты оседают в центре дна лунки в виде компактного диска с ровными краями (см. демонстрацию). Непрямые варианты реакции агглютинации делают ее более чувствительным методом и расширяют возможности ее применения.Реакции этого типа широко применяются для диагностики инфекционных заболеваний (выявление специфических антител в сыворотке больного при брюшном тифе, туляремии, гриппе, риккетсиозах, хламидиозах), а также для определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления лекарственной аллергии, определения поствакцинального иммунитета при дифтерии и т.д. Реакция Кумбса - реакция агглютинациидля определения антирезусных антител (непрямая реакция Кумбса). У некоторых больных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными, одновалентными. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами (Rh+), но не вы- зывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого к резус-положительным эритроцитам с сорбированными на них неполными антителами добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобулинов человека получены путем иммунизации кролика человеческим гамма-глобулином). В случае положительного результата наблюдается феномен склеивания эритроцитов. Следовательно, р. Кумбса является разновидностью непрямой реакцией гемагглютинации. С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов, например, гемолитическую болезнь новорожденных: Эритроциты резус-положительного плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли 75 через плаценту от резус-отрицательной матери. Можно также выявлять неполные антитела против антигенных микробов (например, при бруцеллезе) Реакция преципитации (РП) - осаждение высокодисперсных антигенов (в коллоидном состоянии) - специфическими антителами (преципитинами) в присутствии электролита. Выпадение нерастворимого комплекса антиген-антитело в виде осадка наблюдается, если эти ингредиенты находятся в эквивалентных количествах. Антиген в р. преципитации должен быть прозрачным. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др. Р. преципитации ставят с целью выявления антигена по известной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела. Для приготовления коллоидных антигенов, участвующих в реакции преципитации, используют различные методы их экстракции из исследуемого материала: физические, химические и биологические. Бактериальный антиген может быть получен путем его экстрагирования из чистых культур бактерий, из патологического материала или из объектов внешней среды, обсемененных микробами (диагностика сибирской язвы, чумы, туляремии). В судебно-медицинской практике с помощью р. преципитации определяют видовую специфичность белка (крови, спермы), в санитарной практике - выявляют фальсификацию пищевых продуктов, в клинической иммунологии - уровень имунноглобулинов в сыворотке крови. Таким образом, знание этой реакции необходимо для врачей многих специальностей. При постановке РП разводят не сыворотку, а антиген. За титр преципитирущей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии со стандартной иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата. Р. кольцепреципитации - на слой антисыворотки наслаивают жидкость, содержащую растворимый антиген и через несколько секунд наблюдают образование кольца преципитата. Широкое распространение получила реакция термопреципитации (р.Асколи) на антиген возбудителя сибирской язвы, использующая антигены, экстрагированные кипячением из различного сельскохозяйственного сырья. Р. микропреципитации применяют для выявления низких титров антител. При ее постановке в исследуемую сыворотку крови вносят антиген в убывающей концентрации; при отсутствии антител разведение сыворотки крови антиген уменьшает ее оптическую плотность. Однако в присутствии минимальных количеств антител образуются микропреципитаты, повышающие оптическую плотность среды (учет результатов осуществляется нефелометрическим методом). Р. флокуляции – это РП в системах токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин. Проявляется появлением хлопьевидного осадка. Реакцию обычно применяют для определения активности антитоксических сывороток или анатоксина. РП в геле (иммунодиффузия) в различных модификациях: простая иммунодиффузия (по Уанье), встречная иммунодиффузия (по Оухтерлони), радиальная иммунодиффузия (по Манчини). Методы простой диффузии основаны на способности Аг, внесенного сверху в лунки и ли пробирки с агаром, диффундировать в гель. При постановке реакций двойной (встречной) диффузии Аг и Ат вносят в отдельные лунки. Обычно методы используют для выявления белковых Аг в различных жидкостях и тканевых экстрактах. Вариантом простой одномерной иммунодиффузии является тест Илека для выявления токсинообразования у возбудителя дифтерии. Иммуноэлектрофорез. Метод объединяет РП в геле с элетрофорезом. Для этого слой агара наносят на предметное стекло; на его разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую их канавку. В лунки вносят смесь Аг и проводят электрофорез в течение 1-2 часов. Различные Аг с разной скоростью перемещаются между катодом («старт») и анодом («финиш»). Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и, в случае положительного результата, в геле образуются зоны преципитации. Иммунофлюоресцентный метод основан на соединении антигенов со специфическими антителами, меченными флюорохромными красителями, благодаря чему с помощью люминесцентного микроскопа эти антигены (связанные с антителами) выявляются в виде светящихся изображений на несветящемся фоне препарата. 76 Основная сложность метода заключается в изготовлении люминесцирующих (флюорохромных) сывороток. Для этого из исходной иммунной сыворотки выделяют и концентрируют глобулиновую фракцию (антитела), которая соединяется с флюорохромом (например, изотиоцианатом или другим хроматографически чистым красителелем). При проведении исследований применяют прямой и непрямой методы иммунофлюоресценции: При прямом методе готовят препарат, содержащий исследуемые антигены (мазок из патологического материала, крови, отпечаток или срез различных органов и тканей, и др. материалы, содержащие микроорганизмы), фиксируют его жидким фиксатором и обрабатывают специфическим люминесцирующим иммуноглобулином. После инкубации отмытый от избытка иммуноглобулина и высушенный препарат рассматривают в люминесцентный микроскоп, возбуждая свечение ультрафиолетовым светом. Светящиеся изображения антигенов будут наблюдаться только при соответствии их взятому меченому иммунноглобулину. Прямой метод технически прост и высокоспецифичен, но требует большого набора различных люминесцирующих иммуноглобулинов (на каждый антиген - отдельная специфическая сыворотка). При непрямом методе препарат, приготовленный таким же образом, обрабатывают обычной (несветящейся) специфической сывороткой (полученной путем иммунизации кролика), промывают буферным раствором и затем заливают люминесцирующую антиглобулиновую сыворотку (содержащую антитела против глобулинов кролика) и снова промывают. При микроскопии видны светящиеся изображения антигена, если он соответствует взятой иммунной сыворотке, так как в этом случае к образовавшемуся комплексу антиген + антитело присоединяется люминесцирующая антиглобулиновая сыворотка. Следовательно, при непрямом методе иммунная сыворотка (в нашем случае кроличья) служит антителом для исследуемого антигена и, в свою очередь, является антигеном для соответствующей антиглобулиновой люминесцирующей сыворотки (содержащую антитела против иммуноглобулинов кролика, меченные флюорохромом). С помощью непрямого метода можно определять также наличие антител в сыворотках. В практической микробиологии и вирусологии ИФ-метод является методом экспресс-диагностики многих инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы. Метод нейтрализации токсина антитоксином. Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией. Реакция нейтрализации является биологическим методом, так как проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген—антитело. Таким методом можно определит: а) наличие противодифтерийных антитоксических антител в сыворотке пациентов; б) наличие токсина в исследуемом материале при ботулинистическом пищевом отравлении. Цель занятия: 1. Изучить механизмы взаимодействия антиген-антитело: принципы и методы постановки реакций агглютинации, преципитации и иммунофлюоресценции. 2. Уметь интерпретировать результаты серологических исследований. Учебно-целевые задачи: Знать: 1. Реакции антиген-антитело: реакции прямой (ориентировочную и развернутую) и непрямой агглютинации (РНГА, РОНГА, р. Кумбса). 2. Реакции преципитации: кольцепреципитации , р.Асколи, микропреципитации, р. флокуляции, р. Манчини. 3. Р.иммобилизации, р.нейтрализации токсина, р.прямой и непрямой иммунофлуоресценции. Уметь: 1. Учесть и оценить результаты серологических реакций. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. 1. Постановка реакции агглюцинации на предметном стекле для идентификации неизвестной культуры микробов по антигенным свойствам. Необходимо иметь: диагностическую агглютинирующую сыворотку, испы- тываемую культуру на МПА, физиологический раствор. 77 На одну половину предметного стекла нанести каплю диагностической сыворотки в разведении 1/10, на другую - каплю физиологического раствора (контроль). Петлей взять исследуемую культуру с МПА и внести ее сначала в каплю с физиологическим раствором, потом в каплю с иммунной сывороткой. Покачивая стекло, равномерно распределить ингредиенты реакции. Склеивание происходит в течение первых минут наблюдения, когда при покачивании стекла в мутной капле образуются хлопья (зернышки), которые укрупняясь, перемещаются к периферии. В контрольной капле остается равномерная муть. 2. Поставить развернутую реакцию агглютинации в пробирках с целью установления титра агглютинирующей сыворотки. Необходимо иметь: агглютинирующую сыворотку для титрования. взвесь убитых микробов (диагностикум), специфичный для данной сыворотки. физиологический раствор. Титрование диагностигностической агглютинирующей сыворотки №№ пробирок 1 2 3 4 5 6 Разведение сыворотки 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 К Ингредиенты реакции 1. Физ. раствор (в мл) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 2. Аггл. сыворотка в разведении 1:500 (в мл) 1,0 1,0 —> (1,0) 1,0 —> (1,0) 1,0 —> (1,0) 1,0 —> (1,0) 3. Диагностикум (в каплях) 2 2 2 2 2 2 Учет результата Агглютинирующую сыворотку добавляют в первую пробирку и затем переливают 1 мл разведенной сыворотки во 2 пробирку, затем из 2 в третью и т.д. Из 5 пробирки удаляют 1 мл смеси (в дез.р-р) для сохранения определенного объема. Штатив с пробирками помещаем в термостат на 2 часа, после чего учитываем предварительный результат. Окончательный результат учитывается через 24 часа, после пребывания реакции при комнатной температуре. При отсутствии агглютинации жидкость остается равномерно мутная, при полной агглютинации образуются хлопья агглютината в прозрачной жидкости. За титр агглютинирующей сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором происходит агглютинация 3. Постановка реакции кольцепреципитации с целью определения видовой специфичности белка крови. Необходимо иметь: ткань с кровяным пятном, преципитирующие сыворотки к белку человека, курицы, свиньи и др., физиологический раствор. а) приготовление преципитиногена для постановки реакции путем экстрагирования белка крови из кровяного пятна с помощью физраствора. Фильтруем антиген через бумажные фильтры. б) техника постановки реакции кольцепреципитации: в узкие пробирки (диаметром 0,5см) вносит 0,2-0,3 мл преципитируемой сыворотки. Затем тонкой пастеровской пипеткой по стеклу, осторожно, держа пробирку в наклоненном положении, наслаиваем 0,2 мл раствора антигена. Пробирку переводим в вертикальное положение. Учет реакции производят через 1-2 минуты. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым материалом появляется преципитат в виде белого кольца. В контроле (норм. сыворотка + антиген) преципитата нет. 4. Постановка реакции преципитации в геле, поставленной с целью определения токсигенности дифтерийных культур (р. Илека). На чашку Петри с питательной средой помещают полоску фильтрованной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. На расстоянии 0,6-0,8 см от края полоски засевают методом бляшек исследуемые культуры дифтерийной палочки. Чашки инкубируют при 37°С в течение суток. В качестве 78 контроля используют заведомо токсигенную культуру При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуется линия преципитации в виде дуги. ДЕМОНСТРАЦИИ: 1. Развѐрнутая реакция агглютинации в пробирках. ―О‖ и ―Н‖-агглютинация. 2. РНГА на планшетках. 3. Реакция преципитации в геле, поставленная с целью определения токсигенности дифтерийных культур. 4. Реакция преципитации в геле, поставленная с целью определения иммуноглобулинов в сыворотке крови (р. Манчини). 5. Наборы диагностикумов, антигенов, иммунных сывороток, флюоресцерующих 6. гаммаглобулинов. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА: 1. Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с целью изучения антигенных свойств культуры микробов. 2. Поставить развѐрнутую реакцию агглютинации в пробирках для определения титра агглютинирующей сыворотки. 3. Приготовить антиген для реакции преципитации и поставить реакцию кольцепре ципитации для определения видовой специфичности белка крови, учесть результат, сделать заключение. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Реакции иммунитета: две фазы реакции, характеристика. 2. Реакция агглютинации: участники реакции, их характеристика, методы постановки реакции, практическое применение реакции агглютинации. 3. Какие модификации позволяют повысить чувствительность реакции агглютинации? 4. Что такое диагностикум, для чего он применяется? Как приготовить О- Н- и Vi-диагностикумы и антительный диагностикум? 5. В чем заключается методика постановки реакции агглютинации на предметном стекле и развернутой реакции в пробирках? 6. Что такое коагглютинация, когда она применяется? 7. Как ставится реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации, ее сущность, постановки, методика постановки, практическое применение. 8. Реакция Кумбса для выявления неполных антител, ее сущность. 9. Реакция преципитации: ингредиенты, их характеристика, механизм, методы поста 1. новки, практическое использование. 10. Техника постановки реакции кольцепреципитации. В каких случаях она применяется? 11. Сущность реакции преципитации в агаре. В чем преимущество преципитации в агаре по сравнению с кольцепреципитацией ? 12. Понятие об иммуноэлектрофорезе. сущность, применение. 13. Метод иммунофлюоресценции. Прямой и непрямой методы ИФ. Сущность. Практическое использование. 14. В чем заключается серологический метод иммобилизации? В каких случаях он применяется? 15. Реакция нейтрализации токсина антитоксином. Сущность. Практическое использование. ЗАНЯТИЕ №15. Темы: Реакции с участием комплемента реакции иммунного лизиса; реакция связывания комплемента. Реакции с использованием меченых антител или антигенов: иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ. Кожные пробы (аллергические и иммунобиологические). План занятия: 1. Реакция иммунного лизиса: ингредиенты, механизм реакции; разновидности реакции лизиса. 2. Реакция иммунного гемолиза. Практическое значение. 79 3. Реакция связывания комплемента (РСК). Ингредиенты. Особенности постановки и учета реакции. Практическое значение. 4. Реакции с использованием меченых антител или антигенов: иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунный анализ (РИА). Особенности постановки. Практическое значение. 5. Кожные пробы. Классификация. Практическое применение. ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ: Одним из важнейших свойств иммунной сыворотки является ее способность лизировать (растворять) чужие клетки. Сущность этой реакции состоит в том, что при взаимодействии специфических антител с антигенами клеток (эритроцитов, бактерий, лимфоцитов и др.), на их поверхности образуется комплекс, который активирует комплемент по классическому пути, вследствие чего наступает лизис этих клеток. В зависимости от характера корпускулярного антигена различают бактериолизис, спирохетолизис, гемолизис (гемолиз), лимфоцитолизис и др. формы лизиса. Реакции иммунного лизиса активно идут во время инфекционного заболевания (т.е. в живых организмах, где активно работают все белки системы комплемента. В этом их огромный защитный эффект. Вне живого организма (in vitro) многие бактерии устойчивы к литическому действию комплемента, поэтому реакция бактериолизиса для диагностических целей применяется редко. Однако реакция лизиса используется при типировании (выявлении) антигенов гистосовместимости (у человека ситема HLA) на лимфоцитах. К типируемым лимфоцитам добавляют антисыворотки против различных HLA-антигенов, затем их лтмывают и добавляют комплемент. Если соответствующий антиген есть, то наступает лизис лимфоцитов и мертвые клетки, в отличие от живых, окрашиваются трипановым синим. В лабораторной практике широко применяется явление гемолиза - в качестве индикаторной системы в реакции связывания комплемента (РСК). РСК ставят как для обнаружения в исследуемой сыворотке антител, так и для выявления антигенов в исследуемом материале. В опытной системе образование комплексов антиген- антитело и фиксация к ним комплемента не сопровождается видимыми изменениями, если антиген не является клеткой. Поэтому для обнаружения связывания комплемента используют индикаторную систему, состоящую из эритроцитов барана, обработанных антителами-гемолизинами. Лизис эритроцитов может наступить только в присутствии свободного комплемента (сыворотка морской свинки), а это возможно лишь в том случае, если в опытной системе комплекс антиген-антитело не формируется (РСК отрицательна, есть гемолиз). РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Ее широко используют для диагностики многих инфекционных заболеваний: сифилиса (р.Вассермана), риккетсиозов (сыпной тиф, лихорадка Ку), вирусных заболеваний (грипп, корь, парагрипп и др.). Р. радиального гемолиза в геле. Реакция радиального гемолиза в геле – это вариант р. гемолиза и РСК в геле. Эту реакцию ставят в лунках геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемент. После внесения в лунки геля гемолитической сыворотки вокруг них, в результате радиальной диффузии антител, образуется зона гемолиза. Таким образом, можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки. Если в гель добавить эритроциты, на которых адсорбированы антигены различных возбудителей (вирусов гриппа, краснухи и т.д.), а в лунки вносить сыворотки больных, то антитела сыворотки взаимодействуют с вирусными антигенами на эритроцитах, после чего к этому комплексу присоединяется комплемент и наступает гемолиз в агаре. Р. локального гемолиза в геле, предложена Н.Йерне (1963 г.) - применяют для подсчета клеток- антителопродуцентов. Клетки, продуцирующие антитела (например, плазмоциты селезенки, после иммунизации животного эритроцитами барана), вносят вместе с эритроцитами барана в гель (агар). Затем в реакционную систему вносят комплемент (наслаивая его на агар) и наблюдают образование зон гемолиза вокруг каждой клетки, образующей антитела к эритроцитам барана. Метод получил распространение во многих областях экспериментальной иммунологии, т.к. дает возможность оценить образование антител на уровне отдельных тканей и клеточных популяций иммунной системы после различных воздействий. Реакции с применением меченых антител и антигенов - составляют основу современных методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, благодаря высокой чувствительности этих методов, позволяющих определять минимальные количества антигенов (антител) в исследуемом материале (нанограммы). Иммуноферментный метод (анализ) – ИФА – выявление антигенов (или антител) с помощью соответствующих им антител (антигенов), конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой, β- галактозидазой или щелочной фосфатазой). 80 Наиболее распространен твердофазный ИФА, когда один из компонентов иммунной реакции (антигены или антитела) сорбирован на твердом носителе, например, в лунках полистироловой планшеты. Ддя выявления антител известный антиген адсорбируют в лунках планшеты, затем вносят исследуемую сыворотку, в которой хотят обнаружить антитетла к данному антигену. После инкубации лунки промывают дляудаления несвязавшихся белков и вносят в них антииммуноглобулиновые антитела, мечяенные ферментом (обычно пероксидазой). После инкубации и отмывания в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат (перекись водорода) и хромоген (орто-фенилдиамин) для регистрации конечных продуктов расщепления субстрата. По изменению цвета и интенсивности окраски раствора судят о наличии и колическтве антител. Если необходимо определить в исследуемом материале антиген, тогда в лунку с сорбированными антителами вносят исследуемый материал, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченую ферментом, и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Измерение количества продуктов реакции ИФА проводится в автоматизированном варианте в приборах-ридерах с помощью спектрофотометра или автоматических ридерах, измеряя оптическую плотность растворов в лунках при определенной длине волны. К настоящему времени созданы многочисленные модификации базовой методики ИФА: конкурентные методы ИФА, сэндвич-ИФА (метод двойных антител для определения антигена) и др. Для постановки ИФА выпускаются специальные тест-системы с набором всех необходимых ингредиентов. Методы ИФА обладают высокой чувствительностью и специфичностью и получили широкое распространение в различных областях биологии и медицины. ИФА используется для определения антигенов или антител при различных бактериальных, вирусных и протозойных инфекциях, в частности, при диагностике ВИЧ-инфекции. ИФА применяется также для определения концентрации лекарственных препаратов, гормонов, цитокинов в организме, присутствия в нем раковых клеток, гельминтов. Иммуноблотинг -(от англ. ―blot‖ – пятно) – метод идентификации антигенов (или антител) с помощью известных сывороток (или антигенов). Представляет собой сочетание гель-электрофореза с ИФА. Первоначально методом электрофореза выделяют все антигены вируса и получают коммерческий реагент на специальной нитроцеллюлозной пленке. При постановке иммуноблотинга на пленку с известными антигенами наносится исследуемая сыворотка пациента. После инкубации и отмывания несвязавшихся антител, приступают к ИФА – на пленку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов антиген-антитело, на носителе появляются окрашенные пятна. Метод иммуноблотинга позволяет обнаружить антитела одновременно на все антигены возбудителя. Поэтому его проводят часто для подтверждения предполагаемого диагноза (например, при ВИЧ инфекции), выставленного на основании положительной реакции обычной ИФА (т.е. с каким-либо одним антигеном), что позволяет избежать диагностических ошибок из-за случайных совпадений. Радиоиммунный анализ (РИА). Принцип радиоиммунного анализа (РИА) основан на выявлении комплекса АГ-АТ, в котором один из иммунореагентов был мечен радиоактивным изотопом. Обычно используют изотопы йода ( 125 J или 131 J). Учет реакции проводят с помощью специальных счетчиков или -излучения. Метод высокочувствителен, но постепенно вытесняется иммуноферментным анализом, учитывая небезопаснось работы с радиоактивными изотопами и необходимость в сложном регистрирующем оборудовании. Кожные пробы Для определения гиперчувствительности (аллергии) к антигенам-аллергенам у людей проводят провокационные тесты. Суть их в том, что соответствующий аллерген вводят в организм, чаще всего внутрикожно или накожно. Иногда сублингвально, ингаляционно или в конъюнктиву глаза. Обычно, спустя 30 минут оценивают немедленные аллергические реакции, через 24-48 часов – замедленные. На пыльцевые, пищевые, лекарственные аллергены чаще наблюдаются немедленные кожные (сублингвальные, конъюнктивальные) реакции в виде покраснения и припухлости. С помощью этих реакций можно установить природу аллергена, вызвавшего аллергическое заболевание. Поскольку геторологичные сывороточные белки при повторном введении могут стать причиной развития анафилактического шока, в основе которого также лежит аллергия немедленного типа, перед введением такого рода иммунных препаратов для выявления аллергии, а вместе с тем для временной десенсибилизации, ставится кожная проба с соответствующим аллергеном. Реакции замедленной гиперчувствительности развиваются обычно на бактериальные антигены. Поскольку это является результатом инфицированности организма, такого рода кожные реакции можно использовать как один из методов диагностики инфекционных заболеваний (туберкулез, туляремия, бруцеллез и др.) и оценки эффективности вакцинации живой противотуберкулезной вакциной. Во всех этих случаях в качестве аллергена используется вытяжка из соответствующих микробов (туберкулин, тулярин, бруцеллин и т.д.). Например, для 81 выявления сенсибилизации к микобактериям туберкулеза, чаще всего ставится кожно-аллергическая проба Манту когда туберкулин PPD вводится внутрикожно. Для оценки иммунитета против дифтерии используют кожную иммунобиологическую пробу Шика, а для скарлатины – Дика. В этих пробах используют экзотоксины соответствующих микробов. Реакции основаны на нейтрализации токсина антитоксинами in vivo. При наличии у испытуемого антител, они нейтрализуют токсин в коже, поэтому гиперемии не будет (реакция отрицательна). Наоборот, при отсутствии антител, экзотоксин вызывает гиперемию (реакция положительна). Цель занятия. 1. Изучить принципы и методы постановки реакций лизиса, РСК и твердофазных реакций ИФА, иммуноблотинга и РИА. 2. Изучить принципы и методы постановки кожно-аллергических и кожных иммунобиологических проб и механизм их развития. 3. Уметь интерпретировать результаты серологических исследований и кожных проб. Учебно-целевые задачи: Знать: 1. Диагностические реакции антиген-антитело: РСК, ИФА, РИА, иммуноблотинг. 2. Кожно-аллергические реакции для выявления гиперчувствительности немедленного и замедленного типа, кожные иммунобиологичекие реакции для определения антитоксического иммунитета. Уметь: 1. Оценить результаты постановки РСК, ИФА, кожно-аллергических и иммуно-биологических кожных реакций. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ Р. титрования гемолитической сыворотки. Гемолитическая сыворотка, полученная путем иммунизации кролика эритроцитами барана, перед титрованием разводится (см. схему разведения гемолитической сыворотки). Для постановки опыта титрования гемолитической сыворотки 0,5 мл каждого разведения сыворотки необходимо соединить с 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана (антиген) и 0,5 мл комплемента (свежая сыворотка морской свинки в разведении 1:10). Реакция идет в термостате при 37°С в течение 40-60 мин (см. схему титрования гемолитической сыворотки). Титром гемолитической сыворотки называется то наибольшее ее разведение, которое в количестве 0,5 мл в присутствии 0,5 мл комплемента, разведенного 1:10, растворяет 0,5 мл 3 % взвеси эритроцитов барана в течение 1 часа пребывания в термостате при 37°С. Титр гемолитической сыворотки должен быть не ниже 1:1200. Титрование комплемента (см. схему) необходимо для определения титра и рабочей дозы комплемента. Для титрования комплемента используется р. гемолиза. Донорами комплемента являются морские свинки, сыворотка которых разводится 1:5 и используется для установления титра комплемента (разведения от 1:10 до 1:40), к которому добавляется гемолитическая система. Гемолитическая система состоит из прогретой гемолитической сыворотки взятой в тройном титре (антитело) и 3 % взвеси эритроцитов (антиген), взятых в равных соотношениях. Реакция ставится в термостат на 40 мин при t 37°С. Учет реакции проводится по наличию или отсутствию гемолиза (лаковой крови). Титром комплемента называется его минимальное количество (максимальное разведение), при котором еще происходит гемолиз. Для постановки РСК комплемент берут в рабочей дозе - титр увеличенный на 20-25%. Постановка основного опыта реакции связывания комплемента (см. схему №4). Постановке реакции предшествует подготовка всех ингредиентов, так как для постановки РСК они берутся в строго определенных соотношениях. В качестве антигена используются растворенные антигены бактерий, риккетсий, антигены вирусов, грибов и др. Антигены могут обладать антикомплементарнымдействием (т.е. способностью инактивировать комплемент), поэтому антиген титруется перед постановкой РСК с помощью реакции гемолиза. Титром антигена считается наибольшая доза его, которая не проявляет антикомплементарного действия, т.е. при которой прекращается задержка гемолиза. Для РСК используют рабочую дозу антигена, которая равна 1/2 его титра. 82 Исследуемая сыворотка (антитело) инактивируется при 56°С в течение 30 мин. для уничтожения в ней собственного комплемента. Комплемент титруется и определяется его рабочая доза (см. выше). Эритроциты барана и гемолитическая сыворотка смешиваются в равных объемах (гемолитическая система), при этом инактивированная гемолитическая сыворотка берется в тройном титре. Подготовленные ингредиенты реакции делят на две системы: тест-систему (антиген, антитело, комплемент) и индикаторную систему (гемолитическая система). Сначала реакцию ставят в тест-системе (см. схему опыта) и инкубируют ее в термостате t=37°С в течение 45 мин, затем в реакцию вводят индикаторную систему. Если в исследуемой сыворотке содержатся специфические антитела на известный антиген, то образуется комплекс антиген-антитело, на котором адсорбируется комплемент, и гемолиза не произойдет (реакция по- ложительная, гемолитическая система остается мутной). Если в сыворотке нет специфических антител, комплекс антиген-антитело не образуется, комплемент останется свободным после первой фазы реакции и адсорбируется комплексом эритроциты-гемолизины, в результате наступит растворение эритроцитов - гемолиз (реакция РСК отрицательная). ДЕМОНСТРАЦИИ: 1. Реакция иммунного гемолиза: титрования гемолитической сыворотки 2.Титрования комплемента, определение рабочей дозы комплемента 3. Гемолитическая система 4. РСК (основной опыт). Положительный и отрицательный результат 5. Препараты: комплемент, гемолитическая сыворотка, антигены для постановки РСК 6. Тест-системы для постановки ИФА 7. Тест-системы для постановки иммуноблотинга 8. Таблицы, схемы, рисунки. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА: 1. Постановка основного опыта РСК с исследуемыми сыворотками (первая и вторая фазы реакции). 2. Учѐт результатов РСК, схему и результаты РСК записать в тетрадь Схема № 1. Разведение гемолитической сыворотки №№ пробирок ингредиенты 1 2 3 4 5 6 7 гемолитическая сыворотка в разведении 1:100 ( мл) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 физ.раствор (мл) 0,9 1,1 1,4 1,7 1,9 2,4 2,9 полученное разведение сыворотки __1__ 1000 __1__ 1200 __1__ 1500 1__ 1800 1__ 2000 1__ 2500 1__ 3000 83 Схема № 2. Титрование гемолитической сыворотки №№ пробирок гемолитическая сыворотка (мл) из соответствующего разведения 3% взвесь эритроцитов комплемент в разведении 1:10 (мл) физ. раствор (мл) возможный результат 1 0,5 1/1000 0,5 0,5 1,0 полный гемолиз 2 0,5 1/1200 0,5 0,5 1,0 полный гемолиз 3 0,5 1/1500 0,5 0,5 1,0 полный гемолиз 4 0,5 1/1800 0,5 0,5 1,0 неполный гемолиз 5 0,5 1/2000 0,5 0,5 1,0 нет гемолиза 6 0,5 1/2500 0,5 0,5 1,0 нет гемолиза 7 0,5 1/3000 0,5 0,5 1,0 нет гемолиза 8 контроль 0,5 0,5 1,5 нет гемолиза В термостат 37°С на 40 мин Схема № 3. Титрование комплемента №№ пробирок ингредиенты 1 2 3 4 5 6 7 8 комплемент в разв. 1:5 0,3 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 - изотонический раствор 0,3 0,4 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,2 количество смеси, удаляемой из проб 0,4 0,4 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - получаемые разведения комплемента 1:10 1:15 1:20 1:25 1:30 1:35 1:40 - гемолитическая система 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 В термостат 37°С на 30 мин 84 Схема № 4. Основной опыт реакции связывания комплемента о к к №№ пробирок ингредиенты (в мл) 1 2 3 4 5 6 7 исследуемая сыворотка в разв. 1:5 0,2 - - 0,2 - - - положительная сыворотка (контроль) - 0,2 - - - - - отрицательная сыворотка (контроль) - - 0,2 - - - - антиген 0,2 0,2 0,2 - 0,2 - - изотонич.р-р хлорида натрия - - - 0,2 0,2 0,4 0,6 комплемент в рабочей дозе 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 - Инкубация на холоде при 0-4°С в течение 18-24 ч или при 37°С в течение 30 мин гемолитическая система 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 Инкубация при 37°С в течение 30 мин результат КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ: 1. Реакции иммунного лизиса, разновидности, механизм. 2. Комплемент, его компоненты. Участие в иммунологических реакциях. Активация комплемента по классическому типу. 3. Реакции бактериолиза, их биологическая роль, практическое значение. 4. Реакция иммунного гемолиза. Практическое значение. 5. Реакция связывания комплемента (РСК: системы, участвующие в реакции ингредиенты . Механизм РСК. 6. Подготовка всех ингредиентов .для РСК: а) титрование комплемента и установление его рабочей дозы; б) титрование гемолитической сыворотки, в) приготовление гемолитической системы, г) инактивация исследуемой сыворотки, д) титрование антигена. 7. Схема постановки основного опыта РСК. Положительный и отрицательный результат РСК. Практическое применение РСК. 8. Каков принцип постановки твердофазных диагностических иммунологических реакций? 9. Как поставить и учесть результаты ИФА и РИА? 10. Что такое иммуноблотинг, в каких случаях проводится это исследование? 11. Как определить природу аллергена, вызвавшего аллергические заболевание, в основе которого лежит гиперчувствительности немедленного типа? 12. Каков механизм инфекционной аллергии, в основе которой лежит гиперчувствительности замедленного типа? 13. Как можно выявить инфекционную аллергию и с какой целью проводят ее определение? 14. В каких случаях проводят кожные иммунобиологические реакции (Дика и Шика), о чем свидетельствуют положительные реакции в этих случаях, каков их механизм? ЗАНЯТИЕ №16. |